一種檢測A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測A1和A2型荷斯坦牛的方法及其試劑盒，屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，該方法以待測牛的DNA為模板設(shè)計(jì)專用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增片段經(jīng)EcoT22I酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠檢測DNA片段長度為434bp的牛為A1型牛；酶切后DNA片段為434bp、385bp和49bp為A1和A2雜合型牛；酶切后DNA片段為385bp和49bp為A2型牛。該檢測方法操作便捷、成本低、準(zhǔn)確性高，可以早期篩選A2型奶牛，減少養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。
【專利說明】
-種檢測Al和A2型e-酪蛋白奶牛的方法及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛 的方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛奶品質(zhì)是奶業(yè)發(fā)展的生命，影響奶業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。乳蛋白是構(gòu)成牛奶品 質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，牛奶中的乳蛋白W酪蛋白和乳清蛋白為主。酪蛋白約占牛奶蛋白的 80%，包括alpha sl，alpha s2，beta，kappa四種類型。其中0酪蛋白約占蛋白質(zhì)總量的 3〇%，是氨基酸的重要來源，研究報(bào)道0-酪蛋白有41，42,43,44,8，(：，〇,6爪化，肥，1，6共13 種遺傳變體型化amiAski等，2〇〇7)。41和42型0-酪蛋白是奶牛群體中最常見的兩種，其區(qū)別 在于e-酪蛋白基因發(fā)生了一個(gè)堿基變化，從而導(dǎo)致相應(yīng)位置氨基酸由脯氨酸變成組氨酸。 研究發(fā)現(xiàn)，正是由于上述一個(gè)氨基酸的變化，導(dǎo)致了牛奶在人類消化過程中產(chǎn)生了差異。Al 型牛奶在消化或鮮奶加工過程中某些酶可在其組氨酸處特異性水解，從而形成一種由屯個(gè) 氨基酸組成的膚段，被稱為e-酪啡膚(BCM-7)，而A2型0酪蛋白此處氨基酸為脯氨酸，不能夠 被特異性水解，因此不能形成BCM-7。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，BCM-7能穿過胃腸壁進(jìn)入血液循環(huán)，影響消 化系統(tǒng)和免疫細(xì)胞，可能與一些疾病有關(guān)，如I型糖尿病、呼吸功能障礙、消化系統(tǒng)疾病、免 疫功能素亂和突然性嬰兒死亡綜合征等。近日，國內(nèi)最新研究成果顯示，很多人對(duì)乳糖不耐 受的認(rèn)知存在誤區(qū)，其實(shí)導(dǎo)致他們一喝牛奶就出現(xiàn)腸道反應(yīng)的原因有可能是因?yàn)槟c道對(duì)普 通牛奶中含有的Al蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)而引起的。目前，全球只有新西蘭建立了一家 有權(quán)生產(chǎn)和銷售A2品牌乳制品的公司，其所有的A2牛奶都是通過DNA測序驗(yàn)證。2013年11 月，A2有限公司首次向中國消費(fèi)者推出其A2Platinum白金嬰幼兒配方奶粉系列產(chǎn)品，也在 積極拓展在北美及亞洲的其他市場?？蒞說A2品牌的出現(xiàn)是科研到商業(yè)開發(fā)的一次成功性 突破。
[000引隨著A1、A2牛奶相關(guān)知識(shí)的宣傳和報(bào)道，W及食品安全越來越受到關(guān)注，A2奶將會(huì) 更多地受到消費(fèi)者的青睞。因此，有必要提供一種有效區(qū)分Al型和A2型0-酪蛋白奶牛的方 法。中國專利CN1052919839A公開了一種基于酶切法檢測0-酪蛋白基因型的方法，該方法是 根據(jù)e-酪蛋白的堿基序列設(shè)計(jì)出可W擴(kuò)增出TaqI酶切位點(diǎn)的引物，利用引物對(duì)待檢測的奶 ?；蚪MDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的Al型0-酪蛋白基因片段中產(chǎn)生一個(gè)化ql酶切位點(diǎn)，利 用限制性內(nèi)切酶化ql對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行判斷，含有Al 型e-酪蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在酶切之后就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)218bp的片段和一個(gè)35bp的小片段。 該方法雖然可W實(shí)現(xiàn)e-酪蛋白基因型的檢測，但是該方法在設(shè)計(jì)上游引物時(shí)，創(chuàng)造酶切的 突變位點(diǎn)位于該引物的最后一個(gè)堿基，從該專利的瓊脂糖凝膠電泳圖可W看出，酶切后有 許多其它電泳條帶存在，比較雜亂，可能存在非特性擴(kuò)增現(xiàn)象，且酶切后小片段的長度只有 3化P，片段間長度差別太小，運(yùn)些問題都極易導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性或假陰性的檢測結(jié)果。因此， 需要針對(duì)引物創(chuàng)造性酶切位點(diǎn)的位置、擴(kuò)增條件及酶切體系做相應(yīng)的改善，W滿足快速檢 測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)和大量的試驗(yàn)，得到了能夠用于 檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的方法及其試劑盒，所述檢測方法及其試劑盒的特異性強(qiáng)、靈 敏度高，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛。由此提供了下述發(fā)明：
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種用于檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的引物，所述引物的 序列如下：
[0006] beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3' (沈Q ID NO. 1);
[0007] beta-caseinR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '（SEQ IDNO.2)O
[000引采用上述引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，若PCR擴(kuò)增片段的第49為CC，為Al型牛，PCR擴(kuò) 增片段的序列如SEQ ID NO.3所示;若PCR擴(kuò)增片段的第49為AA，為A2型牛，PCR擴(kuò)增片段的 序列如SEQ ID NO.4所示;若擴(kuò)增片段序列中第49位C和A堿基都存在，則為Al和A2雜合牛。
[0009]上述引物在制備檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的試劑或試劑盒中的應(yīng)用也是本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0010] 本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)思路為：基于beta-casein基因（Ensembl參考序列 ENSBTAT00000003409)C. 2450A突變，并利用PCR-RFLP技術(shù)在上游引物(beta-caseinF)上 創(chuàng)造了一個(gè)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)得到可W擴(kuò)增產(chǎn)生ECOT22I酶切位點(diǎn)的引物。
[0011] 需要說明的是，本發(fā)明中引物的設(shè)計(jì)除了通常引物設(shè)計(jì)所要考慮的退火溫度、GC 含量等方面，更要考慮兩個(gè)重要因素：（1)上游引物所創(chuàng)造的突變位點(diǎn)位置的選擇；（2)酶切 后反應(yīng)產(chǎn)物片段的大小;若酶切后的反應(yīng)產(chǎn)物的片段過小，則在進(jìn)行凝膠電泳檢測時(shí)，條帶 間顯示不清晰或無法區(qū)分顯示，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的檢測結(jié)果，但擴(kuò)增產(chǎn)物也不宜 過長，過長則會(huì)影響擴(kuò)增的效率。
[0012] 本發(fā)明針對(duì)上游引物選擇了不同的突變位點(diǎn)，W及酶切后擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長度， 設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，經(jīng)過試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證后確定本發(fā)明上述所列出的用于檢測Al和A2型0-酪蛋 白奶牛的引物為最佳引物，能夠兼顧檢測的準(zhǔn)確性、特異性和擴(kuò)增效率的需要。其他引物則 難W實(shí)現(xiàn)檢測準(zhǔn)確性和擴(kuò)增效率的兼顧。
[0013] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及一種用于檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的試劑盒，其包含本 發(fā)明的上述引物。
[0014] 上述試劑盒中，還包含hq Master Mix、EcoT22I酶、Buffer緩沖液和DNA Marker。
[0015] 所述!"aq Master Mix是由!"aq DNA 化lymerase(0.0加nits/]il)、MgC12(4mM)、和 dNTPs(0.4mM)構(gòu)成。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中包含：
[0017] 上述引物（10皿〇l/L);2Xl'aq Master Mix;10XH Buffer緩沖液;ECOT22I酶；滅 菌水；2000bp DNA Marker。
[0018] 本發(fā)明的再一方面設(shè)及一種非診斷目的的檢測Al和A2型(6-酪蛋白奶牛的方法，包 括采用上述引物對(duì)待測樣品的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng) 的步驟，W及對(duì)酶切后的片段進(jìn)行凝膠電泳檢測的步驟。
[0019] 所述PCR擴(kuò)增采用25iil反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成為：模板DNA( IOOngAil)化I，上 游引物beta-caseinF( IOumo 1/L)、下游引物beta-caseinR( IOumo 1/L)各0 .化1，2 X Taq MasterMix 12.化1，滅菌水 10.5]il。
[0020] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min;然后94°C變性30s，67°C退火30s，72 °C延伸10s，此步共35個(gè)循環(huán);72°C保持5min。
[0021] 所述酶切反應(yīng)采用酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物IOiil; 10 X皿Uffer緩沖液化1 ;EcoT22I酶化1;滅菌水化1。
[0022] 所述酶切反應(yīng)的反應(yīng)條件為:37 °C消化60min。
[0023] 所述凝膠電泳檢測的步驟具體為:將酶切后的片段用質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝 膠電泳。凝膠電泳檢測酶切DNA片段長度為434bp的待測牛為Al型牛;片段為434bp、38化P和 49bp為Al和A2雜合型牛;385bp和49bp的檢測牛為A2型牛。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明的檢測方法操作快速、準(zhǔn)確性高且費(fèi)用低。同時(shí)根據(jù)檢測方法開發(fā)出檢測 試劑盒，使操作更加標(biāo)準(zhǔn)化，運(yùn)一發(fā)明可W早期檢測Al和A2型荷斯坦牛，消除Al型牛導(dǎo)致的 養(yǎng)牛業(yè)損失，在牛的分子遺傳育種中應(yīng)用前景廣闊，能夠產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益和良好的社 會(huì)效益。
【附圖說明】
[0026] 圖1 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0027] 圖2:利用beta-caseinF和beta-caseinR進(jìn)行分型檢測的3%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖中1:A2型；2:A1型；3:A1 和A2雜合型;Maker:2000bp DNA Marker;
[00巧]圖3:利用beta-caseinF-1和beta-caseinR敏感性試驗(yàn)的結(jié)果圖進(jìn)行分型檢測的 3%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中1:A2型；2:A1型；3:A1和A2雜合型;Maker:2000bp DNA Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照試劑制造廠商所建議的條件;下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明， 均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 實(shí)施例1:檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的方法構(gòu)建
[0031] 1.引物設(shè)計(jì)
[0032] 基于 be 化-casein 基因化 nsembl 參考序列 ENSBTAT0000000：M09)c.245C〉A(chǔ) 突變，并 在上游引物上創(chuàng)造一個(gè)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)針對(duì)含有突變位點(diǎn)的引物，從而產(chǎn)生了ECOT22I酶切 位點(diǎn)。分別設(shè)計(jì)出了多對(duì)引物，采用設(shè)計(jì)出的引物分別對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行ECOT22I酶切和凝膠電泳檢測驗(yàn)證;具體如下：
[0033] (1)從荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取待測牛的總DNA作為目的基因；
[0034] (2)采用設(shè)計(jì)的引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0035] PCR擴(kuò)增采用反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成為:模板DNA( IOOngAil)化1，上游引 物be1:a-caseinF( lOumol/L)、下游引物beta-caseinR( 10皿ol/L)各0.扣1，2 Xhq Master 1;[又12.化1，滅菌水10.5111。
[0036] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min;然后94°C變性30s，67°C退火30s，72°C延 伸IOs，此步共35個(gè)循環(huán);72°C保持5min。
[0037] (3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)；
[003引酶切反應(yīng)采用酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物IOiil; IOXH Buffer緩沖液化1 ;EcoT22I酶化1;滅菌水化1。
[0039] 酶切反應(yīng)的反應(yīng)條件為:37 °C消化60min。
[0040] (4)對(duì)酶切反應(yīng)后的片段進(jìn)行凝膠電泳檢測；
[0041] 凝膠電泳檢測的步驟具體為:將酶切后的片段用質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電 泳。
[0042] 選擇兩組有代表性的引物，其序列分別如下：
[0043] be化-caseinF:5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3';
[0044] be化-case inR:5'-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 \
[0045] be化-caseinF-1:5'-CAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATG-3';
[0046] be化-case inR:5'-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 \
[0047] W上述兩組引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后的凝膠電泳圖分別如圖2和圖3所示， 由圖可W看出，不同引物的擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后，其凝膠電泳的檢測效果不同，Wbeta- caseinF-1和be化-caseinR作為引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，經(jīng)酶切后進(jìn)行凝膠電泳檢測時(shí)，條帶 顯示不清晰，且小的條帶無法進(jìn)行區(qū)分顯示（圖3)，運(yùn)可能是上游引物be化-caseinF-1創(chuàng)造 的酶切突變位點(diǎn)位于該引物的最后一個(gè)堿基或酶切小片段太短（只有35bp)難W區(qū)分引起 的。針對(duì)于此，我們設(shè)計(jì)beta-caseinF上游引物，在此引物的倒數(shù)第二個(gè)堿基創(chuàng)造了酶切突 變位點(diǎn)，且擴(kuò)大了上游引物長度，并相應(yīng)優(yōu)化了檢測方案。
[0048] 因此，經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化篩選確定W下序列作為檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的引物序 列。
[0049] beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3' (沈Q ID NO. 1);
[0050] beta-case inR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '（SEQ ID NO.2)。
[0051] 2.本發(fā)明檢測方法的優(yōu)化
[0化2] 2. IPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0053] 在的PCR反應(yīng)體系中，對(duì)影響反應(yīng)的幾個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度(55~ 75°C)、引物濃度（1~20皿ol/L) W及反應(yīng)時(shí)間和循環(huán)數(shù)等，觀察其對(duì)檢測結(jié)果的影響，確定 最佳退火溫度、引物濃度、反應(yīng)時(shí)間和循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件。
[0054] 結(jié)果表明：最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件為：引物濃度為10皿ol/L、94°C預(yù)變性4min;然后94 。(:變性30s，67°C退火30s，72°C延伸10s，此步共35個(gè)循環(huán);72°C保持5min。^上述PCR反應(yīng)條 件進(jìn)行反應(yīng)的擴(kuò)增效率最高。
[0055] 2.2酶切反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0056] 在的酶切反應(yīng)體系中，對(duì)酶切反應(yīng)的溫度(25-45°C)，消化時(shí)間（30-120min) 進(jìn)行優(yōu)化。
[0057]結(jié)果表明：最優(yōu)的酶切反應(yīng)條件為37°C消化60min。
[005引實(shí)施例2:用于檢測Al和A2型0-酪蛋白奶牛的試劑盒
[0059] 試劑盒的組成包括：引物（10皿OVLhSXhq Master Mix; 10 XH Buffer緩沖液； EcoT22I酶；滅菌水；2000bp DNA Marker。
[0060]引物組為實(shí)施例1中篩選優(yōu)化得到的，其序列為：
[0061 ] beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3' (沈Q ID NO. 1);
[0062] beta-case inR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '（SEQ ID NO.2)。
[0063] hq Master Mix是由hq DNA Polymerase(0.OSunits/山）、MgC12(4mM)、和dNTPs (0.4mM)構(gòu)成。
[0064] 采用該試劑盒進(jìn)行臨床檢測的檢測方法為：
[0065] (1)從荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取待測牛的總DNA;
[0066] (2)采用設(shè)計(jì)的引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0067] ?〇?擴(kuò)增采用25]11反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成為:模板0魁（100]1旨/111)化1，上游引 物be1:a-caseinF(l0皿ol/L)、下游引物beta-caseinR(l0皿ol/L)各0.扣l，2Xl'aqMaster 1;[又12.化1，滅菌水10.5111。
[006引 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min;然后94°C變性30s，67°C退火30s，72°C延 伸IOs，此步共35個(gè)循環(huán);72°C保持5min。
[0069] (3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)；
[0070] 酶切反應(yīng)采用酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的組成為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物IOiil; IOXH Buffer緩沖液化1 ;EcoT22I酶化1;滅菌水化1。
[0071] 酶切反應(yīng)的反應(yīng)條件為:37°C消化60min。
[0072] (4)對(duì)酶切反應(yīng)后的片段進(jìn)行凝膠電泳檢測；
[0073] 凝膠電泳檢測的步驟具體為:將酶切后的片段用質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電 泳，凝膠電泳檢測酶切DNA片段長度為434bp的待測牛為Al型牛;片段為434bp、38化P和49bp 為Al和A2雜合型牛;385bp和49bp的檢測牛為A2型牛。
[0074] 實(shí)施例3:試劑盒的特異性檢測
[00對(duì) W已知基因型的Al, A2，A3，A4型0-酪蛋白奶牛為檢測對(duì)象，采用實(shí)施例2的試劑盒 進(jìn)行檢測，結(jié)果為:Al, A2型0-酪蛋白奶牛在凝膠電泳中能夠跑出相應(yīng)長度的條帶，而A3，A4 型e-酪蛋白奶牛無法跑出相應(yīng)長度的條帶。表明本發(fā)明試劑盒中的引物組、PCR反應(yīng)體系和 檢測方法具有良好的特異性。
[0076] 實(shí)施例4:試劑盒的重復(fù)性檢測
[0077] W已知基因型的Al和A2的型0-酪蛋白奶牛為檢測對(duì)象，采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行 多次重復(fù)試驗(yàn)，多次重復(fù)檢測的結(jié)果均一致，表明本發(fā)明的試劑盒及檢測方法的穩(wěn)定性好。
[0078] 實(shí)施例5:臨床樣本檢測
[0079] 采用本發(fā)明實(shí)施例2的試劑盒對(duì)12頭荷斯坦牛進(jìn)行檢測。
[0080] 根據(jù)上述檢測Al和A2型荷斯坦牛的試劑盒，利用如下步驟PCR擴(kuò)增牛beta-casein 基因片段序列，擴(kuò)增的片段用質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。
[00川（I)PCR 反應(yīng)體系：DNA(IOOngAU)IiU,上，下游引物（lOwnol/L)各 0.5iU，2 X I^qMaster Mix 12.化1，滅菌水 10.5]il。
[0082] (2)PCR 反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 4min;94°C 變性 30s，67°C 退火 30s，72°C 延伸 10s，此 步共35個(gè)循環(huán);72°C保持5min。
[0083] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測：取化1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測顯示12 個(gè)泳道的DNA樣品均為單一的條帶，大小為434bp，與目的片段大小一致。
[0084] 3. PCR產(chǎn)物的酶切分型檢測
[0085] (1)20山酶切體系：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物IOiil; 10XH Buffer緩沖液化l;EcoT22I酶化1;滅 菌水化K37°C酶切60min。
[0086] (2)電泳檢測：用質(zhì)量濃度為3%瓊脂糖凝膠對(duì)酶切后的產(chǎn)物共計(jì)20iU進(jìn)行電泳檢 電壓90V;時(shí)間40min。
[0087] 4.基因分型與結(jié)果分析:A1型、A2型和雜合型牛的分型結(jié)果如下表1所示。
[008引總共檢測了 12頭何斯坦牛，其中共有2頭牛酶切后DNA片段為434bp，為Al型牛;3頭 DNA片段為434bp、38化P和49bp為Al和A2雜合型牛;7頭38化P和49bp的檢測牛為A2型牛。
[0089] 表1.牛be1:a-casein 分型結(jié)果
[0090]
[0091] 所有的樣本均經(jīng)過直接測序檢測驗(yàn)證，結(jié)果與采用本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果完全 一致，準(zhǔn)確率達(dá)100%，說明本發(fā)明的試劑盒及其檢測方法準(zhǔn)確、有效，特異性強(qiáng)，檢測結(jié)果 無假陽性和假陰性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測Al和A2型β-酪蛋白奶牛的引物，其特征在于，所述引物的序列為： beta-caseinF:5 '-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3 '； beta-caseinR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '。2. 權(quán)利要求1所述的引物在制備檢測Al和A2型β-酪蛋白奶牛的試劑或試劑盒中的應(yīng) 用。3. -種用于檢測Al和Α2型β-酪蛋白奶牛的試劑盒，其包含權(quán)利要求1所述的引物。4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中，還包含Taq Master Mix、 EcoT22 頂每、Buffer緩沖液和DNA Marker。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述Taq Master Mix是由Taq DNA Polymerase(0 · 05units/yl)、MgCl2(4mM)、和dNTPs(0.4mM)構(gòu)成。6. -種非診斷目的的檢測Al和A2型β-酪蛋白奶牛的方法，其特征在于，包括采用權(quán)利 要求1所述的引物對(duì)待測樣品的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反 應(yīng)的步驟，以及對(duì)酶切后的片段進(jìn)行凝膠電泳檢測的步驟。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增采用25μ1反應(yīng)體系，反應(yīng)體系的 組成為：模板DNA ΙμL，上游引物beta-caseinF、下游引物beta-caseinR各O · 5μ1，2 X Taq Master Mix 12.5μ1，滅菌水 10.5μ1。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 4min;然后94°C變性30s，67°C退火30s，72°C延伸IOs，共35個(gè)循環(huán)；72°C保持5min。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶切反應(yīng)采用20μ1酶切反應(yīng)體系，反應(yīng) 體系的組成為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μ1; 10 XH Buffer緩沖液2μ1 ;EcoT22頂每ΙμL;滅菌水7μ1。10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述凝膠電泳檢測的步驟為:將酶切后的片 段用質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。凝膠電泳檢測酶切DNA片段長度為434bp的待測牛 為Al型牛;片段為434bp、385bp和49bp為Al和A2雜合型牛;385bp和49bp的檢測牛為A2型牛。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105925717SQ201610522855
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】王秀革, 黃金明, 都彥伶, 姜強(qiáng), 張燕, 鞠志花, 王長法, 孫艷, 仲躋峰
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心