一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法
一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法。該方法先用殼聚糖和甲殼素的混合物吸附分離得到烏司他丁粗品，然后將粗品與海藻酸鹽混合后依次進行超濾、陰離子交接樹脂純化、超濾，最后將超濾后得到的截留液冷凍干燥，得到烏司他丁純品。由本申請?zhí)峁┑幕陉庪x子交換樹脂純化烏司他丁的方法，縮短了純化工藝，烏司他丁的收率和純度高，其中，烏司他丁的收率達到87％；比活力達到4900IU/mg蛋白。
【專利說明】
一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 烏司他丁系從男性尿中分離純化出的一種酸性糖蛋白。據(jù)文獻報道，其是由143個 氨基酸組成，在第10位絲氨酸和45位天冬氨酸上有糖鏈，結(jié)構(gòu)表面含有大量非極性疏水基 團，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等。烏司他丁的分子量經(jīng)HPLC法測定為60~70KD，經(jīng) SDS-PAGE測定為40~50KD，等電點位于2-3之間。
[0003] 由于結(jié)構(gòu)中的兩個活性功能區(qū)均具有很廣的抑酶譜，所以能同時抑制胰蛋白酶、 磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性;而且，烏司他丁分解形成的低分 子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用。烏司他丁不僅是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，還 具有抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生、改善休克時的循環(huán)狀態(tài)、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制炎癥介質(zhì)的釋 放等功能。大量臨床試驗結(jié)果顯示，烏司他丁在治療急性胰腺炎、輔助治療休克、改善手術(shù) 刺激引起的免疫功能下降、尤其是減少體外循環(huán)并發(fā)癥等方面有重要的作用，加上其本身 來源于人體，無免疫原性，安全性高。
[0004] 但由于尿液中烏司他丁的含量較少，其分離及純化工藝成為制約其應用的關(guān)鍵因 素。
[0005] 關(guān)于烏司他丁的分離及純化方法，國內(nèi)報道較少。經(jīng)檢索，已公開的中國專利申請 文獻僅21篇。由青島康原藥業(yè)有限公司公開的中國專利申請CN2015108204251《一種樹脂再 生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物》和 CN2014108077092《一種樹脂再生提高柱效烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物》 均利用陰離子交換柱、親和層析柱及超濾相結(jié)合的方法對烏司他丁粗品進行純化的方法。
【申請人】在之前的專利文獻CN2006100002002《純化的烏司他丁及其制備方法和含有該烏司 他丁的藥物組合物》中采用陰離子交換柱、超濾和金屬螯合柱、疏水柱和凝膠柱結(jié)合對烏司 他丁粗品進行純化。
[0006] 上述公開的烏司他丁的純化方法均采用多次樹脂柱進行純化。但對于一定體積的 尿液，純化工藝越復雜，在一定程度上可以提高烏司他丁的純度，而烏司他丁的收率卻受到 影響。如何協(xié)調(diào)烏司他丁的純化工藝與其收率及純度的關(guān)系，成為科研人員亟待解決的問 題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種基于陰離子交換樹脂 純化烏司他丁的方法，以在保證烏司他丁的純度和收率的同時，減化其純化工藝，達到節(jié)約 成本、減少時間和人力成本的目的。
[0008] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的 方法，其具體步驟如下：
[0009] 1)取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，加入硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5， 繼續(xù)向濾液中加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析， 靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0010] 2)向烏司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，向溶液 中加入海藻酸鹽，攪拌，靜置，離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH 至6-6.5,超濾，得截留液1;
[0011] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH=6-6.5,將其上陰離子交換樹脂，然后用pH=6-6.5的磷酸鹽 緩沖液和〇. 8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1;
[0012] 4)將洗脫液1超濾，得截留液2;
[0013] 5)將截留液27令凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?br>[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法，其具體步驟如 下：
[0015] 1)取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅膠的比例加入硅膠，攪 拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5,繼續(xù)向濾液中以每t尿液加入8-12kg殼聚糖-甲殼素混 合物的比例加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜 置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0016] 2)向烏司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向 溶液中以烏司他丁粗品：海藻酸鹽=1: (〇. 〇 1-0.03)的比例加入海藻酸鹽，攪拌，靜置，離 心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH至6-6.5，超濾得截留液1;其中， 超濾的條件為:壓力為〇 · 2-0 · 6MPa、溫度為4-30°C、截留分子量為5 X 104-7 X 104;
[0017] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH至6-6.5，將其以8〇-12〇111171^11的速度通過陰離子交換樹脂， 然后用pH=6-6.5的磷酸鹽緩沖液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1;
[0018] 4)將洗脫液1在壓力為0.1-0.5MPa、溫度為4-30°C、截留分子量為3 X104的條件下 超濾，得截留液2;
[0019] 5)將截留液27令凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?br>[0020] 優(yōu)選地，步驟1)所述殼聚糖與甲殼素的質(zhì)量比為(3-8):1，所述殼聚糖的脫乙酰度 大于95%，分子量為8萬-15萬；
[0021] 優(yōu)選地，超濾所用的超濾膜為聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纖維素膜、醋酸纖維素膜、 聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一種或至少兩種的復合膜；
[0022]進一步優(yōu)選為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合膜。
[0023]優(yōu)選地，所述超濾膜的結(jié)構(gòu)為中空纖維式、平板式、管式和卷式中的一種;進一步 優(yōu)選為內(nèi)壓式中空纖維超濾膜。
[0024] 優(yōu)選地，步驟2)中所述的海藻酸鹽為海藻酸鈉或海藻酸鉀，分子量為2萬-5萬。
[0025] 優(yōu)選地，步驟3)中所述的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀緩沖液。
[0026] 優(yōu)選地，步驟3)中所述的陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離 子交換樹脂的混合物；
[0027] 進一步優(yōu)選地，強堿性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、 Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一種；
[0028] 弱喊性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68 和Amberlite IRA63中的至少一種。
[0029] 進一步優(yōu)選地，強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離子交換樹脂質(zhì)量比為(3-10) :1〇
[0030] 優(yōu)選地，步驟4)中截留液2的體積為洗脫液1體積的1/10-1/20。
[0031] 其中，步驟1)中操作"氨水洗脫、硫酸銨鹽析、靜置、沉淀、干燥"按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù) 手段進行。
[0032] 超濾過程中每隔2-3小時對濾膜進行反洗。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請所提供的基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法具有 如下優(yōu)點：
[0034] (1)利用殼聚糖與甲殼素的混合物進行吸附，提高了烏司他丁的收率。
[0035] (2)利用海藻酸鹽與酸性糖蛋白（烏司他?。┑撵o電吸附作用，增大超濾膜的截留 分子量，同時可除去與烏司他丁分子量較接近的雜質(zhì)分子，提高了超濾的精確度。
[0036] (3)本申請采用強、弱陰離子交換樹脂混合的方法，與單獨采用一種樹脂相比，提 高了產(chǎn)物的純化效率。
[0037] (4)本申請純化工藝簡單，且烏司他丁的比活力高達到4900IU/mg蛋白（1個IU的定 義為：以BAEE為底物，在25度時，每分鐘使△ A253增加0.001所需的烏司他丁的量）；收率高達 87%〇
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述。這些實施例僅是出于解釋說明的目的， 而不限制本發(fā)明的范圍和實質(zhì)。
[0039] 實施例1
[0040] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6,加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3， 繼續(xù)向濾液中加入8kg殼聚糖-甲殼素混合物(殼聚糖：甲殼素= 3:1)，攪拌至吸附完全，依 次氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0041 ] 2)向烏司他丁粗品中加入pH= 5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶液 中以烏司他丁粗品:海藻酸鈉= 1:0.01的比例加入海藻酸鈉(分子量為2萬），攪拌，靜置，離 心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH=6,超濾得截留液1;其中，超濾 的壓力為0 · 2MPa、溫度為30°C、截留分子量為5 X 104;
[0042] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH=6,將其以80mL/min的速度通過陰離子交換樹脂(Amberlite IRA400:Amberlite IRA63質(zhì)量比為 10:1)，然后用pH=6的NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液和2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1，
[0043] 4)將洗脫液1在壓力為O.IMPa的條件下，用截留分子量為3X104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/20，
[0044] 5)將截留液2冷凍干燥，所得白色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0045] 其中，本實施例所用超濾膜為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合膜(聚醚砜膜和醋 酸纖維素膜的活化層同向設(shè)置），膜結(jié)構(gòu)為內(nèi)壓式中空纖維超濾膜;超濾膜的具體結(jié)構(gòu)參數(shù) 及超濾具體工藝采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段。
[0046] 實施例2
[0047] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6.5,加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至 5,繼續(xù)向濾液中加入12kg殼聚糖-甲殼素混合物(殼聚糖：甲殼素= 8:1)，攪拌至吸附完全， 依次氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0048] 2)向烏司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶 液中以烏司他丁粗品：海藻酸鈉=1:0.03的比例加入海藻酸鈉(分子量為5萬），攪拌，靜置， 離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH = 6.5，超濾得截留液1;其中， 超濾的壓力為〇. 2MPa、溫度為30°C、截留分子量為5 X 104;
[0049] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH = 6,將其以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂 (Amberlite IRA400:Amberlite IRA402:Amberlite IRA63質(zhì)量比5:5:1)，然后用pH = 6的 NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1，
[0050] 4)將洗脫液1在壓力為O.IMPa的條件下，用截留分子量為3X104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/10，
[0051] 5)將截留液2冷凍干燥，所得白色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0052]其中，本實施例所用超濾膜為聚偏氟乙烯膜，具體結(jié)構(gòu)參數(shù)及超濾具體工藝同實 施例1。
[0053] 實施例3
[0054] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6.5,加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至 5,繼續(xù)向濾液中加入12kg殼聚糖-甲殼素混合物(殼聚糖：甲殼素= 5:1)，攪拌至吸附完全， 依次氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0055] 2)向烏司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶 液中以烏司他丁粗品：海藻酸鈉=1:0.01的比例加入海藻酸鈉(分子量為2萬），攪拌，靜置， 離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH=6,超濾得截留液1;其中，超 濾的壓力為〇. 5MPa、溫度為25°C、截留分子量為7 X 104;
[0056] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH=6,將其以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和lmol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗 脫液1，
[0057] 4)將洗脫液1在壓力為O.IMPa的條件下，用截留分子量為3 X104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/10，
[0058] 5)將截留液2冷凍干燥，所得白色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0059] 其中，本實施例所用超濾膜為聚偏氟乙烯膜，具體結(jié)構(gòu)參數(shù)及超濾具體工藝同實 施例1。
[0060] 實施例4
[0061] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6,加入8kg甲殼素，攪拌至吸附完全，依次氨水洗脫、硫 酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0062] 2)向烏司他丁粗品中加入pH=5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，得混合液1;
[0063] 調(diào)節(jié)混合液1的pH = 6,將其以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗 脫液1;
[0064] 3)將洗脫液1濃縮至原體積的1/30,以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂 Amber 1 ite IRA63，然后用pH = 6的NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液和2mo 1/L NaCl的混合溶液進行 洗脫，得洗脫液2;
[0065] 4)將洗脫液2在壓力為0 . IMPa的條件下，用截留分子量為3 X 104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/20;
[0066] 5)將截留液2冷凍干燥，所得淡黃色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0067] 實施例5:結(jié)果表征：
[0068]對實施例1-4回收得到的烏司他丁純品的收率、活性、純度及人尿激肽原酶的含量 進行測定，具體結(jié)果如下表1。
[0069]其中，取實施例1-4制得的烏司他丁純品采用《中國藥典》（2010)烏司他丁項目下 的激肽原酶含量方法進行測定。
[0070] 表1實施例1-4分離純化得到的烏司他丁的收率、活性、純度及人尿激肽原酶的含 量測定結(jié)果
[0071]
[0072] 上述實施例僅作為解釋本發(fā)明的目的，本發(fā)明的范圍不受此限制。對本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說所做的修改是顯而易見的，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求范圍的限制。
【主權(quán)項】
1. 一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法，其具體步驟如下： 1) 取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，加入硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5，繼續(xù) 向濾液中加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜 置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品； 2) 向烏司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，向溶液中加 入海藻酸鹽，攪拌，靜置，離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH至6-6.5,超濾，得截留液1; 3) 調(diào)節(jié)截留液1的pH至6-6.5,將其上陰離子交換樹脂，然后用pH = 6-6.5的磷酸鹽緩沖 液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1; 4) 將洗脫液1超濾，得截留液2; 5) 將截留液2冷凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法具體步驟如下： 1) 取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅膠的比例加入硅膠，攪拌，過 濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5,繼續(xù)向濾液中以每t尿液加入8-12kg殼聚糖-甲殼素混合物 的比例加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、 沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品； 2) 向烏司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶液 中以烏司他丁粗品:海藻酸鹽=1:(0.01-0.03)的比例加入海藻酸鹽，攪拌，離心，得下層沉 淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH至6-6.5，超濾，得截留液1;超濾條件為:壓力 為0.2-0.6MPa、溫度為4-30 °C、截留分子量為5 X 104-7 X 104; 3) 調(diào)節(jié)截留液1的pH至6-6.5，將其以8〇-12〇111171^11的速度通過陰離子交換樹脂，然后 用pH=6-6.5的磷酸鹽緩沖液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1; 4) 將洗脫液1在壓力為0.1-0.5MPa、溫度為4-30°C、截留分子量為3 X 104的條件下超濾， 得截留液2; 5) 將截留液2冷凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，超濾所用的超濾膜為聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纖維 素膜、醋酸纖維素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一種或至少兩種的復合膜;所述超濾膜的 結(jié)構(gòu)為中空纖維式、平板式、管式和卷式中的一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述超濾膜為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合 膜;所述超濾膜的結(jié)構(gòu)為內(nèi)壓式中空纖維超濾膜。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟1)中所述的殼聚糖與甲殼素的質(zhì)量比為 (3-8): 1，所述殼聚糖的脫乙酰度大于95%，分子量為8-15萬；步驟2)中所述的海藻酸鹽為 海藻酸鈉或海藻酸鉀，分子量為2-5萬。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟3)中所述的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉 或磷酸氫二鉀緩沖液； 步驟3)中所述的陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離子交換樹脂 的混合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述的強堿性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一種； 所述的弱喊性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68和Amberlite IRA63中的至少一種。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述的強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離 子交換樹脂質(zhì)量比為(3-10): 1。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟4)中的截留液2的體積為洗脫液1體積的 1/10-1/20。
【文檔編號】C07K1/30GK105837685SQ201610323339
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】王旭, 鄭少亮, 田友軍, 肖益熱
【申請人】廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法。該方法先用殼聚糖和甲殼素的混合物吸附分離得到烏司他丁粗品，然后將粗品與海藻酸鹽混合后依次進行超濾、陰離子交接樹脂純化、超濾，最后將超濾后得到的截留液冷凍干燥，得到烏司他丁純品。由本申請?zhí)峁┑幕陉庪x子交換樹脂純化烏司他丁的方法，縮短了純化工藝，烏司他丁的收率和純度高，其中，烏司他丁的收率達到87％；比活力達到4900IU/mg蛋白。
【專利說明】
一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 烏司他丁系從男性尿中分離純化出的一種酸性糖蛋白。據(jù)文獻報道，其是由143個 氨基酸組成，在第10位絲氨酸和45位天冬氨酸上有糖鏈，結(jié)構(gòu)表面含有大量非極性疏水基 團，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等。烏司他丁的分子量經(jīng)HPLC法測定為60~70KD，經(jīng) SDS-PAGE測定為40~50KD，等電點位于2-3之間。
[0003] 由于結(jié)構(gòu)中的兩個活性功能區(qū)均具有很廣的抑酶譜，所以能同時抑制胰蛋白酶、 磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性;而且，烏司他丁分解形成的低分 子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用。烏司他丁不僅是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，還 具有抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生、改善休克時的循環(huán)狀態(tài)、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制炎癥介質(zhì)的釋 放等功能。大量臨床試驗結(jié)果顯示，烏司他丁在治療急性胰腺炎、輔助治療休克、改善手術(shù) 刺激引起的免疫功能下降、尤其是減少體外循環(huán)并發(fā)癥等方面有重要的作用，加上其本身 來源于人體，無免疫原性，安全性高。
[0004] 但由于尿液中烏司他丁的含量較少，其分離及純化工藝成為制約其應用的關(guān)鍵因 素。
[0005] 關(guān)于烏司他丁的分離及純化方法，國內(nèi)報道較少。經(jīng)檢索，已公開的中國專利申請 文獻僅21篇。由青島康原藥業(yè)有限公司公開的中國專利申請CN2015108204251《一種樹脂再 生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物》和 CN2014108077092《一種樹脂再生提高柱效烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物》 均利用陰離子交換柱、親和層析柱及超濾相結(jié)合的方法對烏司他丁粗品進行純化的方法。
【申請人】在之前的專利文獻CN2006100002002《純化的烏司他丁及其制備方法和含有該烏司 他丁的藥物組合物》中采用陰離子交換柱、超濾和金屬螯合柱、疏水柱和凝膠柱結(jié)合對烏司 他丁粗品進行純化。
[0006] 上述公開的烏司他丁的純化方法均采用多次樹脂柱進行純化。但對于一定體積的 尿液，純化工藝越復雜，在一定程度上可以提高烏司他丁的純度，而烏司他丁的收率卻受到 影響。如何協(xié)調(diào)烏司他丁的純化工藝與其收率及純度的關(guān)系，成為科研人員亟待解決的問 題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種基于陰離子交換樹脂 純化烏司他丁的方法，以在保證烏司他丁的純度和收率的同時，減化其純化工藝，達到節(jié)約 成本、減少時間和人力成本的目的。
[0008] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的 方法，其具體步驟如下：
[0009] 1)取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，加入硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5， 繼續(xù)向濾液中加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析， 靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0010] 2)向烏司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，向溶液 中加入海藻酸鹽，攪拌，靜置，離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH 至6-6.5,超濾，得截留液1;
[0011] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH=6-6.5,將其上陰離子交換樹脂，然后用pH=6-6.5的磷酸鹽 緩沖液和〇. 8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1;
[0012] 4)將洗脫液1超濾，得截留液2;
[0013] 5)將截留液27令凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?br>[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法，其具體步驟如 下：
[0015] 1)取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅膠的比例加入硅膠，攪 拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5,繼續(xù)向濾液中以每t尿液加入8-12kg殼聚糖-甲殼素混 合物的比例加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜 置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0016] 2)向烏司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向 溶液中以烏司他丁粗品：海藻酸鹽=1: (〇. 〇 1-0.03)的比例加入海藻酸鹽，攪拌，靜置，離 心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH至6-6.5，超濾得截留液1;其中， 超濾的條件為:壓力為〇 · 2-0 · 6MPa、溫度為4-30°C、截留分子量為5 X 104-7 X 104;
[0017] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH至6-6.5，將其以8〇-12〇111171^11的速度通過陰離子交換樹脂， 然后用pH=6-6.5的磷酸鹽緩沖液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1;
[0018] 4)將洗脫液1在壓力為0.1-0.5MPa、溫度為4-30°C、截留分子量為3 X104的條件下 超濾，得截留液2;
[0019] 5)將截留液27令凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?br>[0020] 優(yōu)選地，步驟1)所述殼聚糖與甲殼素的質(zhì)量比為(3-8):1，所述殼聚糖的脫乙酰度 大于95%，分子量為8萬-15萬；
[0021] 優(yōu)選地，超濾所用的超濾膜為聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纖維素膜、醋酸纖維素膜、 聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一種或至少兩種的復合膜；
[0022]進一步優(yōu)選為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合膜。
[0023]優(yōu)選地，所述超濾膜的結(jié)構(gòu)為中空纖維式、平板式、管式和卷式中的一種;進一步 優(yōu)選為內(nèi)壓式中空纖維超濾膜。
[0024] 優(yōu)選地，步驟2)中所述的海藻酸鹽為海藻酸鈉或海藻酸鉀，分子量為2萬-5萬。
[0025] 優(yōu)選地，步驟3)中所述的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀緩沖液。
[0026] 優(yōu)選地，步驟3)中所述的陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離 子交換樹脂的混合物；
[0027] 進一步優(yōu)選地，強堿性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、 Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一種；
[0028] 弱喊性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68 和Amberlite IRA63中的至少一種。
[0029] 進一步優(yōu)選地，強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離子交換樹脂質(zhì)量比為(3-10) :1〇
[0030] 優(yōu)選地，步驟4)中截留液2的體積為洗脫液1體積的1/10-1/20。
[0031] 其中，步驟1)中操作"氨水洗脫、硫酸銨鹽析、靜置、沉淀、干燥"按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù) 手段進行。
[0032] 超濾過程中每隔2-3小時對濾膜進行反洗。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請所提供的基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法具有 如下優(yōu)點：
[0034] (1)利用殼聚糖與甲殼素的混合物進行吸附，提高了烏司他丁的收率。
[0035] (2)利用海藻酸鹽與酸性糖蛋白（烏司他?。┑撵o電吸附作用，增大超濾膜的截留 分子量，同時可除去與烏司他丁分子量較接近的雜質(zhì)分子，提高了超濾的精確度。
[0036] (3)本申請采用強、弱陰離子交換樹脂混合的方法，與單獨采用一種樹脂相比，提 高了產(chǎn)物的純化效率。
[0037] (4)本申請純化工藝簡單，且烏司他丁的比活力高達到4900IU/mg蛋白（1個IU的定 義為：以BAEE為底物，在25度時，每分鐘使△ A253增加0.001所需的烏司他丁的量）；收率高達 87%〇
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述。這些實施例僅是出于解釋說明的目的， 而不限制本發(fā)明的范圍和實質(zhì)。
[0039] 實施例1
[0040] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6,加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3， 繼續(xù)向濾液中加入8kg殼聚糖-甲殼素混合物(殼聚糖：甲殼素= 3:1)，攪拌至吸附完全，依 次氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0041 ] 2)向烏司他丁粗品中加入pH= 5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶液 中以烏司他丁粗品:海藻酸鈉= 1:0.01的比例加入海藻酸鈉(分子量為2萬），攪拌，靜置，離 心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH=6,超濾得截留液1;其中，超濾 的壓力為0 · 2MPa、溫度為30°C、截留分子量為5 X 104;
[0042] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH=6,將其以80mL/min的速度通過陰離子交換樹脂(Amberlite IRA400:Amberlite IRA63質(zhì)量比為 10:1)，然后用pH=6的NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液和2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1，
[0043] 4)將洗脫液1在壓力為O.IMPa的條件下，用截留分子量為3X104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/20，
[0044] 5)將截留液2冷凍干燥，所得白色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0045] 其中，本實施例所用超濾膜為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合膜(聚醚砜膜和醋 酸纖維素膜的活化層同向設(shè)置），膜結(jié)構(gòu)為內(nèi)壓式中空纖維超濾膜;超濾膜的具體結(jié)構(gòu)參數(shù) 及超濾具體工藝采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段。
[0046] 實施例2
[0047] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6.5,加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至 5,繼續(xù)向濾液中加入12kg殼聚糖-甲殼素混合物(殼聚糖：甲殼素= 8:1)，攪拌至吸附完全， 依次氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0048] 2)向烏司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶 液中以烏司他丁粗品：海藻酸鈉=1:0.03的比例加入海藻酸鈉(分子量為5萬），攪拌，靜置， 離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH = 6.5，超濾得截留液1;其中， 超濾的壓力為〇. 2MPa、溫度為30°C、截留分子量為5 X 104;
[0049] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH = 6,將其以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂 (Amberlite IRA400:Amberlite IRA402:Amberlite IRA63質(zhì)量比5:5:1)，然后用pH = 6的 NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1，
[0050] 4)將洗脫液1在壓力為O.IMPa的條件下，用截留分子量為3X104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/10，
[0051] 5)將截留液2冷凍干燥，所得白色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0052]其中，本實施例所用超濾膜為聚偏氟乙烯膜，具體結(jié)構(gòu)參數(shù)及超濾具體工藝同實 施例1。
[0053] 實施例3
[0054] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6.5,加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至 5,繼續(xù)向濾液中加入12kg殼聚糖-甲殼素混合物(殼聚糖：甲殼素= 5:1)，攪拌至吸附完全， 依次氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0055] 2)向烏司他丁粗品中加入pH= 5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶 液中以烏司他丁粗品：海藻酸鈉=1:0.01的比例加入海藻酸鈉(分子量為2萬），攪拌，靜置， 離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH=6,超濾得截留液1;其中，超 濾的壓力為〇. 5MPa、溫度為25°C、截留分子量為7 X 104;
[0056] 3)調(diào)節(jié)截留液1的pH=6,將其以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和lmol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗 脫液1，
[0057] 4)將洗脫液1在壓力為O.IMPa的條件下，用截留分子量為3 X104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/10，
[0058] 5)將截留液2冷凍干燥，所得白色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0059] 其中，本實施例所用超濾膜為聚偏氟乙烯膜，具體結(jié)構(gòu)參數(shù)及超濾具體工藝同實 施例1。
[0060] 實施例4
[0061] 1)取It澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6,加入8kg甲殼素，攪拌至吸附完全，依次氨水洗脫、硫 酸銨鹽析，靜置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品；
[0062] 2)向烏司他丁粗品中加入pH=5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，得混合液1;
[0063] 調(diào)節(jié)混合液1的pH = 6,將其以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂Amberlite IRA400，然后用pH=6的NaH2P〇4_Na2HP〇4緩沖液和2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗 脫液1;
[0064] 3)將洗脫液1濃縮至原體積的1/30,以120mL/min的速度通過陰離子交換樹脂 Amber 1 ite IRA63，然后用pH = 6的NaH2P〇4-Na2HP〇4緩沖液和2mo 1/L NaCl的混合溶液進行 洗脫，得洗脫液2;
[0065] 4)將洗脫液2在壓力為0 . IMPa的條件下，用截留分子量為3 X 104的超濾膜超濾得 截留液2,其中，截留液2為截留液體積的1/20;
[0066] 5)將截留液2冷凍干燥，所得淡黃色固體粉末即為烏司他丁純品。
[0067] 實施例5:結(jié)果表征：
[0068]對實施例1-4回收得到的烏司他丁純品的收率、活性、純度及人尿激肽原酶的含量 進行測定，具體結(jié)果如下表1。
[0069]其中，取實施例1-4制得的烏司他丁純品采用《中國藥典》（2010)烏司他丁項目下 的激肽原酶含量方法進行測定。
[0070] 表1實施例1-4分離純化得到的烏司他丁的收率、活性、純度及人尿激肽原酶的含 量測定結(jié)果
[0071]
[0072] 上述實施例僅作為解釋本發(fā)明的目的，本發(fā)明的范圍不受此限制。對本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說所做的修改是顯而易見的，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求范圍的限制。
【主權(quán)項】
1. 一種基于陰離子交換樹脂純化烏司他丁的方法，其具體步驟如下： 1) 取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，加入硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5，繼續(xù) 向濾液中加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜 置、沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品； 2) 向烏司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，向溶液中加 入海藻酸鹽，攪拌，靜置，離心，得下層沉淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH至6-6.5,超濾，得截留液1; 3) 調(diào)節(jié)截留液1的pH至6-6.5,將其上陰離子交換樹脂，然后用pH = 6-6.5的磷酸鹽緩沖 液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1; 4) 將洗脫液1超濾，得截留液2; 5) 將截留液2冷凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法具體步驟如下： 1) 取澄清尿液，調(diào)節(jié)pH至6-6.5，以每t尿液加入8-12kg硅膠的比例加入硅膠，攪拌，過 濾，得濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至3-5,繼續(xù)向濾液中以每t尿液加入8-12kg殼聚糖-甲殼素混合物 的比例加入殼聚糖-甲殼素混合物，攪拌至吸附完全，依次用氨水洗脫、硫酸銨鹽析，靜置、 沉淀、干燥后即得烏司他丁粗品； 2) 向烏司他丁粗品中加入pH = 5-5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液至完全溶解，繼續(xù)向溶液 中以烏司他丁粗品:海藻酸鹽=1:(0.01-0.03)的比例加入海藻酸鹽，攪拌，離心，得下層沉 淀物1，向沉淀物1中加入硫酸銨緩沖溶液使pH至6-6.5，超濾，得截留液1;超濾條件為:壓力 為0.2-0.6MPa、溫度為4-30 °C、截留分子量為5 X 104-7 X 104; 3) 調(diào)節(jié)截留液1的pH至6-6.5，將其以8〇-12〇111171^11的速度通過陰離子交換樹脂，然后 用pH=6-6.5的磷酸鹽緩沖液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液進行洗脫，得洗脫液1; 4) 將洗脫液1在壓力為0.1-0.5MPa、溫度為4-30°C、截留分子量為3 X 104的條件下超濾， 得截留液2; 5) 將截留液2冷凍干燥，即得純?yōu)跛舅 ?. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，超濾所用的超濾膜為聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纖維 素膜、醋酸纖維素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一種或至少兩種的復合膜;所述超濾膜的 結(jié)構(gòu)為中空纖維式、平板式、管式和卷式中的一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述超濾膜為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合 膜;所述超濾膜的結(jié)構(gòu)為內(nèi)壓式中空纖維超濾膜。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟1)中所述的殼聚糖與甲殼素的質(zhì)量比為 (3-8): 1，所述殼聚糖的脫乙酰度大于95%，分子量為8-15萬；步驟2)中所述的海藻酸鹽為 海藻酸鈉或海藻酸鉀，分子量為2-5萬。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟3)中所述的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉 或磷酸氫二鉀緩沖液； 步驟3)中所述的陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離子交換樹脂 的混合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述的強堿性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一種； 所述的弱喊性陰離子交換樹脂為Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68和Amberlite IRA63中的至少一種。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述的強堿性陰離子交換樹脂與弱堿性陰離 子交換樹脂質(zhì)量比為(3-10): 1。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟4)中的截留液2的體積為洗脫液1體積的 1/10-1/20。
【文檔編號】C07K1/30GK105837685SQ201610323339
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】王旭, 鄭少亮, 田友軍, 肖益熱
【申請人】廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司
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0訪客 來自[中國] 2023年10月18日 15:36怎么與天普合作，并且技術(shù)和設(shè)備怎么安裝和學習
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