專利名稱：一種細(xì)胞表面展示磷脂酶d酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法。
背景技術(shù)：
磷脂酰絲氨酸(ph0SphatidylSerine，PQ是一種天然的磷脂，于1942年由Jordi i^olch首次提取并加以定性。PS的結(jié)構(gòu)決定了其具有雙親性的獨(dú)特性質(zhì)，帶有負(fù)電荷的一端具有親水性(或水溶性)，由脂肪酸組成的另一端具有親脂性(或脂溶性)，作為磷脂家族中的一員，它是唯一能夠調(diào)控細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白功能狀態(tài)的磷脂，有著獨(dú)特的理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值1.提高認(rèn)知能力，特別是識(shí)別、學(xué)習(xí)、記憶能力；2.改善阿爾茨默氏癥 (Alzheimer' S Disease) ；3治療抑郁癥；(4)緩解精神壓力和身體疲勞。目前工業(yè)化生產(chǎn)PS的主流方法是采用浸提法，存在選擇性不高、易引入其他雜質(zhì)、無(wú)法獲取高純度PS等問(wèn)題，而化學(xué)合成法生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸僅存在于實(shí)驗(yàn)室研究，遠(yuǎn)不能達(dá)到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)要求。磷脂酶D (EC3. 1. 4. 4)，屬于催化磷酸二脂酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，分布在從細(xì)菌到高等動(dòng)植物的眾多生物類群中，其主要生理功能是參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝， 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物膜形成等。磷脂酶D具有水解和轉(zhuǎn)酯雙重活性，既可水解卵磷脂(PC)形成磷脂酸(PA)和膽堿；又可在高濃度絲氨酸、乙醇胺等親核物質(zhì)存在下，催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成具有不同極性頭部的稀有磷脂-磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。應(yīng)用同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)酶的反應(yīng)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，該酶表現(xiàn)出Ping-pong反應(yīng)機(jī)制，在水相和底物積聚相的相界面對(duì)底物進(jìn)行“修飾”，同時(shí)反應(yīng)速率不僅取決于底物濃度，還與兩性底物、催進(jìn)劑、 抑制劑有很大關(guān)系。磷脂酶D的研究已開展了近五十年，但距工業(yè)生產(chǎn)的需要，特別是與其他酶生產(chǎn)和應(yīng)用相比，存在很大的差距，尤其是我國(guó)在這方面的研究工作幾乎是空白，究其原因，主要有以下幾點(diǎn)1.酶源狹窄且在生物體內(nèi)含量極微，提純相當(dāng)困難；2.酶的穩(wěn)定性差且只能在異相系統(tǒng)中作用；3.該酶在生物體內(nèi)的功能及作用機(jī)理尚未完全搞清，其應(yīng)用范圍不酶的固定化技術(shù)是蛋白質(zhì)工程的一項(xiàng)重要內(nèi)容能夠提高蛋白或酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。但要對(duì)酶進(jìn)行分離純化，且需要較為復(fù)雜的設(shè)備，增大生產(chǎn)成本。游離磷脂酶D穩(wěn)定性差，無(wú)法回收利用，酶的固定化技術(shù)能夠提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，但是傳統(tǒng)的固定化方法也會(huì)產(chǎn)生一些不利因素，例如，固定化過(guò)程可能造成酶的活性收率損失；另外，由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費(fèi)和固定化操作費(fèi)用，而酵母細(xì)胞細(xì)胞表面展示技術(shù)為酶的固定化提供了一種新的基于基因重組技術(shù)的生物學(xué)方法。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其基本原理
3是將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，在醫(yī)藥、食品、生物燃料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。目前，最常見的酵母細(xì)胞表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)。目前多種酶類包括脂酶、生物素連接酶、有機(jī)磷水解酶、羧酸酯酶、差向異構(gòu)酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶、纖維素酶等被成功地展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面且具有生物活性。磷脂酶D催化反應(yīng)是在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行的，對(duì)于游離酶來(lái)講，有機(jī)溶劑常常降低其在非水相催化中的活力，而展示酶有力地改善了上述缺點(diǎn).

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，全細(xì)胞催化劑具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性好， 可重復(fù)利用，且制備簡(jiǎn)單，節(jié)省酶固定化的設(shè)備，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，包括以下步驟(1)將酵母全細(xì)胞催化劑加入含有絲氨酸、CaCl2, Triton-XlOO的醋酸緩沖液中， 與含有卵磷脂的氯仿溶液等體積混合均勻，在30°C下混合得到均勻的乳狀液反應(yīng)5-6小時(shí)；其中全細(xì)胞催化劑為lg、絲氨酸的濃度為4. 5M,CaCl2的濃度為5. OmM,Triton-XlOO的濃度為0. 4%、卵磷脂的濃度為20mM ；(2)反應(yīng)結(jié)束后靜止自然分層，提取有機(jī)相；(3)有機(jī)溶劑揮發(fā)后剩余物經(jīng)氯仿洗滌2-4次，即可得到磷脂酰絲氨酸。而且，所述酵母全細(xì)胞催化劑用的酵母工程菌由pPIC9K-Flo-pldm轉(zhuǎn)化至宿主畢赤酵母GS115構(gòu)建獲得，所述pPICTK-Flo-pldm為由編碼野生型磷脂酶D的基因序列見序列1，定點(diǎn)突變得到的編碼高活力磷脂酶D成熟肽基因序列見序列2經(jīng)EcoRI和MluI雙酶切后，將其定向連接至經(jīng)EcoRI和MluI雙酶切后的酵母展示載體pPIC9K-Flo構(gòu)建獲得。而且，所述酵母全細(xì)胞催化劑的制備方法步驟如下(1)將培養(yǎng)于YPD瓊脂固體平板上的酵母工程菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中， 25-35 °C、230-270r/min 培養(yǎng) 20_30h ；(2)以的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20_30h，然后在4°C、8000r/ min離心IOmin得到菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中；(3)25-35°C>230-270r/min 培養(yǎng) 90_100h，每隔 24h 加入終濃度為 0. 5% V/V 甲醇
誘導(dǎo)產(chǎn)酶；(4)然后收集發(fā)酵液，離心，取菌體沉淀，用雙蒸水洗，最后用少量雙蒸水重懸，加保護(hù)劑，通過(guò)真空冷凍干燥得到全細(xì)胞催化劑干粉。而且，步驟( 獲得的水相經(jīng)離心取沉淀，用醋酸緩沖液洗滌兩次，可重新獲取全細(xì)胞催化劑，進(jìn)行下一次反應(yīng)，達(dá)到全細(xì)胞催化劑的重復(fù)利用。而且，所述醋酸緩沖液與氯仿溶液的體積比為3 1。而且，所述醋酸緩沖液的pH為7. 0。
本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明制備的全細(xì)胞催化劑具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用，且制備簡(jiǎn)單，節(jié)省酶固定化的設(shè)備，降低生產(chǎn)成本。2、本發(fā)明利用磷脂酶D的高度專一性，催化卵磷脂和絲氨酸制備磷脂酰絲氨酸， 有效解決目前浸提法和化學(xué)合成法無(wú)法獲取高純度磷脂酰絲氨酸的問(wèn)題，在醫(yī)藥及食品保健品領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。3、本發(fā)明采用細(xì)胞表面展示磷脂酶D的酵母工程菌制備全細(xì)胞催化劑，免去了酶的純化和固定等操作，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，降低了生產(chǎn)成本，使酵母展示技術(shù)成為酶法催化卵磷脂生成磷脂酰絲氨酸的一個(gè)極具潛力的發(fā)展方向。


圖1為本發(fā)明細(xì)胞表面展示磷脂酶D的酵母全細(xì)胞催化劑制備工藝流程圖；圖2為本發(fā)明細(xì)胞表面展示磷脂酶D的酵母全細(xì)胞催化劑催化卵磷脂及絲氨酸合成磷脂酰絲氨酸的工藝流程具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本實(shí)施列采用下列分析條件反應(yīng)停止后雙液相自然分層。提取有機(jī)相，經(jīng)揮發(fā)后，剩余物經(jīng)氯仿洗滌兩次，最后溶解于適量氯仿甲醇=19 1 (ν/ν)中，以待分析之用。利用HPLC-UV法檢測(cè)的色譜條件為檢測(cè)波長(zhǎng)206nm；流動(dòng)相乙腈甲醇85%磷酸=100 10 0.8 ；色譜柱Phenomsil 5 μ C18 (250 X 4. 6mm)；流速lmL/min；進(jìn)樣量15yL;檢測(cè)時(shí)間15min。分別稱取磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用氯仿配成濃度分別為0. 18,0. 5,1. 0,1. 5、 2. 0,2. 5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。利用磷脂酰絲氨酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算產(chǎn)物生成量，從而得出轉(zhuǎn)化率結(jié)果。磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)化率的表征方法為
PS
總磷脂一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑的制備方法(1)將培養(yǎng)于YPD瓊脂固體平板上的畢赤酵母重組菌株(pPIC9K-Flo-pldm/ GS115)接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30°C、250r/min培養(yǎng)Mh ；(2)以的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，30°C、250r/min培養(yǎng)Mh，然后在4°C、8000r/min離心IOmin得到菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中；(3)30°C、250r/min培養(yǎng)96h，每隔24h加入終濃度為0. 5% (V/V)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。(4)然后收集發(fā)酵液，離心，取菌體沉淀，用雙蒸水洗2次，加脫脂牛奶為保護(hù)劑， 通過(guò)真空冷凍干燥得到全細(xì)胞催化劑干粉。一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D的酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法， 步驟如下雙液相反應(yīng)體系30mL的0. Imol/醋酸緩沖液(pH7. 0)中含有4. 5mol/L的絲氨酸、5mmol/LCaCl2，Triton-XlOO的濃度為0. 4%，同時(shí)加入Ig全細(xì)胞催化劑，與IOmL含有 20mmol/L卵磷脂的有機(jī)相混合，在30°C下200r/min混合得到均勻的乳狀液進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)證后，停止轉(zhuǎn)動(dòng)，雙液相自然分層。提取有機(jī)相，經(jīng)揮發(fā)后，剩余物經(jīng)氯仿洗滌兩次，最后溶解于適量氯仿甲醇=19 1 (ν/ν)中，以待分析之用。水相經(jīng)4°C、8000r/min離心 IOmin,取沉淀雙蒸水洗滌兩次，重新獲得全細(xì)胞催化劑，可重復(fù)使用10次以上，轉(zhuǎn)化率沒有明顯降低。利用HPLC-UV法檢測(cè)磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率。其中細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化反應(yīng)時(shí)磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到58. 2 %，較細(xì)胞表面展示野生型磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化反應(yīng)時(shí)磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率51. 9%提高了 6.3%。一種細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶D的酵母工程菌的構(gòu)建方法如下一、野生型磷脂酶D成熟肽基因的獲得1、野生型磷脂酶D成熟肽基因來(lái)自色褐鏈霉菌(AS 4. 331)，購(gòu)于中科院微生物研究所，提取其基因組DNA。其中色褐鏈霉菌基因組DNA的提取步驟如下(1)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液取lmL，12000r/min離心Imin收集菌體。(2)將菌體懸浮于90 μ L ddH20中，加50mg/mL溶菌酶10 μ L，充分混勻后37°C水浴保溫20min。(3)加入400 μ L裂解液混勻至產(chǎn)生大量泡沫，補(bǔ)加5mol/L NaCl 200 μ L，輕輕顛倒混勻，1200r/min 離心 IOmin0(4)上清轉(zhuǎn)移至另一 Ep管中，加1/2體積苯酚和1/2體積氯仿，溫和混勻。12000r/ min 離心 3min。(5)取上清，加入1/2體積的苯酚、氯仿反復(fù)抽提，離心，吸上清，重復(fù)此步驟直到兩相界面看不到白色物質(zhì)為止。(6)加入等體積的氯仿進(jìn)行抽提，離心，吸上清。(7)用兩倍體積的無(wú)水乙醇-70°C沉淀DNA大約30min，12000r/min離心8min， 200 μ L70%乙醇洗滌兩次，12000r/min離心5min，室溫晾干。(8) DNA 溶于 2O μ LddH2O 中 _20 "C 短期保存。2、根據(jù)已報(bào)道磷脂酶D成熟肽基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的磷脂酶D成熟肽基因的擴(kuò)增引物如下上游Pl CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下劃線部分為 MluI 酶切位點(diǎn))下游Ρ2 :CCGGAATTCctacttatcRtcRtcatccttRtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC (下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)，小寫為flag標(biāo)簽)
擴(kuò)增模板為色褐鏈霉菌基因組DNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C 5min -MV lmin, 60°C lmin40s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延長(zhǎng) IOmin ；擴(kuò)增體系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L, dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, La TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，得到1500bp左右的條帶，用小量DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到本發(fā)明的野生型磷脂酶D成熟肽基因pld。二、磷脂酶D基因的定點(diǎn)突變。(1)野生型磷脂酶D基因連接入T載體。將PCR擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行純化，將其連入T載體。利用電轉(zhuǎn)化法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，EcoRI、MluI雙酶切和PCR驗(yàn)證結(jié)果表明磷脂酶D基因已成功克隆到T載體上。將其測(cè)序可知擴(kuò)增到磷脂酶D的序列如SEQ ID No. 1。(2)定點(diǎn)突變基于重疊PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建高活力磷脂酶D基因。Gly69 — Glu、 Ser285 — Ala設(shè)計(jì)引物如下上游CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下劃線部分為 MluI 酶切位點(diǎn))下游CCGGAATTCctacttatcgtcgtcatccttgtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC(下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)，小寫為flag標(biāo)簽)重疊弓丨物 P3 :5，-cacgcgccgagagcgaccacacc-3，重疊弓丨物 P4 :5，-ggtgtggtcgctctcggcgcgtg-3，重疊弓丨物 P5 :5，-caggccgccacggccagcggt-3，重疊弓丨物 P6 :5，-accgctggccgtggcggcctg-3，在上游引物和下游引物5’端分別引入MluI和EcoRI酶切位點(diǎn)。重疊引物P3與重疊引物P4互補(bǔ)，重疊引物P5與重疊引物P6互補(bǔ)。重疊引物P3與P4中包含了對(duì)69位氨基酸殘基的突變。而重疊引物P5與P6中則包含了對(duì)285位氨基酸殘基的突變。Gly69 — Glu用引物PI、P4擴(kuò)增上游片段pldl，P3、P2擴(kuò)增下游片段pld2。PCR反應(yīng)體系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5yL，重組質(zhì)粒pUC-T-pld IOOng, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，無(wú)菌去離子水補(bǔ)充至 50 μ L0PCR擴(kuò)增條件為94 V預(yù)變性5min，共1個(gè)循環(huán)；94 °C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，共1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物切膠回收，適當(dāng)稀釋。以pldl、pld2為引物，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pldl、pld2 各 1 μ L，LA Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，無(wú)菌去離子水補(bǔ)充至48 μ L。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5個(gè)循環(huán)；加入引物P1、P2各1 μ L，進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件為-MV 預(yù)變性5min, 1個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin，共1個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR反應(yīng)液進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段。得到Gly69 — Glu的磷脂酶D突變體。Ser285 — Ala用磷脂酶D突變基因Gly69 — Glu為模板，引物P1、P6擴(kuò)增上游片段pld3，P5、P2 擴(kuò)增下游片段Pld4。PCR反應(yīng)體系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5 μ L，磷脂酶D突變基因Gly69 — Glu 2 μ L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，無(wú)菌去離子水補(bǔ)充至50 μ L0PCR擴(kuò)增條件為94 V預(yù)變性5min，共1個(gè)循環(huán)；94 °C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，共1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物切膠回收，適當(dāng)稀釋。以pld3、pld4為引物，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pld3、pld4 各 1 μ L, LA Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ L，無(wú)菌去離子水補(bǔ)充至48 μ L。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5個(gè)循環(huán)；加入引物P1、P2各1 μ L，進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件為-MV 預(yù)變性5min, 1個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin，共1個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR反應(yīng)液進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段。得到 Gly69 — Glu、Ser285 — Ala的高活力磷脂酶D基因pldm。序列如SEQ ID No. 2 三、磷脂酶D基因工程菌的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-pldm的構(gòu)建與鑒定將重疊PCR純化產(chǎn)物與載體pPIC9K_Flo經(jīng)EcoRI和MluI雙酶切后，分別用小量 DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，應(yīng)用DNA連接試劑盒的Solution I在16°C的條件下連接 12h，將磷脂酶D目的基因pldm定向連接至載體pPIC9K-Flo，將連接產(chǎn)物應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a感受態(tài)中，在含有Amp的LA培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用EcoRI和MluI雙酶切鑒定，測(cè)序，命名為pPIC9K-Flo-pldm。其中大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備方法(1)從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于2mL LB培養(yǎng)基試管中，37°C 180r/ min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取500 μ L菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50mL LB培養(yǎng)基的250mL錐型瓶中，37°C 180r/ min搖床培養(yǎng)2 汕。(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，冰上放置IOmin ；(4)4°C,4000r/min離心lOmin，回收菌體細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin，以便
液體培養(yǎng)基流盡；(5)用冰冷的0. ImoVLCaCl2溶液IOmL懸浮沉淀，立即放在冰上保溫30min ；(6)4°C>4000r/min 離心 lOmin，回收菌體細(xì)胞；(7)用冰冷的0. ImoVLCaCl2和15%的甘油混合液2mL重懸細(xì)胞；(8)分裝細(xì)胞，每份50 μ L，即得到感受態(tài)細(xì)胞。其中重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-pldm化學(xué)轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)的具體步驟為(1)加入10 μ L質(zhì)粒DNA連接產(chǎn)物于100 μ L感受態(tài)中，充分混勻；(2)冰上放置 30min，42°C水浴 90s ；
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(3)冰上放置1 2min ；(4)將感受態(tài)細(xì)胞加入800 μ LLB培養(yǎng)基中，搖床37°C，180r/min復(fù)蘇培養(yǎng)Ih ；(5)復(fù)蘇培養(yǎng)后，取菌液8000r/min離心aiiin，吸掉1/3上清液后，將菌體重懸，涂布于Amp抗性平板，37°C倒置培養(yǎng)12 16 ；2、畢赤酵母GS115基因工程菌的構(gòu)建將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)MlI線性化后，LiCl法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，MD平板篩選重組子，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。其中畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備方法為(1)在YPD平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于50mLYPD液體培養(yǎng)基中，30°C， 250r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 8 1. 2。(2)收集菌體細(xì)胞，用30mL的無(wú)菌水沖洗3次，4°C，5000r/min離心lOmin。(3)除凈無(wú)菌水后用ImL 0. lmol/L的LiCl輕輕重懸菌體細(xì)胞。(4)在超凈工作中將菌體細(xì)胞懸濁液轉(zhuǎn)移至1. 5mL無(wú)菌的離心管中。(5)室溫12000r/min離心lmin，沉淀菌體細(xì)胞并用無(wú)菌槍頭除凈LiCl。(6)加入400 μ L 0. lmol/L的LiCl重懸菌體細(xì)胞。(7)將50 μ L的細(xì)胞懸濁液分裝到1. 5mL的無(wú)菌離心管中。其中重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-pldm化學(xué)轉(zhuǎn)化GS 115感受態(tài)的具體步驟為(1)煮沸單鏈DNA5min，快速置于冰上冷卻。(2)取新制備的感受態(tài)細(xì)胞12000r/min離心IOmin除凈LiCl。(3)將每個(gè)轉(zhuǎn)化的樣品按順序加入以下試劑240μ 40%的PEG，36yL IM LiCl，10μ LDNA。(4)劇烈渦旋細(xì)胞沉淀至其完全混勻(大約需:3min左右)。(5)在30°C的水浴中靜止放置30min。(6)在42°C的水浴中熱擊20 25min。(7)30°C，6000r/min 離心 5min，除凈上清溶液。(8)用0. 5mL的無(wú)菌水重懸菌體細(xì)胞沉淀。(9)在MD平板上均勻涂布100 300 μ L的重懸細(xì)胞溶液，在30°C倒置培養(yǎng)48 96h。其中誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法為將重組畢赤酵母pPIC9K-Flo-pldm/GS115接種于20mL含有0. 5%甘油的BMGY培養(yǎng)基中，280C，250r/min振蕩培養(yǎng)Mh，然后每隔Mh向培養(yǎng)基中加入終濃度0. 5%的甲醇， 繼續(xù)在^°C，250r/min條件下振蕩培養(yǎng)120h。3、全細(xì)胞催化劑水解活力的測(cè)定采用酶聯(lián)比色法進(jìn)行活性檢測(cè)磷脂酶D催化水解L-α -卵磷脂生成膽堿，膽堿在膽堿氧化酶的作用下生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化酶的作用下與4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亞胺顯色物質(zhì)，在A = 500nm下具有吸光值。反應(yīng)體系將220mg的L- α -卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6mL IM NaOAc緩沖液(pH = 8. 0)、39mL的去離子水、 0. 272mL17. 9%的乙醇溶液(終濃為)的混合體系作為底物溶解液。將39mg 4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg過(guò)氧化物酶溶于5. 5mL的IOOmM Tris HCl (pH = 8)緩沖液中作為膽堿顯色劑。取2. 4mL底物溶液、0. 3mL的500mM CaCl2溶液、0. 2mL的去離子水混合并置于 37°C水浴。然后加入0. ImL的酶液，混合均勻，于37。C反應(yīng)lOmin，沸水浴終止反應(yīng)，待冷卻至室溫加入0. 05mL 2M Tris HCl (pH = 9)緩沖液，混合并離心后，上清液用0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，取濾液2mL與0. ImL膽堿顯色劑、0. ImL膽堿氧化酶溶液室溫反應(yīng)2.證。在反應(yīng)混合物中加入2. OmL去離子水，離心得到澄清透亮的粉紅色溶液，最后于A5tltlnm檢測(cè)吸光值。 酶活定義pH = 8.0、T = 37°C時(shí)，磷脂酶D Imin內(nèi)催化水解L-α -卵磷脂釋放l.Oymol 的膽堿所需要的酶量。測(cè)得表面展示高活力磷脂酶D的全細(xì)胞催化劑酶活為120U/(g·干細(xì)胞)，較野生型磷脂酶D提高了 11%。SEQUENCE LISTING<110>天津科技大學(xué)<120> 一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法<130>2011-07-14<160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1533<212>DNA<213>野生型磷脂酶D成熟肽基因<400>1
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accgctggccgtggcggcctg2權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將酵母全細(xì)胞催化劑加入含有絲氨酸、CaCl2,Triton-XlOO的醋酸緩沖液中，與含有卵磷脂的氯仿溶液等體積混合均勻，在30°C下混合得到均勻的乳狀液反應(yīng)5-6小時(shí)；其中全細(xì)胞催化劑為lg、絲氨酸的濃度為4. 5M、CaCl2的濃度為5. OmM, Triton-XlOO的濃度為0. 4%、卵磷脂的濃度為20mM ；(2)反應(yīng)結(jié)束后靜止自然分層，提取有機(jī)相；(3)有機(jī)溶劑揮發(fā)后剩余物經(jīng)氯仿洗滌2-4次，即可得到磷脂酰絲氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述酵母全細(xì)胞催化劑用的酵母工程菌由pPIC9K-Flo-pldm轉(zhuǎn)化至宿主畢赤酵母GSl 15構(gòu)建獲得，所述pPIC9K-Flo-pldm為由編碼野生型磷脂酶D的基因序列見序列1，定點(diǎn)突變得到的編碼高活力磷脂酶D成熟肽基因序列見序列2經(jīng)EcoRI和 MluI雙酶切后，將其定向連接至經(jīng)EcoRI和MluI雙酶切后的酵母展示載體pPIC9K_Flo構(gòu)建獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述酵母全細(xì)胞催化劑的制備方法步驟如下(1)將培養(yǎng)于YPD瓊脂固體平板上的酵母工程菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中，25-35°C、 230-270r/min 培養(yǎng) 20_30h ；(2)以的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-30h，然后在4°C、8000r/min離心IOmin得到菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中；(3)25-35°C>230-270r/min培養(yǎng)90_100h，每隔24h加入終濃度為0.5% V/V甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶；(4)然后收集發(fā)酵液，離心，取菌體沉淀，用雙蒸水洗，最后用少量雙蒸水重懸，加保護(hù)劑，通過(guò)真空冷凍干燥得到全細(xì)胞催化劑干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于步驟( 獲得的水相經(jīng)離心取沉淀，用醋酸緩沖液洗滌兩次，可重新獲取全細(xì)胞催化劑，進(jìn)行下一次反應(yīng)，達(dá)到全細(xì)胞催化劑的重復(fù)利用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述醋酸緩沖液與氯仿溶液的體積比為3 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于所述醋酸緩沖液的PH為7. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞表面展示磷脂酶D酵母全細(xì)胞催化劑催化制備磷脂酰絲氨酸的方法，步驟為將全細(xì)胞催化劑加入含有絲氨酸、CaCl2、Triton-X100的醋酸緩沖液中，與含有卵磷脂的氯仿溶液混合均勻，在30℃下混合得到均勻的乳狀液反應(yīng)5-6小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后靜止自然分層，提取有機(jī)相；有機(jī)溶劑揮發(fā)后剩余物經(jīng)氯仿洗滌兩次，即可得到磷脂酰絲氨酸。本發(fā)明利用磷脂酶D的高度專一性，催化卵磷脂和絲氨酸生成磷脂酰絲氨酸，且全細(xì)胞催化劑具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，可重復(fù)使用，有效解決了目前提浸法和化學(xué)合成法存在的問(wèn)題，制備工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/06GK102277394SQ201110206069
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者劉逸寒, 王建玲, 王春霞, 薄嘉鑫, 路福平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)