使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，該方法包括農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)制備，農(nóng)桿菌注射方法，注射后的GUS組織染色檢測(cè)。將農(nóng)桿菌菌液注射的方法進(jìn)一步細(xì)化，注射時(shí)期按照草莓發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行細(xì)分，優(yōu)化草莓果實(shí)注射過(guò)程中的各種因素和參數(shù)，找出影響草莓果實(shí)注射的原因，從多方面解決草莓果實(shí)注射轉(zhuǎn)化法中存在的問(wèn)題。建立高效、快速、穩(wěn)定的草莓果實(shí)注射方法體系。
【專利說(shuō)明】使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于草莓的瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和瞬時(shí)基因表達(dá)分析領(lǐng)域，尤其涉及一種使用 農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 草莓)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物。由于草莓的雜合性和 多倍性，種間或種內(nèi)雜交通常難以獲得雜種，常規(guī)育種工作量大、效率低。隨著基因工程和 生物技術(shù)的飛速發(fā)展，可以利用轉(zhuǎn)基因的方法來(lái)有效改良草莓品種，縮短育種周期，提高育 種效率。草莓轉(zhuǎn)基因發(fā)展非常迅猛，在基因測(cè)序和克隆方面，國(guó)內(nèi)近幾年研究了與草莓相關(guān) 的50多種基因，有些已經(jīng)轉(zhuǎn)到草莓體內(nèi)并得到表達(dá)。
[0003] 通過(guò)近幾年草莓基因工程的發(fā)展，已在草莓中分離得到了許多與果實(shí)的形成發(fā)育 以及成熟生理代謝等相關(guān)的重要功能基因，對(duì)這些基因的功能進(jìn)行鑒定是非常重要的研究 目標(biāo)之一。而基因的功能驗(yàn)證的一個(gè)重要途徑就是通過(guò)轉(zhuǎn)基因操作來(lái)進(jìn)行。草莓轉(zhuǎn)基因 研究在園藝作物中開(kāi)展較早，早在80年代就已經(jīng)成功獲得了草莓轉(zhuǎn)基因的植株。其中根 癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法是草莓遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的方法。但如果采用常規(guī)葉盤轉(zhuǎn)化 法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因來(lái)研究基因的功能就需得到轉(zhuǎn)基因植株，并在其開(kāi)花結(jié)果后才能觀察分析， 而草莓轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)周期長(zhǎng)，一般從開(kāi)始轉(zhuǎn)基因到獲得轉(zhuǎn)基因植株，到植株開(kāi)花結(jié)果需要1-2 年的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于研究一些功能尚未明確的基因來(lái)說(shuō)時(shí)間周期過(guò)長(zhǎng)，所需人力也很 大。此外穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化也不適于研究一個(gè)家族大批量的基因功能，一般研究的基因數(shù)量比 較小，因此需要尋求一種新的，快速的方法來(lái)研究與果實(shí)的形成發(fā)育以及成熟生理代謝等 相關(guān)的重要基因的功能。
[0004] 果實(shí)注射法是近年來(lái)以園藝作物果實(shí)為轉(zhuǎn)化材料發(fā)展起來(lái)的一種對(duì)目的基因進(jìn) 行轉(zhuǎn)化從而鑒定其功能的新方法，該方法操作簡(jiǎn)便，周期短。一般注射后一周左右便可以 可直接觀察轉(zhuǎn)化后果實(shí)的形態(tài)以及生理等方面的變化，也可以對(duì)果實(shí)進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān) 的檢測(cè)研究來(lái)確定基因功能，從而研究導(dǎo)入基因的功能與作用。最初的果實(shí)注射法以注射 某些藥物來(lái)觀察果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育狀況，2001年國(guó)外科學(xué)家首次利用該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化梨、蘋 果、番茄、桃、草莓果實(shí)細(xì)胞的研究。2008年有報(bào)道利用果實(shí)注射法研究了基因在草莓果實(shí) 中的功能。而且這些注射法多采用的是離體果實(shí)注射，這樣就不能完全反應(yīng)果實(shí)的生長(zhǎng)以 及發(fā)育過(guò)程的變化狀況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速，便捷的使用農(nóng)桿菌 注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0007] -種使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，該方法包括如下步驟： 1)將攜帶包含GUS基因的pCAMBIA2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液在固體培養(yǎng)基上劃線后 挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中于28°C搖菌培養(yǎng)至菌液濃度為0. 8?2. 4,將菌液離心后倒去 上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定菌液濃度 在0. 8?2. 4,將重懸后的菌液放于冰箱備用； 2) 用無(wú)菌注射器注射農(nóng)桿菌懸浮液至果實(shí)中； 3) 摘取注射后第三天至第七天之間的果實(shí)，切成薄片，放入GUS染色液中，進(jìn)行染色鑒 定，染色過(guò)夜后用體積濃度70%酒精去除葉綠素后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率； 4) 摘取注射后第三天至第七天之間的果實(shí)，提取果實(shí)RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光 定量PCR，檢測(cè)基因表達(dá)量。
[0008] 所述步驟1)中農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105、AGLO和GV3101中的任意一種，優(yōu)選 AGLO。
[0009] 所述步驟1)中固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基+卡那霉素50mg /L+利福平IOOmg/ L，液體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基+卡那霉素50mg /L+利福平IOOmg/ L。
[0010] 所述步驟1)中菌液濃度為〇. 8?2. 4,菌液濃度在0. 8?1. 2時(shí)轉(zhuǎn)化效率都比較 高，菌液濃度高于1. 2,不僅轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降，而且注射后會(huì)導(dǎo)致果實(shí)腐爛壞死。
[0011] 所述步驟2)中果實(shí)為草莓品種"紅顏"每年3 -5月不同成熟期的果實(shí)，此時(shí)按照 不同的發(fā)育時(shí)期分為七個(gè)不同的時(shí)期，第一個(gè)時(shí)期為種子剛剛完全形成，并且密集的分別 在草莓果實(shí)周圍，花托并不能看清楚；第二個(gè)時(shí)期為花托可以清晰的看見(jiàn)但是果實(shí)還是很 ??；第三個(gè)時(shí)期為果實(shí)開(kāi)始膨脹，果實(shí)變得很大；第四個(gè)時(shí)期為草莓果實(shí)開(kāi)始從綠果向白 果轉(zhuǎn)化；第五個(gè)時(shí)期是草莓果實(shí)白果期，果實(shí)完全變?yōu)榘咨?；第六個(gè)時(shí)期和第七個(gè)時(shí)期為 紅果期，紅果期也可以分為兩個(gè)時(shí)期，一個(gè)是果實(shí)開(kāi)始變紅大約一半左右，另一個(gè)時(shí)期果實(shí) 完全為紅色，優(yōu)選第四個(gè)時(shí)期和第五個(gè)時(shí)期的果實(shí)。
[0012] 所述步驟2)中注射位置選擇果柄處，注射量為直到菌液溢出為止。
[0013] 所述步驟3)、步驟4)中摘取注射后第五天的果實(shí)。
[0014] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1) 本發(fā)明建立高效快速的農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)細(xì)胞體系，提供一種新的草莓轉(zhuǎn)基 因方法； 2) 本發(fā)明能夠使基因在草莓果實(shí)中短時(shí)間內(nèi)得到表達(dá)，比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法更快速， 更便捷； 3) 通過(guò)本發(fā)明可以研究一大批果實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)基因在草莓果實(shí)成熟發(fā)育中的作用， 從而進(jìn)行草莓果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因的功能鑒定，為今后草莓的基因功能鑒定提供了一種新方 法，新思路。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1不同菌株類型以及同的果實(shí)發(fā)育時(shí)期對(duì)農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化效率的影響； 圖2 AGLO菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響； 圖3不同取樣時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率和基因表達(dá)量的影響； 圖4為注射后草莓果實(shí)GUS組織染色圖，將草莓果實(shí)從外到里分為三個(gè)部分，分別是外 果肉、中果肉和內(nèi)果肉，該圖中從左到右，左邊是草莓果實(shí)外果肉染色結(jié)果，中間是草莓果 實(shí)中果肉染色結(jié)果，右邊是草莓果實(shí)內(nèi)果肉染色結(jié)果，榮染色結(jié)果能夠看出，注射后整個(gè)草 莓果實(shí)都能夠染色，說(shuō)明農(nóng)桿菌完全侵染整個(gè)草莓果實(shí)。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0017] 實(shí)施例1 1、本發(fā)明材料選用如下： 1)植物材料 植物材料選用草莓品種'紅顏'的果實(shí)作為農(nóng)桿菌注射的植物受體。'紅顏'種植于日 光溫室中。于每年3月-5月選取不同成熟期的果實(shí)進(jìn)行注射，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中同樣的試驗(yàn)至少 重復(fù)5次以上，以保證試驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
[0018] 注射時(shí)將果實(shí)按照不同的發(fā)育時(shí)期分為七個(gè)不同的時(shí)期，其中前四個(gè)時(shí)期為草莓 果實(shí)綠果期。第一個(gè)時(shí)期為種子剛剛完全形成，并且密集的分別在草莓果實(shí)周圍，花托并不 能看清楚；第二個(gè)時(shí)期為花托可以清晰的看見(jiàn)，果莖大約為0. 3?0. 5厘米；第三個(gè)時(shí)期為 果實(shí)開(kāi)始膨脹，果實(shí)變得很大，果莖大小約為〇. 8?1. 5厘米；第四個(gè)時(shí)期為草莓果實(shí)開(kāi)始 從綠果向白果轉(zhuǎn)化；第五個(gè)時(shí)期是草莓果實(shí)白果期，果實(shí)完全變?yōu)榘咨?；第六個(gè)時(shí)期和第 七個(gè)時(shí)期為紅果期，紅果期也可以分為兩個(gè)時(shí)期，一個(gè)是果實(shí)開(kāi)始變紅大約一半左右，另一 個(gè)時(shí)期果實(shí)完全為紅色。
[0019] 2)供試菌株 根據(jù)需要，本試驗(yàn)選用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)是EHA105、AGL0和 GV3101。這三個(gè)菌株都購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection) ATCC)。通過(guò)注射后相關(guān)基因的表達(dá)量可以確定在草莓果實(shí)的農(nóng)桿菌注射中使用哪一個(gè)菌 株效果最好。三個(gè)菌株中都攜帶包含講基因的pCAMBIA2301質(zhì)粒。
[0020] 3)卡那霉素：是生物抗生素類藥劑，購(gòu)買自美國(guó)sigma公司，藥品為白色粉劑，配 制成50mg/mL的濃度供試驗(yàn)用； 4) Rif :利福平是生物抗生素類藥劑，購(gòu)買自美國(guó)sigma公司，藥品為深紅色粉劑，配制 成25mg/mL的濃度供試驗(yàn)用； 5) MS液體培養(yǎng)基是由美國(guó)sigma公司生產(chǎn)的MS培養(yǎng)基粉劑（Murashige and Skoog basal salt mixture),此MS培養(yǎng)基粉劑要求每配制一升培養(yǎng)基添加 4. 4克粉劑，在本試 驗(yàn)，每配制ILMS培養(yǎng)基需要加入該MS培養(yǎng)基粉劑4. 4克。
[0021] 2、試驗(yàn)方法： 一種使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，該方法包括如下步驟： 1)分別將攜帶包含⑶S基因的PCAMBIA2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105、AGL0和GV3101 菌液在固體培養(yǎng)基上劃線后挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中于28°C搖菌培養(yǎng)至菌液0D600為 1. 2,將菌液離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重 懸，重懸后測(cè)定菌液0D600在1. 2,將重懸后的菌液放于冰箱備用；其中： 固體培養(yǎng)基為：LB固體培養(yǎng)基50 mL+卡那霉素50mg /L+利福平IOOmg/ L ;其 中LB固體培養(yǎng)基配方：每一升LB固體培養(yǎng)基中包含Tryptone (胰蛋白胨）IOg, Yeast Extract (酵母提取物）5g, NaCl (氯化鈉）IOg以及Agar (瓊脂）15g。
[0022] 液體培養(yǎng)基為：LB液體培養(yǎng)基50mL+Kan (卡那霉素 )50mg /L+Rif (利福平)100mg/ L ;其中LB液體培養(yǎng)基配方：每一升LB液體培養(yǎng)基中包含Tryptone (胰蛋白胨）10g， Yeast Extract (酵母提取物）5g, NaCl (氯化鈉）10g。
[0023] 2)用ImL的無(wú)菌注射器將步驟（1)得到的重懸后的菌液注射至七個(gè)不同的時(shí)期 的果實(shí)中，從果柄處注入菌液，直到菌液溢出為止。
[0024] 3)⑶S組織染色檢測(cè)： 摘取注射后第三天、第五天、第七天的果實(shí)，切成薄片，放入⑶S染色液中，進(jìn)行染色鑒 定，染色過(guò)夜后用體積濃度70%酒精去除葉綠素后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率；轉(zhuǎn)化效率以基因瞬時(shí) 表達(dá)率來(lái)表示，在染色后的果實(shí)薄片中，以藍(lán)色占果面50%以上為準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)出具有濟(jì)Λ5基因 瞬時(shí)表達(dá)的數(shù)量也就是GUS染色率；公式如下： ⑶S染色率=(染色的果實(shí)數(shù)量/總注射果實(shí)數(shù)）X 100%，以⑶S染色率代表轉(zhuǎn)化效 率。
[0025] 上述⑶S染色液具體配方是：每IOOmLGUS染色液中含X- Gluc(5-溴-4-氯-3-吲 哚-0-葡萄糖苷酸酯）1〇〇11^、1(3%妳）6]鐵氰化鉀11^毫升、1(4%妳）6]亞鐵氰 化鉀ImL毫升甲醇20mL、10%的Triton-100 (曲拉通）ImUPBS磷酸緩沖液77mL毫升。
[0026] 4 ) 基因表達(dá)量檢測(cè)： 為了進(jìn)一步檢測(cè)農(nóng)桿菌菌液的轉(zhuǎn)化效率，摘取注射后第三天、第五天、第七天的果實(shí)， 提取果實(shí)RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)基因表達(dá)量。
[0027] 三種不同的菌株類型對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響結(jié)果：從圖1的綜合分析結(jié)果能夠看出， 三種不同的菌株類型對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響比較大，而且對(duì)果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期也有一定的影 響。其中菌株AGLO無(wú)論與其他兩個(gè)菌株相比，轉(zhuǎn)化效率都是顯著增高的，而且在果實(shí)發(fā)育 各個(gè)時(shí)期，轉(zhuǎn)化效率都明顯高于其他兩個(gè)菌株。因此，'紅顏'草莓農(nóng)桿菌注射選用的最合適 菌株為AGL0。而對(duì)于草莓果實(shí)發(fā)育時(shí)期而言，最合適的時(shí)期應(yīng)該是在第四個(gè)時(shí)期和第五個(gè) 時(shí)期，此時(shí)注射，轉(zhuǎn)化效率最高。
[0028] 實(shí)施例2 : 將攜帶包含⑶S基因的pCAMBIA2301質(zhì)粒的AGLO根癌農(nóng)桿菌菌液在固體培養(yǎng)基上 劃線后挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)。其中固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的配方同實(shí)施 例1，在28°C的條件下，180-200rmp振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至菌液濃度（0D600值)為0. 8? 2. 4,將50mL菌液在離心機(jī)中5000rmp離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀 用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定菌液濃度（0D600值）為0. 8?2. 4,將菌液濃度 (0D600值）設(shè)定五個(gè)不同梯度，分別是0. 8、1. 2、1. 6、2. 0、2. 4,將重懸后的不同濃度的菌液 放于冰箱備用。
[0029] 分別將菌液濃度（00600值）為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4的重懸后的菌液用111^的 無(wú)菌注射器注射至第五時(shí)期的果實(shí)中，從果柄處注入菌液，直到菌液溢出為止。
[0030] 在注射后第五天將注射后的果實(shí)摘下，進(jìn)行⑶S組織染色檢測(cè)。
[0031] 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響是比較大的，從圖2可以看出，菌液濃度在0. 8?1. 2 時(shí)轉(zhuǎn)化效率都比較高，菌液濃度過(guò)高，不僅轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降，而且注射后會(huì)導(dǎo)致果實(shí)腐爛壞 死，因此注射時(shí)優(yōu)選菌液濃度是0D600值=0. 8?1. 2。
[0032] 實(shí)施例3 將攜帶包含⑶S基因的pCAMBIA2301質(zhì)粒的AGLO根癌農(nóng)桿菌菌液在固體培養(yǎng)基上 劃線后挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)。其中固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的配方同實(shí)施 例1，在28°C的條件下，180-200rmp振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至菌液濃度（0D600值）為1.2， 將50mL菌液在離心機(jī)中5000rmp離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液 體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定菌液濃度（0D600值）為1. 2,將重懸后的菌液放于冰箱備 用。
[0033] 將重懸后的菌液用ImL的無(wú)菌注射器注射至第五時(shí)期的果實(shí)中，從果柄處注入 菌液，直到菌液溢出為止。
[0034] 分別在注射后第三天、第五天、第七天將注射后的果實(shí)摘下，進(jìn)行⑶S組織染色檢 測(cè)。
[0035] 注射后的不同取樣時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率以及基因表達(dá)量的影響都很大，從圖三也可以 看出，無(wú)論是轉(zhuǎn)化效率還是基因表達(dá)量，都是在注射后第五天最高，因此，注射后的取樣時(shí) 間一般在第五天最為合適。
[0036] 實(shí)施例4 將攜帶包含⑶S基因的pCAMBIA2301質(zhì)粒的AGLO根癌農(nóng)桿菌菌液在固體培養(yǎng)基上 劃線后挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)。其中固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的配方同實(shí)施 例1，在28°C的條件下，180-200rmp振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至菌液濃度（0D600值）為1.2， 將50mL菌液在離心機(jī)中5000rmp離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液 體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定菌液濃度（0D600值）為1. 2,將重懸后的菌液放于冰箱備 用。
[0037] 將重懸后的菌液用ImL的無(wú)菌注射器注射至第五時(shí)期的果實(shí)中，分別從果尖、果 柄處注入菌液，直到菌液溢出為止。
[0038] 在注射后第五天將注射后的果實(shí)摘下，進(jìn)行⑶S組織染色檢測(cè)。
[0039] 從實(shí)施的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)從果柄處注射效果較好，因?yàn)閺墓庾⑸涠喙麑?shí)會(huì)有 一定程度的傷害，從而會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，因此，注射位置選擇果柄處。
【權(quán)利要求】
1. 一種使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： 1) 將攜帶包含GUS基因的PCAMBIA2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液在固體培養(yǎng)基上劃線后 挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中于28°C搖菌培養(yǎng)至菌液0D600為0. 8?2. 4,將菌液離心后 倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定菌液 0D600在0. 8?2. 4,將重懸后的菌液放于冰箱備用； 2) 用無(wú)菌注射器將步驟（1)得到的重懸后的菌液注射至果實(shí)中； 3) 摘取注射后第三天至第七天之間的果實(shí)，切成薄片，放入GUS染色液中，進(jìn)行染色鑒 定，染色過(guò)夜后用體積濃度70%酒精去除葉綠素后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率； 4) 摘取注射后第三天至第七天之間的果實(shí)，提取果實(shí)RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光 定量PCR，檢測(cè)基因表達(dá)量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟1)中農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟1)中菌液0D600為0. 8?1. 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟1)中固體培養(yǎng)基為：LB固體培養(yǎng)基50 mL+卡那霉素50mg /L+利福平IOOmg/ L， 其中LB固體培養(yǎng)基配方：每一升LB固體培養(yǎng)基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯 化鈉 IOg以及瓊脂15g。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟1)中液體培養(yǎng)基為：LB液體培養(yǎng)基50 mL+卡那霉素50mg /L+利福平IOOmg/ L ;其 中LB液體培養(yǎng)基配方：每一升LB液體培養(yǎng)基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化 鈉 l〇g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟2)中果實(shí)為草莓品種"紅顏"每年3 -5月不同成熟期的果實(shí)，此時(shí)按照不同的發(fā) 育時(shí)期分為七個(gè)不同的時(shí)期，第一個(gè)時(shí)期為種子剛剛完全形成，并且密集的分別在草莓果 實(shí)周圍，花托并不能看清楚；第二個(gè)時(shí)期為花托可以清晰的看見(jiàn)，果莖大約為〇. 3?0. 5厘 米；第三個(gè)時(shí)期為果實(shí)開(kāi)始膨脹，果實(shí)變得很大，果莖大小約為〇. 8?1. 5厘米；第四個(gè)時(shí) 期為草莓果實(shí)開(kāi)始從綠果向白果轉(zhuǎn)化；第五個(gè)時(shí)期是草莓果實(shí)白果期，果實(shí)完全變?yōu)榘咨?第六個(gè)時(shí)期和第七個(gè)時(shí)期為紅果期，紅果期也可以分為兩個(gè)時(shí)期，一個(gè)是果實(shí)開(kāi)始變紅大 約一半左右，另一個(gè)時(shí)期果實(shí)完全為紅色。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述果實(shí)采用第四個(gè)時(shí)期和第五個(gè)時(shí)期的果實(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟2)中注射位置選擇果柄處，注射量為直到菌液溢出為止。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，其特征在于，所 述步驟3)、步驟4)中摘取注射后第五天的果實(shí)。
【文檔編號(hào)】A01H5/08GK104212832SQ201410473543
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】王媛花, 賈思振, 蔡善亞, 顏志明, 郭正兵, 王全智 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院