一組陽(yáng)離子抗菌肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一組陽(yáng)離子抗菌肽及其制備方法。本發(fā)明在pep-05的基礎(chǔ)上改進(jìn)得到了一系列HRP5類似物，所涉及的陽(yáng)離子抗菌肽的通式為Xaa1- Xaa2- Xaa3- Xaa4- Xaa5- Xaa6- Xaa7- Xaa8- Xaa9- Xaa10-Leu- Xaa12- Xaa13- Xaa14。本發(fā)明采用固相化學(xué)合成技術(shù)制備上述線性多肽。本發(fā)明制備的陽(yáng)離子抗菌肽可應(yīng)用于制備抗大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和耐藥銅綠假單胞菌的藥物。
【專利說明】
一組陽(yáng)離子抗菌肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及具有較高抗菌活性的陽(yáng)離子抗菌肽的制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP)是一種廣泛存在于昆蟲、微生物、植物、動(dòng) 物以及人類的一種多肽，是機(jī)體內(nèi)在防御機(jī)制的一部分，具有廣譜抗菌活性，能夠抗革蘭氏 陽(yáng)性菌和陰性菌，同時(shí)具有抗真菌、寄生蟲、病毒和癌癥的能力。大多數(shù)AMP以細(xì)胞膜為靶 點(diǎn)，少數(shù)作用于細(xì)胞內(nèi)分子，AMP通常帶有正電荷，通過靜電相互作用與細(xì)胞膜上的陰離子 成分（如脂多糖和磷壁酸）結(jié)合，之后折疊成兩親性構(gòu)象，其疏水面與磷脂頭部相互作用而 造成膜結(jié)構(gòu)的紊亂或破壞，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)容物的流出和細(xì)菌死亡。
[0003] 富組蛋白（histidine rich protein，HRPs 或 histatins)是一類存在于靈 長(zhǎng)類動(dòng)物腮腺和頜下腺分泌物中富含組氨酸的陽(yáng)離子多肽?，F(xiàn)已分離出至少12種人 卩8〇11^1-12)，其中!11^1、!11^3及!11^5是主要富組蛋白，占總!11?^的85%-90%。其中 HRP5含有24個(gè)氨基酸殘基，分子量為3037D，其氨基酸序列為：
[0004] Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-H i s_Hi s-Ser-Hi s-Arg-Gly-Tyr 〇
[0005] 路建光等（中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013, 44(12))合成了一組HRP5類似物，其中pep-05的氨基酸序列如下所示：Lys-Arg-Leu -Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(SEQ ID NO :1)〇
[0006] 本發(fā)明在此基礎(chǔ)之上，經(jīng)過進(jìn)一步的改進(jìn)得到了一系列HRP5類似物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述多肽具有如下氨基酸序列：
[0008] Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal〇-Leu-Xaal2-Xaal3-Xa al4(SEQ ID NO:2)；
[0009] 其中 Xaal 為 Lys、Gly、Dap、Dab 或缺失；
[0010] Xaa2 為 Arg、hArg、Phe 或缺失；
[0011] Xaa3 為 Leu、Phe、Arg 或缺失；
[0012] Xaa4 為 Phe、Thi、Cpa 或 Phe(4-F);
[0013] Xaa5 為 Lys、Dap、Dab 或 Dap (Cap);
[0014] Xaa6 為 Lys、Dap、Dab、Asp、Ser 或 Thr ;
[0015] Xaa7 為 Leu 或 Trp ;
[0016] Xaa8 為 Leu 或 Arg ;
[0017] Xaa9 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap);
[0018] XaalO 為 Tyr、Leu、Trp、Lys 或 Arg ;
[0019] Xaal2 為 Arg 或 hArg ;
[0020] Xaal3 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap);
[0021] Xaal4 為 Phe、Thi 或 Phe(4_F)。
[0022] 上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽中，其中Xaal優(yōu)選Dab或缺失；Xaa6優(yōu)選Lys、 Dab 或 Ser ;Xaa7 優(yōu)選 Leu ;XaalO 優(yōu)選 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 優(yōu)選 Phe 或 Phe (4-F)。
[0023] 在某些特定的實(shí)施方式中，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽中，其中Xaa8為L(zhǎng)eu ; XaalO 為 Tyr〇
[0024] 更進(jìn)一步，在某些典型的實(shí)施方式中，其中Xaa8為L(zhǎng)eu ;XaalO為Tyr ;Xaal為Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F) 〇
[0025] 在某些特定的實(shí)施方式中，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽中，其中Xaa3為L(zhǎng)eu ; Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr〇
[0026] 更進(jìn)一步，在某些典型的實(shí)施方式中，其中Xaa3為L(zhǎng)eu ;Xaa7為L(zhǎng)eu ;Xaa8為L(zhǎng)eu ; XaalO 為 Tyr ;Xaal 為 Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F) 〇
[0027] 在某些特定的實(shí)施方式中，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽中，其中Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa4 為 Phe ;Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ;Xaal4 為 Phe。
[0028] 更進(jìn)一步，在某些典型的實(shí)施方式中，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa4為Phe ; Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ;Xaal4 為 Phe ;XaalO 為 Tyr、Lys 或 Arg〇
[0029] 在某些特定的實(shí)施方式中，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽中，其中Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa5 為 Lys ;Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys〇
[0030] 更進(jìn)一步，在某些典型的實(shí)施方式中，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa5為L(zhǎng)ys ; Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys ;Xaal0 為 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F)。
[0031] 本發(fā)明所涉及的氨基酸殘基包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本發(fā)明所涉 及的天然氨基酸所對(duì)應(yīng)的三字母代碼表如表1所示，本發(fā)明所涉及的非天然氨基酸所對(duì)應(yīng) 的代碼表及結(jié)構(gòu)如表2所示。
[0032] 本發(fā)明所涉及的所有氨基酸均為L(zhǎng)型氨基酸。
[0033] 本發(fā)明所涉及的多肽為線性肽時(shí)，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺 的形式，優(yōu)選以酰胺形式存在。
[0034] 表1 :天然氨基酸三字母代碼表 [0035]
[0036] 表2 :非天然氨基酸和脂肪酸的代碼表及結(jié)構(gòu)
[0037]
[0038]
[0039] 本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中公開了 一種線性多肽（CAMP-1)，其氨基酸序列為 Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:3)
[0040] 本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式公開了一種帶脂肪鏈的多肽（CAMP-28)，其氨基酸 序列為：Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID N0:4)
[0041] 本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中公開了一組線性多肽（CAMP-2, CAMP-3, CAMP-4， CAMP-5, CAMP-6, CAMP-7, CAMP-8, CAMP-9, CAMP-10, CAMP-11，CAMP-12, CAMP-13, CAMP-14， CAMP-15, CAMP-16, CAMP-17, CAMP-18, CAMP-19, CAMP-20, CAMP-21， CAMP-22, CAMP-23， CAMP-24, CAMP-25, CAMP-26, CAMP-27, CAMP-29, CAMP-30, CAMP-31，CAMP-32, CAMP-33)其氨 基酸序列分別為：
[0042] Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-Arg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :5)
[0043] Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :6)
[0044] Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :7)
[0045] Dab-Arg-Leu-Thi-Dap-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :8)
[0046] Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:9)
[0047] Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQID NO:10)
[0048] Gly-Arg-Leu-Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2 (SEQ ID NO:11)
[0049] Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO:12)
[0050] Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:13)
[0051] Cpa-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:14)
[0052] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:15)
[0053] Phe(4_F)-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4_F)_NH2 (SEQ ID NO:16)
[0054] Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:17)
[0055] Phe-Phe-Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:18)
[0056] Phe-Dab-Thr-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:19)
[0057] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:20)
[0058] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Arg-Lys-Thi-NH 2(SEQ ID NO:21)
[0059] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Trp-Leu-Arg-Lys-Thi-NH 2(SEQ ID NO:22)
[0060] Thi-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH 2(SEQ ID NO:23)
[0061] Thi-Dab-Ser-Trp-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH 2(SEQ ID NO:24)
[0062] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO :25)
[0063] Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:26)
[0064] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO :27)
[0065] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO :28)
[0066] Phe-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO :29)
[0067] Arg-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO:30)
[0068] Phe-Dap (Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO:31)
[0069] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH 2 (SEQ ID NO:32)
[0070] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2 (SEQ ID NO:33)
[0071] Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe_NH 2 (SEQ ID NO :34)
[0072] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:35)
[0073] 本發(fā)明還提供了上述線性多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗大腸桿菌、銅綠假 單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和耐藥銅綠假單 胞菌的藥物中的應(yīng)用。
[0074] 本發(fā)明還提供了上述線性多肽的制備方法，可以采用固相化學(xué)合成技術(shù)制備線性 肽，制備步驟如下：
[0075] (1)在樹脂上固相合成多肽；
[0076] (2)將步驟（1)的產(chǎn)物在三氟乙酸或氫氟酸中進(jìn)行裂解，優(yōu)選三氟乙酸；并加入側(cè) 鏈保護(hù)基清除劑，然后用5-20倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復(fù)洗 滌沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽。
[0077] 本發(fā)明所涉及的多肽C末端若為羧酸形式，則步驟（1)采用Wang樹脂進(jìn)行合成； 本發(fā)明所涉及的多肽c末端若為酰胺形式，則步驟（1)采用Rink Amide MBHA樹脂進(jìn)行合 成。
[0078] 步驟（1)是在液相環(huán)境中進(jìn)行，具體包括：浸泡樹脂一脫除氨基保護(hù)基一洗滌一 監(jiān)測(cè)一偶聯(lián)氨基酸一監(jiān)測(cè)一洗滌一脫除氨基保護(hù)基（順序偶聯(lián)剩余氨基酸）一干燥樹脂。
[0079] 其中氨基保護(hù)基是指為保護(hù)參與縮合反應(yīng)的氨基而引入的化學(xué)基團(tuán)。所述的氨基 保護(hù)基包括但不限于叔丁氧羰基（Boc)、芐氧羰基（Z)或9-芴基-甲基羰基（Fmoc)，優(yōu)選 9_荷基-甲基羰基（Fmoc)。
[0080] 固相多肽合成中，對(duì)部分氨基酸的側(cè)鏈可以引入化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，例如Arg或 hArg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺?；≒bf)保護(hù)；Lys及Trp可以采用叔丁氧羰基 (Boc)保護(hù)；Tyr可以采用叔丁基（tBu)保護(hù)；Dap可以采用Mtt或B0C保護(hù)；Dab可以采用 B0C保護(hù)；本發(fā)明中，F(xiàn)moc-L-Dap(Mtt)-〇H具有如下所示的結(jié)構(gòu)：
[0081]
[0082] 所述的保護(hù)基團(tuán)不限于此，可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方案進(jìn)行合理選擇。
[0083] 步驟⑴的液相環(huán)境所用溶劑選自：二甲基甲酰胺（DMF)或二氯甲烷（DCM)，優(yōu)選 DMF。
[0084] 步驟（1)中脫除氨基保護(hù)基需要加入氨基保護(hù)基的脫除劑，氨基保護(hù)基的脫除劑 選用哌啶（PIP)的二甲基甲酰胺溶液，濃度為10-40% (PIP體積/DMF體積），脫除時(shí)間為 20-50min ;優(yōu)選濃度為20-25% (PIP體積/DMF體積），脫除時(shí)間25-35min。
[0085] 步驟（1)中氨基酸的偶聯(lián)需要加入偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑由：碳二亞胺型試劑或者 苯并三氮唑鐺鹽型試劑和1-羥基苯并三唑（HOBt)組成。
[0086] 碳二亞胺型試劑包括但不限于二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)、二異丙基碳二亞胺 (DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亞胺（EDC)。
[0087] 苯并三氮唑鐺鹽型試劑包括但不限于2-(1Η-苯并三偶氮L-1-基）_1，1，3, 3-四 甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)、0-苯并三唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU)、六氟磷 酸苯并三唑-1-氧基三（二甲氨基）磷（Β0Ρ)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷 基磷（PyBOP)。
[0088] 偶聯(lián)試劑優(yōu)選二異丙基碳二亞胺（DIC)和1-羥基苯并三唑（HOBt)，或2- (1H-苯 并三偶氮L-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)和1-羥基苯并三唑（HOBt)，進(jìn) 一步優(yōu)選DIC (二異丙基碳二亞胺）和1-羥基苯并三唑（HOBt)。
[0089] 步驟（1)中的"監(jiān)測(cè)"采用茚三酮檢測(cè)法監(jiān)測(cè)多肽的縮合反應(yīng)。
[0090] 步驟（1)中的順序連接氨基酸是指根據(jù)多肽氨基酸序列從C端向N端逐個(gè)連接氨 基酸。
[0091] 步驟（2)所述的側(cè)鏈保護(hù)基清除劑包括但不限于茴香硫醚、三異丙基硅烷、苯酚、 水、1，2-乙二硫醇、間甲酚或上述任意兩種或者兩種以上的組合，并與三氟乙酸或氫氟酸按 5-20% (V/V)進(jìn)行配制得到。優(yōu)選三氟乙酸（TFA):茴香硫醚：75%苯酚：水=85:5:5:5。 [0092] 本發(fā)明的制備方法中，可以進(jìn)一步包含正辛酸的偶聯(lián)。具體而言，若制備的多肽為 帶脂肪鏈的多肽，則當(dāng)偶聯(lián)到帶脂肪鏈氨基酸位置時(shí)，先偶聯(lián)相應(yīng)的不帶脂肪鏈的氨基酸， 再加入正辛酸和偶聯(lián)劑，監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完成時(shí)，再偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸。
[0093] 特別有益的是為滿足醫(yī)藥用途的質(zhì)量要求，本發(fā)明所提供的多肽制備方法還可以 進(jìn)一步包括純化步驟。所采用的純化方法包括但不限于反相色譜法或離子交換色譜法，優(yōu) 選反相色譜法。
[0094] 本發(fā)明所涉及多肽的體外抗菌活性可以通過測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC)來鑒定。 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS)推薦采用微量肉湯稀釋法來測(cè)定各抗菌肽的最低 抑菌濃度（MIC)，培養(yǎng)基采用Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基以及改良型RPMI-1640培養(yǎng) 基。以兩性霉素 B、硫酸多黏菌素 E及鹽酸萬(wàn)古霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。體外活性測(cè)定表明，本發(fā) 明提供的抗菌肽具有更高的抗菌活性，特別抗陰性菌（如銅綠假單胞菌）或抗耐藥菌（如 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、耐藥銅綠假單胞菌）的活性得到顯著改善。
[0095] 以下實(shí)施例僅代表本發(fā)明闡述的一個(gè)方面，不是本發(fā)明主題的局限。
【具體實(shí)施方式】
[0096] 實(shí)施例1 :CAMP_1的制備及純化
[0097] 氨基酸序列：Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi- NH2((SEQ ID NO :3)
[0098] (1)材料及試劑
[0099] Rink Amide MBHA 樹脂，取代值 0· 65mmol/g。
[0100] 氛基酸為：Fmoc-L-3-(2-Thienyl) L-alanine-OH、Fmoc-L-Dab (Boc)-OH、 Fmoc-L_hArg(pbf)-〇H、 Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L_Tyr(tBu)-〇H、 Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-L-Dap(Boc)-OH。
[0101] 試劑：H0Bt、DIC、DMFJ；^^。
[0102] (2)儀器
[0103] PSI300型多肽合成儀、Waters600半制備型高效液相色譜儀、磁力攪拌器。
[0104] (3)操作步驟（以0· 15mmol為例）
[0105] a.固相化學(xué)合成多肽
[0106] 稱取Rink Amide MBHA樹脂0. 23g，置于多肽合成儀反應(yīng)器中，加入lOmLDMF， 浸泡2h，然后加入20 % PIP/DMF溶液10mL，混合30min脫除氨基保護(hù)基，DMF洗滌樹脂7 次，然后向反應(yīng)器中加入177mg Fmoc-L-3- (2-Thienyl) L-alanine-ΟΗ、等摩爾的偶聯(lián)試劑 DIC(0. 3mol/L)和H0Bt(0. 3mol/L)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為室溫，以茚三酮反應(yīng)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn) 程，監(jiān)測(cè)無色則為反應(yīng)完成，用DMF洗滌樹脂5次。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)氨基酸偶聯(lián)到樹脂上后，即可 按照上述方法繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)，如此循環(huán)，直至全部氨基酸偶聯(lián)完成。
[0107] b.裂解及沉淀
[0108] 肽合成結(jié)束后，真空干燥樹脂，稱重。按照l(shuí)mL裂解試劑/100mg樹脂的比例加入 裂解試劑，試劑配比為TFA:茴香硫醚：75%苯酚：水= 85:5:5:5,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，抽 濾。之后向裂解抽濾液中加入10倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復(fù) 洗滌沉淀4~5次，真空干燥，稱重粗肽。
[0109] c.反相色譜純化
[0110] 用制備型HPLC，采用反相色譜法，純化上述粗肽。
[0111] 1 制備
[0112] 色譜柱：YMC-pack ODS-AQ C18 制備柱（lOmmX 250mm, 10 μ m)
[0113] 流速：5mL/min
[0114] 檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm
[0115] 流動(dòng)相：A :含0· 1 % TFA水溶液
[0116] B :含 0. 1% TFA 的乙腈
[0117] 梯度洗脫程序如表3:
[0118] 表3梯度洗脫表
[0119]
[0120] 2 分析
[0121] 色譜柱：YMC_pack ODS-AQ C18分析柱（4. 6mmX 250mm, 5 μ m)
[0122] 流速：lmL/min
[0123] 檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm
[0124] 流動(dòng)相：A :含0· 05 % TFA水溶液
[0125] B :含 0. 05% TFA 的乙腈
[0126] 梯度洗脫程序如表4:
[0127] 表4梯度洗脫表
[0128]
[0129] 收集目標(biāo)肽純度大于95%的部分，然后38°C減壓濃縮至干。經(jīng)ESI-MS測(cè)定，該肽 的分子量為1730,理論值為1732. 6。
[0130] 實(shí)施例2 :帶脂肪鏈多肽CAMP-28的制備及純化
[0131] 氨基酸序列：Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap (Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :4)
[0132] (1)材料及試劑
[0133] Rink Amide MBHA 樹脂，取代值 0· 65mmol/g。
[0134] 氨基酸為：Fmoc-L-Dap (Mtt)-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu) -〇H、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-〇H。
[0135] 試劑：!1(?丨、01(：、01^、哌啶、正辛酸。
[0136] (2)儀器
[0137] PSI300型多肽合成儀、Waters600半制備型高效液相色譜儀、磁力攪拌器。
[0138] (3)操作步驟（以0· 15mmol為例）
[0139] 按照實(shí)施例1中的操作步驟a合成序列Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)_Ph e-Rink Amide MBHA，然后加入20 % PIP/DMF溶液10mL，混合30min脫除氨基保護(hù)基，用 01^洗滌樹脂7次，加入 26211^?111〇(3-1^-03?(]\1?)-0!1、等摩爾偶聯(lián)試劑01(：(0.3111〇1/1)和 HOBt (0. 3mol/L)，反應(yīng)3h，再雙縮3h (因?yàn)榇瞬椒磻?yīng)無法用茚三酮監(jiān)測(cè)，顯色結(jié)果始終為 紫紅色）。用DMF洗滌5次，再用DCM洗滌5次，真空干燥之后稱重，按照100mg樹脂加入 lml2% TFA/DCM，攪拌反應(yīng)lh。用DMF洗滌7次，加入65mg正辛酸，以及等摩爾的偶聯(lián)試劑 DIC(0. 3mol/L)和H0Bt(0. 3mol/L)反應(yīng)，以茚三酮反應(yīng)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測(cè)為無色即可偶 聯(lián)下一個(gè)氨基酸，之后的氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)按照實(shí)施例1中的操作步驟a進(jìn)行。之后按照實(shí) 施例1中操作步驟b-c進(jìn)行裂解和純化，收集純度大于95 %的部分，然后38°C減壓濃縮至 干。該肽的分子量為1565,理論值為1566. 41。
[0140] 實(shí)施例3 :表5中其余CAMP系列抗菌肽的制備及純化
[0141] (1)材料及試劑
[0142] Rink Amide MBHA 樹脂，取代值 0· 65mmol/g。
[0143] 氛基酸為：Fmoc-L-3-(2-Thienyl) L-alanine-OH、Fmoc-L-Dab (Boc)-OH、 Fmoc-L-hArg(pbf)-〇H> Fmoc-L-Leu-〇H> Fmoc-L-Tyr(tBu)-〇H> Fmoc-L-Phe-〇H> Fmoc-L-Dap (Boc)-〇H> Fmoc-L-Dap (Mtt)-〇H> Fmoc-L-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-L-Lys (Boc)-〇H> Fmoc-L-Phe(4_cl)-〇H、 Fmoc-L-Phe(4_F)-〇H、 Fmoc-L-Gly-〇H、 Fmoc-L-Trp-〇H、 Fmoc-L-Thr (tBu) -OH、Fmoc-L-Asp (otBu) -OH。
[0144] 試劑：!1(?丨、01(：、01^、哌啶、正辛酸。
[0145] (2)儀器
[0146] PSI300型多肽合成儀、Waters600半制備型高效液相色譜儀、磁力攪拌器。
[0147] (3)操作步驟（以0· 15mmol為例）
[0148] 以類似實(shí)施例1中操作步驟a-c的方法制備及純化表5中的多肽，若為帶脂肪鏈 多肽則按照實(shí)施例2中的操作步驟a進(jìn)行制備，收集純度大于95%的部分，然后38°C減壓 濃縮至干。ESI-MS測(cè)定值如表5所示。
[0149] 表5CAMP系列抗菌肽
[0150]
?>^
[0151] 實(shí)施例4 :體外抗菌活性測(cè)定
[0152] 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定各抗菌 肽的最低抑菌濃度（MIC)，細(xì)菌培養(yǎng)基采用Mueller-Hint〇n(MH)肉湯培養(yǎng)基，白色念球菌 培養(yǎng)基采用Hyclone改良型RPMI-1640培養(yǎng)基。
[0153] 具體步驟為：
[0154] (1)抗菌藥物貯存液制備：
[0155] 按照路建光等（中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013, 44 (12))文獻(xiàn)所述的方法制備線性多肽p印-05,精確配制濃度為320 μ g/mL的上述 pep-05、CAMP 1~33和80 μ g/mL陽(yáng)性對(duì)照品兩性霉素 B、硫酸多黏菌素 E及鹽酸萬(wàn)古霉 素。配制好的各貯存液置于一 20°C環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?br>[0156] (2)培養(yǎng)基的配制：
[0157] 稱取MH肉湯培養(yǎng)基21g，溶于蒸餾水中并定容至1L，121°C高溫滅菌30min。
[0158] (3)接種物的制備：
[0159] 用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3~5個(gè)，接種于4~5mL的MH肉湯中，35°C孵 育12~16h。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到菌液用MH肉湯校正濃度至0. 5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1~ 2 X 10sCFU/mL。用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1 :1000稀釋后備用。
[0160] (4)稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種：
[0161] 取一塊96孔板，在第1孔中加入160yL MH肉湯，第2-12孔中各加入100yL MH肉 湯，然后向第1孔加入抗菌藥物原液（320 μ g/mL) 40 μ L，混勻，接著吸取100 μ L至第2孔， 混勻后再?gòu)牡?孔中吸取100 μ L至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第10孔，并從第10孔中吸 取100 μ L棄去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制備好的接種物各100 μ L，使每孔 最終菌液濃度約為〇. 5 X 105CFU/mL。第1-10孔藥物濃度分別為32 μ g/mL、16 μ g/mL、8 μ g/ mL、4 μ g/mL、2 μ g/mL、1 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、0. 25 μ g/mL、0. 125 μ g/mL、0. 0625 μ g/mL，第 11 孔為不含抗菌藥物及接種物的空白對(duì)照，第12孔為不含抗菌藥物的陰性對(duì)照。
[0162] (5)孵育
[0163] 接種細(xì)菌的96孔板置于35°C普通空氣孵箱中孵育16~20h，接種真菌的96孔板 置于28°C空氣孵箱中孵育40~50h。
[0164] (6)結(jié)果
[0165] 以肉眼觀察，無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為該樣品的最低抑菌濃度（MIC)。各抗 菌肽的MIC測(cè)定結(jié)果如表6所示。
[0166] 表6CAMP系列抗菌肽的MIC測(cè)試結(jié)果
[0167]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述的多肽氨基酸序列為： Xaal- Xaa2- Xaa3- Xaa4- Xaa5- Xaa6- Xaa7- Xaa8- Xaa9- XaalO-Leu- Xaal2- Xaal3- Xaal4(SEQ ID NO:2)； 其中 Xaal 為 Lys、Gly、Dap、Dab 或缺失； Xaa2 為 Arg、hArg、Phe 或缺失； Xaa3 為 Leu、Phe、Arg 或缺失； Xaa4 為 Phe、Thi、Cpa 或 Phe (4-F); Xaa5 為 Lys、Dap、Dab 或 Dap (Cap)； Xaa6 為 Lys、Dap、Dab、Asp、Ser 或 Thr ; Xaa7 為 Leu 或 Trp ; Xaa8 為 Leu 或 Arg ; Xaa9 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap); XaalO 為 Tyr、Leu、Trp、Lys 或 Arg ; Xaal2 為 Arg 或 hArg ; Xaal3 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap); Xaal4 為 Phe、Thi 或 Phe (4-F)。2. 權(quán)利要求1所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaal優(yōu)選Dab或缺失；Xaa6優(yōu) 選 Lys、Dab 或 Ser ;Xaa7 優(yōu)選 Leu ;XaalO 優(yōu)選 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 優(yōu)選 Phe 或 Phe (4-F)。3. 權(quán)利要求1所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaa8為L(zhǎng)eu ;XaalO為Tyr ; 優(yōu)選 Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr ;Xaal 為 Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F)。4. 權(quán)利要求1所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaa3為L(zhǎng)eu ;Xaa7為L(zhǎng)eu ;Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr ; 優(yōu)選 Xaa3 為 Leu ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr ;Xaal 為 Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F)。5. 權(quán)利要求1所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa4 為 Phe ;Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ;Xaal4 為 Phe ; 優(yōu)選 Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa4 為 Phe ;Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ; Xaal4 為 Phe ;XaalO 為 Tyr、Lys 或 Arg〇6. 權(quán)利要求1所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa5 為 Lys ;Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys ; 優(yōu)選 Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa5 為 Lys ;Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys ;XaalO 為 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F) 〇7. -種多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，具體選自： Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:3) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 4) Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-Arg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:5) Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:6) Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:7) Dab-Arg-Leu-Thi-Dap-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:8) Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 9) Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQID NO:10) Gly-Arg-Leu-Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO:11) Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:12) Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:13) Cpa-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:14) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:15) Phe(4-F)-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:16) Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:17) Phe-Phe-Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:18) Phe-Dab-Thr-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:19) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:20) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:21) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Trp-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2 (SEQ ID NO:22) Thi-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:23) Thi-Dab-Ser-Trp-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:24) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :25) Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2 (SEQ ID NO:26) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :27) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :28) Phe-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :29) Arg-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:30) Phe-Dap (Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO:31) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Dap (Cap)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:32) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO:33) Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:34) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe_NH2(SEQ ID N0:35)。8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，包括以下步驟： (1) 在樹脂上固相合成多肽； (2) 將步驟（1)的產(chǎn)物在三氟乙酸或氫氟酸中進(jìn)行裂解，并加入側(cè)鏈保護(hù)基清除劑，然 后用5-20倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復(fù)洗滌沉淀4-5次，真空 干燥，得到粗肽。9. 權(quán)利要求8所述的制備方法，其中步驟（1)是在液相環(huán)境中進(jìn)行，具體包括：浸泡樹 脂一脫除氨基保護(hù)基一洗滌一監(jiān)測(cè)一偶聯(lián)氨基酸一監(jiān)測(cè)一洗滌一脫除氨基保護(hù)基一順序 偶聯(lián)剩余氨基酸一干燥樹脂。10. 權(quán)利要求8所述的制備方法，其中步驟（2)所述的側(cè)鏈保護(hù)基清除劑包括茴香硫 醚、三異丙基硅烷、苯酚、水、1，2-乙二硫醇、間甲酚或上述任意兩種或者兩種以上的組合， 并與三氟乙酸或氫氟酸按5-20% (V/V)進(jìn)行配制得到；優(yōu)選三氟乙酸（TFA):茴香硫醚： 75% 苯酚：水=85:5:5:5。11.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗大腸桿菌、銅綠假單胞 菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和耐藥銅綠假單胞菌 的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K1/06GK105837675SQ201510015227
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年1月12日
【發(fā)明人】馮軍, 夏江華, 張喜全, 路建光, 夏春光, 王巖, 楊桂英
【申請(qǐng)人】正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司, 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院