一種粉枝莓SCoT分子標記的PCR反應體系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種粉枝莓SCoT分子標記的PCR反應體系，該PCR反應體系的組成和含量如下：dNTPs 0.125mmol·L?1，Taq DNA聚合酶0.75U，引物1.0μmol·L?1，Mg2+0.625mmol·L?1，模板40ng，余量為水，退火溫度51℃，上述總量為20.0μL。本發(fā)明還公開了一種粉枝莓SCoT分子標記的PCR反應程序。本發(fā)明所建立的粉枝莓SCoT?PCR反應體系擴增出的條帶穩(wěn)定性高，清晰度高，具有很高的多態(tài)性的特點。彌補了國內對粉枝莓遺傳多樣性研究的不足。
【專利說明】
-種粉枝章 SCoT分子標巧的PCR反應體系
技術領域
[0001] 本申請屬于生物技術領域，具體地說，設及一種粉枝替SCoT分子標記的PCR反應體 系。
【背景技術】
[0002] 粉枝替(Rubus bifIorus Buch)是菩薇科懸鉤子屬植物中的一種落葉性野生果 木，在西藏的分布主要集中于拉薩、林芝等地。其果實味甜，聚合漿果，橘紅色，營養(yǎng)成分含 量豐富，有機酸及鐵和鋒等微量元素含量均高于普通水果，蛋白質和維生素含量也遠高于 普通水果，除用于生食外，也可W釀酒，制作果汁、果醬等，具有較高的開發(fā)利用價值。目前， 對粉枝替的研究主要集中在資源調查、營養(yǎng)成分和活性成分分析方面，而關于粉枝替遺傳 多樣性研究未見報道。因此，開展粉枝替遺傳多樣性研究，不僅在理論上有助于加深我們對 粉枝替的了解，為運一野生果樹資源的應用和推廣提供理論依據，使其能更廣泛地應用于 農業(yè)生產，而且有助于對優(yōu)異基因資源進行深入的評價、挖掘和利用，提高果實產量和改善 品質。
[0003] 目標起始密碼子多態(tài)性標記(SCoT)具有操作簡單、多態(tài)性高、重復性好、引物通用 性強等優(yōu)點，且能有效產生和性狀連鎖的標記。目前，SCoT標記已廣泛應用于批把、葡萄、龍 眼等資源的種質資源、遺傳多樣性分析。目前，關于粉枝替SCoT-PCR反應體系的建立尚無報 道。

【發(fā)明內容】

[0004] 有鑒于此，本申請針對上述的問題，提供了一種粉枝替SCoT分子標記的PCR反應體 系，本發(fā)明W粉枝替為材料，建立并優(yōu)化粉枝替SCoT-PCR分子標記的反應體系，W期為粉枝 替種質資源的遺傳多樣性分析奠定基礎。
[0005] 為了解決上述技術問題，本申請公開了一種粉枝替SCoT分子標記的PCR反應體系， 該PCR反應體系的組成和含量如下:dNTPs 0.1化mmol *[1，化q DNA聚合酶0.75U，引物1.化 mol ? L-I，Mgh0.6化mmol ? L-I，模板4化g，余量為水，退火溫度5rC，上述總量為20.0化。
[0006] 進一步地，引物為SC2,其核巧酸序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0007] 本申請還公開了一種粉枝替SCoT分子標記的PCR反應程序，該程序為:94°C 3min， 94 °C 30s，50-56 °C 退火 45s，68 °C Imin，35 個循環(huán)，68 °C 5min，12 °C 保存。
[000引與現(xiàn)有技術相比，本申請可W獲得包括W下技術效果：
[0009] 1)本發(fā)明是首次建立粉枝替SCoT-PCR反應體系，本發(fā)明提供的粉枝替SCoT-PCR反 應體系具有操作簡單、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，能夠實現(xiàn)對粉枝替遺傳多樣性的分析， 將有效彌補國內對粉枝替遺傳多樣性研究的不足。
[0010] 2)本發(fā)明所建立的粉枝替SCoT-PCR反應體系擴增出的條帶穩(wěn)定性高，清晰度高， 具有很高的多態(tài)性的特點。彌補了國內對粉枝替遺傳多樣性研究的不足。
[0011] 3)本發(fā)明可用于粉枝替遺傳關系、分子標記方面的研究，在粉枝替優(yōu)異基因資源 評價、挖掘和利用W及提高其果實產量和改善品質方面具有很大的科學價值和應用價值。
[0012] 當然，實施本申請的任一產品必不一定需要同時達到W上所述的所有技術效果。
【附圖說明】
[0013] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：
[0014] 圖1是本申請粉枝替基因組DNA電泳譜圖，其中，M:DNA Marker; 1~9.9份隨機選取 的粉枝替材料基因組DNA;
[001引圖2是本申請粉枝替SCoT-PCR反應體系擴增結果，其中，M: DNAMarker; 1~36:粉枝 替SCoT-PCR反應體系36個處理組合；
[0016] 圖3是本申請8份粉枝替樣品SCoT-PCR擴增結果（引物SC35)，其中，M: DNA Marker; 1~8:8份隨機選取的粉枝替材料基因組DM。
【具體實施方式】
[0017] W下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用 技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據W實施。
[0018] 材料與試劑:供試植物材料為粉枝替，于2015年8月采自西藏自治區(qū)林芝市色季拉 山。野外采集健康無病害幼嫩葉片，放于硅膠中干燥封存，運回實驗室后放于-70°C冰箱保 存，提取DNA備用。本試驗所用SCoT引物參照（Collard B C Y，Mackill D J.Start codon t曰rgeted(SCoT)polymorphism:曰 simple,novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J].Plant Mol Biol Rep,2009,27:86-93.)的報道， 由華大基因科技有限公司負責合成。TaqDNA聚合酶、dNTPs混合液、10XPCRBuffer(Mg2+ free)購自肥B公司。其余試劑為國產分析純。
[0019] 實施例1粉枝替SCoT分子標記的PCR反應體系建立方法
[0020] 1實驗方法
[0021] 1.1基因組DNA的提取與檢測
[0022] 粉枝替植物基因組DNA的提取采用改良的CTAB法(李金踰，王碩，于猜，王玲，&周世 良.（2013). -種改良的植物DNA提取方法.植物學報，48( 1)，72-78.) dDNA濃度和質量通過 分光光度計測定，并取適量樣品于0.8%的瓊脂糖電泳檢測，其余DNA樣品于-20°C冰箱中保 存?zhèn)溆谩?br>[0023] 1.2SCOT-PCR反應體系的優(yōu)化
[0024] 反應體系確定為20化，先W預擴增較好的引物SC2(5/ -CAACAATGGCTACCACCC-3/， 其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示)作為粉枝替基因組DNA擴增體系建立的初選引物，Taq酶 (抓/化)0.15化，DNA模板40ng。W此為基礎將引物、Mg2+、dNTPs、退火溫度等4個影響因素進 行濃度梯度設置(表1)。
[0025] 表1粉枝替SCoT-PCR擴增體系各成分優(yōu)化試驗設計(2化L)
[00261
[0027] 1.3PCR擴增與擴增產物的檢測
[002引 PCR擴增程序：94°C3min，94°C30s ,(51-56) °C退火45s，68°Clmin(35個循環(huán)），68°C 5min，12°C保存。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，邸染色，在凝膠成像系統(tǒng)成像。
[00巧]2結果與分析
[0030] 2.1粉枝替基因組DNA的檢測
[0031] 用改良CTAB法提取粉枝替基因組DNA的0D260/280值在1.67~1.98之間；瓊脂糖電 泳檢測結果（圖1)顯示，樣品DNA為一條清晰完整的條帶，沒有明顯的拖尾，也沒有RNA條帶。 結果說明所提的DNA純度較高，可用于SCoT體系的優(yōu)化及后續(xù)實驗。
[0032] 2.2粉枝替SCoT-PCR反應體系優(yōu)化結果
[0033] 粉枝替SCoT-PCR條件優(yōu)化設置見表2，SCoT-PCR優(yōu)化試驗擴增結果見圖2,36個處 理中除16號處理外，其他均有譜帶產生，32號和33號擴增譜帶清晰、多態(tài)性高，基本符合 SCoT分析的要求。最終選取33號處理作為最佳擴增體系，即：SCoT-PCR 20.0化反應體系中， (1^口3 0.125111111〇1.[1，化90魁聚合酶0.751]，引物1.0皿〇1.[1，]\%2+0.625臟〇1.[1，模板 40ng，退火溫度51°C。
[0034] 表2粉枝替SCoT-PCR條件優(yōu)化設置
[0035]
[0036] 3結果與討論
[0037] SCoT標記技術具有較高的多態(tài)性，已廣泛應用于物種遺傳多樣性研究。但是，SCoT 標記的PCR擴增結果受反應體系、物種等條件的影響較大。雖然不少學者已經對多種植物的 SCoT-PCR體系進行了優(yōu)化，為相應物種的遺傳多樣性、親緣關系等研究提供了參考，但不同 物種對其各個影響因素的濃度要求不一樣，因此針對不同的物種材料，仍需對其PCR反應體 系進行優(yōu)化。
[0038] 因此，在利用SCoT分子標記分析粉枝替遺傳多樣性之前，對SCoT-PCR反應體系進 行優(yōu)化是非常必要的。該研究從引物、dNTPs、Mg2+濃度W及退火溫度4個因素，對SCoT-PCR反 應體系進行了優(yōu)化。最終確定：SCOT-PCR20.化L最佳反應體系中，dNTPs 0.125mmol ? L-1， Taq DNA聚合酶0.75U，引物1.0皿〇1 ? L-i，Mg2+0.6化mmol ? [1，模板40ng，退火溫度51°C。
[0039] 實施例2粉枝替SCoT分子標記的的PCR反應體系的應用例
[0040] W最佳SCoT-PCR反應體系為基礎，采用SC35(5' -CATGGCTACCACCGGCCC-3'，其核巧 酸序列如SEQ ID NO. 2所示）引物對8份隨機選擇的粉枝替樣品進行擴增。
[0041] 通過對8份隨機選擇的粉枝替樣品進行擴增，結果（圖3)顯示，8份樣品均得到有效 擴增，擴增所得條帶清晰，即所建立的粉枝替SCoT-PCR反應體系穩(wěn)定。
[0042] 上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非 局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改 和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行 改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權 利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種粉枝莓SCoT分子標記的PCR反應體系，其特征在于，該PCR反應體系的組成和含 量如下：dNTPs 0.125mmol · L-1Jaq DNA 聚合酶 0.75U，引物 l.Oymol · L-lMghOASSmmol · L一1，模板40ng，余量為水，退火溫度51°C，上述總量為20.0 yL。2. 根據權利要求1所述的粉枝莓SCoT分子標記的PCR反應體系，其特征在于，所述引物 為SC2,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -種粉枝莓SCoT分子標記的PCR反應程序，其特征在于，該程序為：94°C3min，94°C 3〇8,51-56°(：退火458,68°(：1111丨11，35個循環(huán)，681€5111丨11，12°(：保存。
【文檔編號】C12N15/10GK105925709SQ201610461040
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】袁雷, 鐘政昌, 劉瑜, 張立, 謝博, 曹東星
【申請人】西藏大學農牧學院