專利名稱：基因工程用工具菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及在分子克隆中可防止重復(fù)DNA序列重組的工具菌及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，含有同源序列的兩個(gè)DNA序列之間可以發(fā)生交換重組，即同源重組。在基因工程領(lǐng)域，業(yè)已開發(fā)出多種同源重組技術(shù)以及許多工程菌用于各種各樣的基因操作。L Red/ET 同源重組Red/ET重組是上個(gè)世紀(jì)末發(fā)明的一種新型的基因工程技術(shù)。在Reda/Redi3或 RecE/RecT重組酶系統(tǒng)的相互配合作用下，兩端帶有短同源臂(35 50bp)的供體DNA分子能直接重組到靶標(biāo)DNA分子上，實(shí)現(xiàn)對(duì)受體分子的取代、插入、缺失、突變等多種修飾。Red/ ET重組對(duì)靶標(biāo)DNA快速、精確、高效的修飾，同源臂短，不受內(nèi)切酶位點(diǎn)和DNA片段大小限制的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，給基因工程領(lǐng)域帶來了又一場(chǎng)重大變革。該技術(shù)已經(jīng)在大腸桿菌(E. coli)染色體修飾、基因簇的克隆與修飾、質(zhì)粒的構(gòu)建、基因打靶載體的構(gòu)建等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。2.誦i寸Cre-LoxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的位點(diǎn)特異件重會(huì)目來源于Pl噬菌體的Cre重組酶是屬于位點(diǎn)特異性重組酶家族中的重要成員，它是一個(gè)大小為38KD的蛋白，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)(序列)之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組[Hamilton DL 等，JMol Biol. 1984，Vol. 178，No. 2，p. 481-6]。 Cre-LoxP重組系統(tǒng)的一個(gè)最大優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于有效的重組作用不需要任何補(bǔ)充的輔助因子或者序列元件，以及不依賴細(xì)胞外環(huán)境。3.大腸桿菌.頂109野牛型(WT)菌株該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13噬菌體載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)， 由于載體DNA產(chǎn)生的Lac^i多肽和JM09編碼的LacZ Δ Ml5進(jìn)行α -互補(bǔ)，從而顯示β -半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。該菌基因型為recAl，endAl，gyrA96，thi-1, hsdR17,supE44,relAl, Δ (la-proAB)/F’ [traD36,proAB, laclq,IacZ ΔM15]。4.大腸桿菌 HS996、HS996~gyrA96 和 BG2005 菌株大腸桿菌HS996 (Gene Bridges GmbH)在以往的BAC修飾和基因克隆中被用作宿主菌來使用。該菌基因型為F-mcrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801αοΖ.Μ15. lacX74 recAl deoR araD139. (ara-leu) 7697 galU galK rpsL(StrE) endAl nupG fhuA:: IS2 (賦予噬菌體 Tl抗性)。大腸桿菌HS996-gyrA96菌株由于gyrA96基因突變可以產(chǎn)生針對(duì)萘啶酸的抗性，所以它是帶有萘啶酸抗性被優(yōu)化了的基因工程用菌。該菌基因型為F-mCrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC)lacX74 recAl gryA deoRaraD139. (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrK) endAl nupG fhuA: : IS2 (賦予噬菌體 Tl 抗性)。大腸桿菌BG2005菌株是來源于經(jīng)優(yōu)化的HS996菌株，并且在此菌基礎(chǔ)上通過將 rdd-alpha和recT兩個(gè)基因從基因組中缺失，從而被進(jìn)一步優(yōu)化了的基因工程用菌。它相對(duì)于HS996菌株具有非常明顯提高的DNA穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)特性。該菌基因型為F-mCrA. (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801αοΖ. Μ15. lacX74 recAl deoR araD139. (ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrE) endAlnupG fhuA: : IS2 (賦予噬菌體 Tl 抗性)Δ red-alpha Δ recT。5.大腸桿菌Β.Τ5183和DY380菌株大腸桿菌 BJ5183 (源于 Dr. Douglass Hanahan) (Takahashi N 等，Gene. 2003， Vol. 303，p. 89-97)的基因型為:recBC sbcBC endA galk met thi-1 bioThsdR StrE0在大腸桿菌BJ5183中recE和recT兩個(gè)基因被整合到其基因組中并且產(chǎn)生它們的基因產(chǎn)物，recET蛋白對(duì)于DNA雙鏈的修復(fù)起作用。另外，大腸桿菌BJ5183還攜帶一個(gè)編碼內(nèi)切酶I的endA基因的突變體，這個(gè)突變與recBC和sbcA的突變一同賦予對(duì) BJ5183菌株內(nèi)部的DNA雙鏈較高的修復(fù)活性(Kobayashi I等，Adv Biophys. 1992, Vol. 28, ρ· 81-133 ；Takahashi NK 等，J Bacteriol. 1993，Vol. 175，No. 16，p. 5176-85)。大腸桿菌DY380(來自斯坦福大學(xué))是通過缺陷型λ噬菌體整合到大腸桿菌的染色體組中產(chǎn)生的。該菌的重組系統(tǒng)依賴于來自λ噬菌體的Exo、Beta和Gamma重組蛋白， 而不是依賴RecA蛋白。通過該重組系統(tǒng)，人們可以進(jìn)行質(zhì)粒、BAC和細(xì)菌染色體組的修飾。盡管目前已有各種各樣的用于分子克隆的工程菌，例如以上大腸桿菌菌株，然而對(duì)于帶有多個(gè)同源序列的某些基因或者大片段的真核生物DNA片段，由于在進(jìn)行分子克隆時(shí)這種基因或DNA片段中的同源序列間自發(fā)地發(fā)生重組，故用這些工程菌難以實(shí)現(xiàn)對(duì)這種基因或DNA片段的克隆。因此，需要對(duì)這種帶有多個(gè)重復(fù)的DNA序列的基因、特別是對(duì)大片段的真核生物的DNA序列穩(wěn)定、能夠?qū)@些基因或大片段真換生物DNA序列進(jìn)行克隆的工程菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的基因工程用工具菌，該工程菌對(duì)帶有多個(gè)重復(fù)的DNA序列的基因、特別是對(duì)大片段的真核生物DNA序列穩(wěn)定，能夠?qū)@些基因或大片段真換生物DNA序列進(jìn)行克隆。本發(fā)明的工程菌優(yōu)選具有較高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率。具體而言，本發(fā)明涉及一種細(xì)菌，例如大腸桿菌，其優(yōu)選來源于大腸桿菌JM109野生型菌株，其中一個(gè)或更多個(gè)重組酶基因被敲除。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述細(xì)菌中，Red α ,Red^、RecE和RecT重組酶基因中的一個(gè)更多個(gè)被敲除。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RecE和RecT重組酶基因中的一個(gè)或兩個(gè)被敲除。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，RecE和RecT重組酶基因皆被敲除。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，fhuA基因被進(jìn)一步敲除。在上述實(shí)施方案中，所述細(xì)菌可選地具有鏈霉素抗性。本發(fā)明也提供一種多拷貝質(zhì)粒，其含有一個(gè)第一抗性基因、一個(gè)第二抗性基因和兩個(gè)缺失型第三抗性基因，其中第二抗性基因位于兩個(gè)缺失型第三抗性基因之間，這兩個(gè)缺失型第三抗性基因所缺失的部分不同，因此可通過同源重組產(chǎn)生完整的第三抗性基因。 所述抗性例如為抗生素抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一抗性基因?yàn)榘逼S青霉素抗性(AmpK)基因，第二抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐?KmK)基因，第三抗性基因?yàn)槁让顾乜剐?CmK)基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒為pUC-cm-r印eats質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供檢測(cè)細(xì)菌中DNA穩(wěn)定性的方法，其包括將上述任一種的多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到所述細(xì)菌中，測(cè)定所述細(xì)菌是否能夠在含有第三抗性所針對(duì)的抗生素如氯霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如果細(xì)菌能夠在含有該抗生素如氯霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，則表明在細(xì)菌中DNA 的穩(wěn)定性較差。


圖1是recET和fhuA基因之菌落PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶電泳圖譜，其中泳道1，2，7，8 :JM109(WT)；泳道3，5 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA泳道4，6 :JM109-StrE- Δ RecET ；泳道9，11 JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；泳道10，12 :JM109-StrE- Δ RecET ；M為分子量標(biāo)記。圖加是通過GCK分子克隆軟件顯示recET的菌落PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶圖譜模型。圖2b是通過GCK分子克隆軟件顯示fhuA的菌落PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶圖譜模型。圖3 (左圖)經(jīng)NcoI消化的pUC-cm-r印eats的凝膠圖譜。泳道1 分子量標(biāo)記； 泳道2-7限制性內(nèi)切酶NcoI消化后的質(zhì)粒pUC-cm-r印eats的凝膠電泳圖譜。圖3 (右圖)經(jīng)NcoI消化的pUC-cm-r印eats的GCK軟件模擬圖譜。圖4顯示pUC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的轉(zhuǎn)化效率。圖5顯示pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 :JM109-StrK-ARecET。圖6顯示pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖7顯示pUC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖8顯示pUC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中的DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖9顯示Red/ET重組條件下pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中期望的DNA
重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。圖10顯示Red/ET重組條件下pBAC-cm-r印eats在不同大腸桿菌菌株中不期望的
DNA重組率。2#JM109 :JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 : JM109_StrK-Δ RecET。
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圖Ila和b顯示LAWRIST-mTFIIA粘粒在不同菌株中轉(zhuǎn)化和檢測(cè)結(jié)果。其中M表示分子量標(biāo)記。2#JM109 :2#JM109-StrE- Δ RecET- Δ fhuA ；4#JM109 :4#JM109-StrE-Δ RecET0圖12為L(zhǎng)AWRIST7-mTFIIA粘粒的I^stI酶切電泳圖譜，其中泳道1為分子量標(biāo)記， 泳道2為L(zhǎng)AWRIST7-mTFIIA粘粒樣品。
具體實(shí)施例方式如上所述，當(dāng)有待克隆的基因或DNA片段、尤其是大片段的真核生物DNA分子含有多個(gè)同源序列時(shí)，在分子克隆中其同源序列間會(huì)自發(fā)地發(fā)生重組，導(dǎo)致該基因或DNA片段的分子克隆無法實(shí)現(xiàn)。小鼠胚胎肝細(xì)胞中的TFIIA基因(粘粒LAWRIST7-mTFIIA，(GeneBridges GmbH)) 的產(chǎn)物是基因特異性轉(zhuǎn)錄因子IIA，該因子可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)DNA在體內(nèi)與TBP(TATA盒結(jié)合蛋白)結(jié)合，并與啟動(dòng)子相結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄的起始[Liu Q等，Mol Cell Biol. 1999, Vol. 19, No. 12，p. 8673-85]。由于TFIIA基因中包含有許多相當(dāng)長(zhǎng)度和相同序列的DNA同源片段 [Jamsai D等，Genomics. 2003，Vol. 82，No. 1，p. 68-77]，所以在對(duì)該基因進(jìn)行分子克隆時(shí)， 其同源序列間自發(fā)地發(fā)生了重組作用，導(dǎo)致在克隆實(shí)驗(yàn)后，限制性內(nèi)切酶消化后的電泳圖譜的預(yù)期的理想結(jié)果與實(shí)際酶切結(jié)果往往是不一致的，即無法進(jìn)行分子克隆。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)其原因主要為外界環(huán)境不穩(wěn)定，在這些重復(fù)序列之間發(fā)生了重組或者在不同粘粒中發(fā)生了同源序列之間的重組。本發(fā)明人利用該TFIIA基因(Cosmids-LAWRIST7-mTFIIA)以及構(gòu)建的多拷貝檢測(cè)質(zhì)粒pUC-cm-r印eats，用不同的細(xì)菌菌株例如大腸桿菌菌株對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，意想不到地發(fā)現(xiàn)該基因和所述多拷貝檢測(cè)質(zhì)粒在大腸桿菌JM109野生型菌株中比較穩(wěn)定，未發(fā)生重組，而在其它的大腸桿菌菌株中則十分不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果見實(shí)施例3和 5。因此，本發(fā)明人選擇大腸桿菌JM109野生型菌株，通過對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，敲除其中的一個(gè)或多個(gè)重組酶基因，獲得了顯著提高對(duì)帶有多個(gè)重復(fù)DNA序列，特別是對(duì)大片段的真核生物的DNA序列的穩(wěn)定性的工程菌?？梢詫?duì)本發(fā)明的工程菌做出進(jìn)一步的修飾，例如引入抗性基因或敲除其fhuA基因，從而獲得具有額外標(biāo)記或提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率的工程菌。本申請(qǐng)中用于構(gòu)建新型工程菌的方法也可用于其他細(xì)菌、真菌或動(dòng)物細(xì)胞，以構(gòu)建其他的基因工程用菌或細(xì)胞。靶基因的敲除可以采用本領(lǐng)域已知的能夠改變或破壞靶基因或其調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)、使靶基因功能完全喪失的任何技術(shù)，例如同源重組技術(shù)來實(shí)施。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的工程菌可以用于克隆含有多個(gè)同源序列的基因或大片段真核生物DNA 分子。由于本發(fā)明的工程菌的內(nèi)部環(huán)境缺乏重組酶，因此當(dāng)利用基因的同源序列進(jìn)行分子克隆時(shí)，可以通過帶有重組酶的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化來實(shí)施同源重組。本申請(qǐng)中各種操作可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法、例如以下文獻(xiàn)中描述的方法和本申請(qǐng)中所述方法來實(shí)施Jos印h Sambrook, et. al.，Molecular Clonning A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；禾口 Carl W. Dieffenbach禾口Gabriela S.Dveksler,PCR primer :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 等。實(shí)施例1.使用的材料1.1 細(xì)菌所使用的細(xì)菌包括大腸桿菌JM109野生型菌株(Gene Bridges GmbH)、 HS996 (Invitrogen) > HS996-gyrA96 (Gene Bridges GmbH) > GB2005 (Gene Bridges GmbH) > BJ5183(Dr. Douglass Hanahan) > DY380 (University of Stenford)胃_。1.2 引物用來進(jìn)行DNA擴(kuò)增的引物1#-12#(SEQ ID NO 1-12)都在SIGMA公司定制。2.使用的方法質(zhì)粒的提取、DNA的分離與純化、限制性內(nèi)切酶的消化、瓊脂糖凝膠電泳、感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化、菌落PCR反應(yīng)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)等操作按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如 Joseph Sambrook 等，Molecular Clonning :A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；禾口 Carl W. Dieffenbach 禾口 Gabriela S.Dveksler, PCR primer :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995等中描述的方法來實(shí)施。2. 1細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)取2-10ml已經(jīng)高壓滅菌的LB培養(yǎng)液到15ml試管中，再用消毒過的牙簽挑取單克隆菌株到試管中，在37°C下、1025rpm條件下過夜培養(yǎng)。細(xì)菌主培養(yǎng)按照1 50-1 100的比例從預(yù)培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液取菌液接種，進(jìn)行大量培養(yǎng)， 在37°C下、1025rpm搖床條件下培養(yǎng)。2. 2Red/ET 重組1.將pSClOl-BAD-γ β α A (Gene Bridges GmbH)通過電轉(zhuǎn)化(1250V下電擊轉(zhuǎn)化) 轉(zhuǎn)化到細(xì)菌細(xì)胞中，然后將PCR產(chǎn)物和目標(biāo)克隆分子共同電轉(zhuǎn)化到該細(xì)菌細(xì)胞中；2.緊接著將這些細(xì)菌轉(zhuǎn)化子在帶有不同抗生素篩選壓力的LB平板培養(yǎng)皿表面涂平板，并且在30°C細(xì)菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；3.第二天，用消毒的牙簽在平板上挑取所選取的陽(yáng)性克隆，隨即將其移到1.5ml 的Ependorf管中，將菌株浸沒入其中的LB培養(yǎng)液中并多次旋轉(zhuǎn)，使細(xì)菌充分溶解在其中并且在30°C、1050rpm條件下培養(yǎng)；4.次日，將30μ1過夜培養(yǎng)的菌液加入到1.細(xì)1培養(yǎng)液中，并在30°C、1050Xg條件下培養(yǎng)2小時(shí)，至OD值為0. 2，然后向菌種加入20 μ 1 10 %的L-阿拉伯糖，緊接著在 37 0C、1050rpm 條件下培養(yǎng) 40min ；5.兩次在1200rpm，2°C，30秒離心，并用900 μ 1冰水清洗，6. 1300rpm、2°C下離心30秒，去除上清液，然后向其中加入PCR產(chǎn)物和目標(biāo)克隆質(zhì)粒，并且混合；7.將混合液加入到電轉(zhuǎn)化杯中，并在1350V的電壓下，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；8.在電轉(zhuǎn)化杯中加入900 μ 1新鮮的LB培養(yǎng)液，然后將其全部移到1. 5ml的新的 Ependorf管中，并在37°C、1050rpm條件下培養(yǎng)1小時(shí)，然后在帶有不同抗生素的平板上涂平板，在37 °C培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。2. 3 Cre重組酶重組1.將 pSC101-BAD-cre 質(zhì)粒(Gene Bridges GmbH)在 1350V 下電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌中；2.電轉(zhuǎn)化后在電轉(zhuǎn)化杯中加入900 μ 1新鮮的LB培養(yǎng)液，并在30°C下1050Xrpm 震蕩培養(yǎng)90min ；3.將所培養(yǎng)的細(xì)菌在含有150 μ g/ml的氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素混合篩選壓力的LB培養(yǎng)皿上涂平板；4.在30°C細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜培養(yǎng)；5.挑選單克隆菌株到Iml含有150 μ g/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)液中，并在30°C下培養(yǎng)2-3小時(shí)；6.轉(zhuǎn)換培養(yǎng)溫度到37°C條件下過夜培養(yǎng)；7.提取質(zhì)粒DNA并酶切消化，再通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定檢測(cè)。實(shí)施例1.基因被敲除的大腸桿菌JM109(WT)的構(gòu)建使用因rpsL基因發(fā)生突變而具有鏈霉素抗性的大腸桿菌JM109野生型菌株 (JM1094trK，得自 Gene Bridges GmbH)，構(gòu)建 rec/ET 基因被敲除(JM109_StrK-Δ recET，也稱為 4#JM109)以及 fhuA 基因被敲除(JM109-StrK- Δ recET- Δ fhuA,也稱為 ^JM109)的大腸桿菌菌株。為了從染色體組中將rec/ET基因敲除，通過引物1#和姊(AAATATTTCAAGTTG GCGGTGCATTACACCGCCAGGCTGAATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGAAGAACTCGTCAA GAAGAAAGTTTCCATGGAAAAGAGAAG, SEQ ID NO 1 ；和 TGAACAAAACGAATTTTAATCTGAGTTGAGGTTA AAAAACATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCACGCTGCCGCAAGCACTCAG, SEQ ID NO 2), 以質(zhì)粒pBeloBACll-rpsL-neo-zeo(Gene Bridges)為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得含有卡那霉素抗性(neo基因)的rpsL-neo基因盒。按照上述的Red/ET重組的基本步驟，用fpsL-neo 基因盒替換染色體組中的rec/ET基因；同樣通過引物5#和6# (CTCGTTTACGTTATCATTCACTT TACATCAGAGATATACCATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCACGCTGCCGCAAGCACTCA, SEQ ID NO :5 ；和 GAAGGTTGCGGTTGCAACGACCTGACGTTCTGCGCCCCAGAATACCGTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG, SEQ ID NO 6)，借助 red/ET 重組，用 rpsL-neo 基因盒進(jìn)一步替換染色體組中的fhuA基因，得到具有卡那霉素抗性的菌株克隆?？敲顾乜剐钥寺⊥ㄟ^引物3i^P4#(GCCAGAAATGGCAGGTATTCG，SEQ ID NO 3 ；和TGGCTTTCACCGTTACTGATGG， SEQ ID NO 4)以及PCR可以擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為1.71Λ的DNA片段。按照2. 3所述的方法通過Cre/loxP特異性重組，該rpsL-neo基因盒在Cre酶的作用下被去除，最終只是在染色體組中遺留一個(gè)IoxP位點(diǎn)的序列，獲得具有鏈霉素抗性的克隆-菌株JM1094trK- Δ recET 和JM109-MrK- Δ recET- Δ fhuA。最終得到的克隆通過引物3#和4#及引物7#和 8# (CTCGTTTACGTTATCATTCAC, SEQ ID NO 7 ；和 GCCAACCAGCGAGATAGCTTC，SEQ ID NO 8)經(jīng) PCR擴(kuò)增測(cè)定，原來rec/ET和fhuA基因位點(diǎn)處的擴(kuò)增片段大小為585bp和584bp (見圖1和2)。與此相對(duì)比，以大腸桿菌JM109 (WT)作為模板，通過引物3#和4#及引物7#和8#并通過菌落PCR，可以得到長(zhǎng)度分別為3. 9kb和2. 7kb的rec/ET和fhuA基因的擴(kuò)增片段。這表明，大腸桿菌JM109 (WT)中的rec/ET (和fhuA)基因已被敲除。實(shí)施例2.多拷貝質(zhì)粒pUC-cm-r印eats的構(gòu)建構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒pUC-cm-r印eats作為DNA穩(wěn)定性的檢測(cè)系統(tǒng)。該質(zhì)粒含有一個(gè)氨芐青霉素抗性(AmpK)基因、一個(gè)卡那霉素抗性(KmK)基因和兩個(gè)互不相連的缺失部分片段的氯霉素抗性(CmK)基因序列，其中卡那霉素抗性基因位于兩個(gè)缺失型CmK基因之間。pUC-cm-r印eats質(zhì)粒(6648bp)在發(fā)生重組之前和重組之后(得到具有氯霉素抗性的pUC-cm-amp質(zhì)粒)，始終含有氨芐青霉素抗性(AmpK)，因此帶有pUC-cm-r印eats質(zhì)粒或者pUC-cm-amp (3668bp)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株可以在含有氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)， 但只帶有pUC-cm-amp質(zhì)粒的大腸桿菌菌株由于兩個(gè)缺失型CmK基因之間發(fā)生重組而獲得完整的CmK基因，可以在含有氯霉素的LB的平板上存活。該質(zhì)粒如下制備。首先將pSClOl-BAD-γβ α A質(zhì)粒(Gene Bridges GmbH)通過于 1250V下電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入 BG2005 菌株中。用引物 11# 和 12# (CATGGAGCGGCGTAACCGTCGCACAGGAAGGACAGAGAAACATGA TCGTGCTCCTGTCGTTG,SEQ ID NO 11 ；和TTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTCTTTA GTGAGGGTTAATTGCG, SEQ ID NO :12)，以 pUC18_amp (Gene Bridges GmbH)作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物。這些引物含有兩段與pBAC-cm-r印eats (即pBelo-BAC-rpsL-neo-new) 質(zhì)粒中被截短的(CmK)氯霉素抗性基因同源的序列，使得可將pBAC-cm-r印eats中帶有被截短的CmK和KmK的片段通過同源重組而被亞克隆到pUC18-amp上。將pUC18-amp的 PCR產(chǎn)物和pBAC-cm-r印eats質(zhì)粒(Gene Bridges GmbH)通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到已經(jīng)帶有 pSClOl-BAD-y β α A質(zhì)粒的BG2005菌株中。在電轉(zhuǎn)化之后隨即發(fā)生Red/ET重組，得到質(zhì)粒pUC-cm-r印eats。帶有pUC-cm-r印eats質(zhì)粒的目標(biāo)克隆菌株可以在含有AmpK和KmK的 LB細(xì)菌培養(yǎng)皿篩選得到。然后將這些目標(biāo)克隆菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，并且用NcoI限制性內(nèi)切酶消化和瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果見圖3。實(shí)施例3.通過pBAC-cm-r印eats和pUC-cm-r印eats質(zhì)粒的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行DNA穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)在該試驗(yàn)中，將pBAC-cm-r印eats和pUC-cm-r印eats兩種質(zhì)粒分別被轉(zhuǎn)化到8個(gè)不同的大腸桿菌菌株之中。經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)和主培養(yǎng)大腸桿菌菌株的數(shù)量達(dá)到其生長(zhǎng)的飽和濃度(0D·值為3. 0)時(shí)，可用于DNA穩(wěn)定性試驗(yàn)。對(duì)于攜帶pBAC-cm-repeats質(zhì)粒的菌株，在預(yù)培養(yǎng)時(shí)使用新霉素和卡那霉素兩種混合抗生素作為共同的篩選壓力，而在主培養(yǎng)過程中，只使用新霉素作為篩選壓力。這主要是為了有意去丟失Neo基因(卡那霉素抗性基因)，并誘導(dǎo)這兩個(gè)缺失型氯霉素抗性基因片段的同源區(qū)域發(fā)生重組，從而形成一個(gè)完整的且有功能的氯霉素抗性基因(CmK)。然后，將達(dá)到飽和濃度的菌株分別取等量的體積，涂布在只含有新霉素或只含有氯霉素的LB平板上，并在37°C (DTO80菌株在30°C條件下)細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在只含有新霉素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落包括已經(jīng)發(fā)生自發(fā)性同源重組的菌株和沒有發(fā)生自發(fā)性同源重組的菌株。在只含有氯霉素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落表現(xiàn)的是pBAC-cm-r印eats質(zhì)粒的重組情況，這個(gè)重組發(fā)生在兩個(gè)不完整的缺失少部分序列的CmK基因的同源片段之間，故DNA穩(wěn)定性由在這兩個(gè)含不同抗生素的LB平板上的菌落數(shù)的比值所指示。在無抗生素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落及其數(shù)量表示的是已被轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子菌落和未被轉(zhuǎn)化的菌落的總數(shù)。而在帶有新霉素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)表現(xiàn)的是 pBAC-cm-repeats和pUC-cm-r印eats質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化之后，成功發(fā)生轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況。轉(zhuǎn)化效率由這兩種平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)的比值來指示。對(duì)于多拷貝檢測(cè)質(zhì)粒pUC-cm-r印eats來說，該質(zhì)粒含有AmpK和KmK (卡那霉素抗性)基因，而且KmK基因位于兩個(gè)不完整的缺失部分序列的0^基因片段之間。與 pBAC-cm-repeats質(zhì)粒同樣的原理，先在氨芐青霉素和卡那霉素共同存在并在37°C的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后主培養(yǎng)在只有氨芐青霉素存在且于37°C的條件下進(jìn)行至飽和濃度 (DY380菌株在30°C條件下)。最后將等量體積的菌液100 μ 1分別涂平板于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB平板上，在其表面上生長(zhǎng)的菌落數(shù)之間的比值代表了其DNA的穩(wěn)定性。如上所述進(jìn)行DNA穩(wěn)定性檢測(cè)。在表1和2及圖5和6中可以清楚地看到，pBAC-cm-repeats的自發(fā)重組率在大腸桿菌JM109(WT)、 JM109-StrE- Δ recET- Δ fhuA (2#JM109) JM109-StrE- Δ recET (4#JM109)是最低的， 并且在 JM109-StrR-ArecET-AfhuA(2#JM109)禾Π JM109-StrE- Δ recET (4#JM109) 的自發(fā)重組率大約為在JM109(WT)中的一半。而BG2005菌株中的自發(fā)重組率是 JM109 (WT)的2倍；在BJ5183、HS996和HS996_gyrA96菌株中的自發(fā)重組率是在 JM109-StrE- Δ recET- Δ fhuA (2#JM109)和 JM109_StrK-Δ recET G#JM109)中的數(shù)倍；然而在DY380中的自發(fā)重組率最高，為0. 19112%。表1 檢測(cè)系統(tǒng)pBAC-cm-r印eats在不同菌株中DNA穩(wěn)定性的原始數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌，其中一個(gè)或更多個(gè)重組酶基因被敲除。
2.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其為大腸桿菌。
3.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其來源于大腸桿菌JM109野生型菌株。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中Reda,Red^、RecE和RecT重組酶基因中的一個(gè)更多個(gè)被敲除。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中RecE和RecT重組酶基因中的一個(gè)或兩個(gè)被敲除。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中RecE和RecT重組酶基因皆被敲除。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中fhuA基因被進(jìn)一步敲除。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的細(xì)菌，其具有鏈霉素抗性。
全文摘要
基因工程用工具菌及其應(yīng)用。本申請(qǐng)涉及基因組中一個(gè)或多個(gè)重組酶基因被敲除的工程菌。所述工程菌尤其可用于克隆含有多個(gè)同源序列的基因或大片段DNA的工程菌。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102344897SQ201110300048
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者于浩洋 申請(qǐng)人:蘇靜