專利名稱：一種siRNA 轉(zhuǎn)染哺乳類動(dòng)物胚胎的電穿孔方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于胚胎轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，涉及siRNA介導(dǎo)的RNA干擾，特別涉及一種siRNA轉(zhuǎn)染哺乳類動(dòng)物胚胎的電穿孔方法。
背景技術(shù)：
近些年由siRNA (small interfering RNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)已經(jīng)逐漸成為研究基因功能的有力工具。傳統(tǒng)的將siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞中的方法有病毒介導(dǎo)法，顯微注射法。病毒介導(dǎo)法可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，但要求細(xì)胞需處于分裂期，且存在安全問題。顯微注射法是可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)染，但需要昂貴的顯微操作儀器，且操作復(fù)雜，對(duì)胚胎的創(chuàng)傷較大，轉(zhuǎn)染數(shù)量也有限。因此尋找一種安全，簡(jiǎn)便，高效的胚胎轉(zhuǎn)染方法成為當(dāng)前胚胎學(xué)研究領(lǐng)域急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種siRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎進(jìn)行安全、簡(jiǎn)便、高效的siRNA的轉(zhuǎn)染。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)1、一種SiRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，包括以下步驟1)將待轉(zhuǎn)染的胚胎置于臺(tái)氏液中，室溫孵育5 15s，然后終止消化并清洗；2)以opti-MEM為電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行稀釋，用稀釋好的待轉(zhuǎn)染siPORT 與siRNA按摩爾比1 1 2混合后室溫靜置10 15min，得到含有SiRNA的電穿孔溶液，其中SiRNA 的終濃度為0. 1 1 μ mol/L ；3)將胚胎置于含有siRNA的電穿孔溶液，在脈沖電場(chǎng)下，利用電穿孔法對(duì)胚胎進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。所述的將胚胎在進(jìn)行臺(tái)氏液處理之前，還對(duì)胚胎用PBS-PVA溶液清洗，所述的 PBS-PVA溶液為含有體積濃度為0. 2 0. 5% PVA的PBS溶液。所述的終止消化是將胚胎從臺(tái)氏液轉(zhuǎn)移到含血清的胚胎體外操作液中終止消化， 然后將胚胎用OPti-MEM溶液清洗。所述的SiRNA為進(jìn)行了熒光標(biāo)記的siRNA。所述的電穿孔法進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染的參數(shù)控制為電壓20V 40V ；脈沖時(shí)間1 2ms ；脈沖次數(shù)3 4次。針對(duì)小鼠胚胎進(jìn)一步優(yōu)化為電壓30V，脈沖時(shí)間1ms，脈沖次數(shù)3次。所述的電穿孔完成后，將胚胎清洗并轉(zhuǎn)移入提前平衡至少30min的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的SiRNA轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物胚胎的電穿孔方法，首先對(duì)胚胎透明帶結(jié)構(gòu)使用臺(tái)氏液進(jìn)行弱化處理，然后再將處理后的胚胎置于脈沖電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時(shí)微孔，導(dǎo)致其通透性和膜電導(dǎo)瞬時(shí)增大，可以使在正常生理情況下細(xì)胞膜難以通透的SiRNA進(jìn)入細(xì)胞。而如果不對(duì)透明帶進(jìn)行弱化處理，低電壓不容易穿透透明帶，高電壓又會(huì)使胚胎的死亡率增加。因此對(duì)胚胎透明帶的消化處理，尤其是消化時(shí)間的控制是轉(zhuǎn)染的
關(guān)鍵一步。其次使用siPORT 和SiRNA進(jìn)行結(jié)合，siPORT 能夠與siRNA形成絡(luò)合物，在出現(xiàn)電穿孔的瞬時(shí)微孔時(shí)，促進(jìn)siRNA高效得進(jìn)入胚胎。為了進(jìn)一步觀察或跟蹤轉(zhuǎn)染效果，還可以對(duì)待轉(zhuǎn)染的siRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，這樣在電穿孔轉(zhuǎn)染后通過熒光顯微鏡可以直觀的觀察。通過熒光倒置顯微鏡對(duì)胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)觀察分析表明，本發(fā)明存活胚胎穩(wěn)定陽性轉(zhuǎn)染率約為95%，采集的總胚胎實(shí)際有效利用率超過70%，為采用由siRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)研究基因在胚胎中的功能提供了有效的轉(zhuǎn)染方法。


圖1為小鼠受精卵透明帶經(jīng)不同消化時(shí)間，電穿孔轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA 后，胚胎在相同曝光時(shí)間(200ms)下的紅色熒光水平；圖2為應(yīng)用本發(fā)明轉(zhuǎn)染小鼠不同發(fā)育時(shí)期胚胎的顯微照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種SiRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，尤其適用于哺乳類動(dòng)物的胚胎轉(zhuǎn)染，包括對(duì)胚胎的透明帶的弱化處理和siRNA的絡(luò)合處理。下面結(jié)合具體的電穿孔過程和轉(zhuǎn)染結(jié)果對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。所述的siRNA轉(zhuǎn)染是基于siRNA通過胚胎透明帶和細(xì)胞膜在脈沖電場(chǎng)下形成的瞬時(shí)微孔進(jìn)入胚胎，是一種生物物理的轉(zhuǎn)染方法，所以待轉(zhuǎn)染的胚胎并無特殊的種屬要求。由于形態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大的胚胎進(jìn)行電穿孔時(shí)的透明帶弱化時(shí)間和電穿孔參數(shù)可能會(huì)有一些差別，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員是能夠通過本專利所提供的方法進(jìn)行很少次數(shù)的實(shí)驗(yàn)從而對(duì)于這些具體的參數(shù)進(jìn)行篩選和優(yōu)化，即可確定相應(yīng)胚胎的最優(yōu)參數(shù)，完成胚胎轉(zhuǎn)染。下面具體以哺乳類動(dòng)物特別是小鼠胚胎作為實(shí)施對(duì)象，詳細(xì)說明SiRNA轉(zhuǎn)染哺乳類動(dòng)物胚胎的電穿孔方法，此類胚胎形態(tài)差異小，透明帶結(jié)構(gòu)成分相似，因此轉(zhuǎn)染條件和電穿孔參數(shù)設(shè)置變化不大。siRNA轉(zhuǎn)染小鼠胚胎的電穿孔方法，包括以下步驟首先對(duì)小鼠胚胎進(jìn)行透明帶弱化的預(yù)處理a、將采集的小鼠胚胎在PBS-PVA溶液中轉(zhuǎn)移3_5次，每次更換新的溶液；所述的 PBS-PVA溶液為含有體積濃度為0. 2% PVA(polyvinyl alcohol，聚乙烯醇)的PBS溶液；b、將小鼠胚胎轉(zhuǎn)移到臺(tái)氏液(Sigma，美國(guó))中于室溫靜置10s，進(jìn)行透明帶弱化處理；而對(duì)于弱化處理的時(shí)間的選擇，后續(xù)以對(duì)照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來進(jìn)一步說明；C、計(jì)時(shí)結(jié)束后立即將胚胎轉(zhuǎn)移到小鼠胚胎體外操作液Hepes-KSOM溶液中終止消化；100ml H印es-KSOM 工作液配方為=NaCl,0. 5552g ；KC1，0. 0186g ；KH2PO4,0. 0047 ； D-葡萄糖，0. 0036 ；NaHCO3,0. 0336g ；丙酮酸鈉，0. 0022g ；L-谷氨酰胺，0. 0146g ；EDTA-Na2,0. 0014g ；CaCl ‘ 2H20,0. 0250g ；MgSO4,0. 0024g ；HEPES,0. 2384g ；必需氨基酸(EAA， invitrogen,50X) ,2ml ；非必需氨基酸(NEAA, invitrogen, 100 X , Iml ；60 % 乳酸鈉， 350 μ 1;牛血清白蛋白(BSA), 0. 6g ；d、將胚胎在opti-MEM(Invitrogen，美國(guó))溶液中轉(zhuǎn)移3-5次，每次更換新的溶液， 完成電穿孔前對(duì)胚胎的預(yù)處理。完成對(duì)胚胎的預(yù)處理之后，對(duì)胚胎進(jìn)行電穿孔，具體操作包括以下步驟1)配制包含Cy3標(biāo)記的siRNA (#AM4621，ambion,美國(guó))的電穿孔溶液以 opti-MEM為電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行稀釋(用opti-MEM將siPORT 與siRNA稀釋到合適的濃度)， 將稀釋后的siPORT 與稀釋siRNA的按摩爾比1 1 2混合，室溫靜置IOmin ；稀釋的 siRNA 為 50 μ 1 opti-MEM 力口 5 μ 1 siRNA,稀釋的 siPORT (#AM4502, introgen，美國(guó))為 50 μ 1 opti-MEM加3 μ 1 siPORT ,電穿孔溶液中最終siRNA稀釋濃度為0. 5 μ mol/L ；由于不同siRNA發(fā)揮干擾功效的濃度不盡相同，所以在進(jìn)行siRNA濃度的稀釋時(shí)要根據(jù)具體情況調(diào)整稀釋倍數(shù)；為了便于觀察siRNA轉(zhuǎn)染胚胎后的情況，因此將其用熒光標(biāo)記Cy3進(jìn)行標(biāo)記，而所選用的siRNA是一種陰性對(duì)照siRNA，它是由19bp隨機(jī)序列組成，與已知的小鼠，大鼠和人基因組無同源性，因此轉(zhuǎn)入胚胎后對(duì)胚胎的正常發(fā)育不會(huì)造成影響。由于采用的siRNA為Cy3熒光標(biāo)記的siRNA，因此稀釋和電穿孔過程都需要盡量避光，以免造成熒光萃滅，而當(dāng)不需要對(duì)siRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記時(shí)，那么就不用避光操作。2)將預(yù)處理完成的胚胎移入配制好的含Cy3標(biāo)記的siRNA的電穿孔溶液，此步驟要求盡可能少吸液體，以免稀釋配制好的電穿孔溶液，胚胎移入后室溫避光孵育1 3min， 這會(huì)使siRNA附著于胚胎表面，利于電穿孔過程中微孔產(chǎn)生時(shí)siRNA的進(jìn)入，但是長(zhǎng)時(shí)間暴露在環(huán)境中容易造成siRNA的降解，并且胚胎在室溫環(huán)境下過長(zhǎng)時(shí)間對(duì)胚胎發(fā)育的不利影響是顯著的，因此孵育時(shí)間不宜過長(zhǎng)；3)將胚胎連同電穿孔溶液移入電轉(zhuǎn)槽中(電極間距為1mm)，使用電穿孔儀(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美國(guó))進(jìn)行電穿孔，電穿孔參數(shù)為電壓20 40V ；脈沖時(shí)間1 2ms ；脈沖次數(shù)3 4次；經(jīng)過分組實(shí)驗(yàn)對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到針對(duì)小鼠胚胎的最優(yōu)電穿孔參數(shù)為電壓30V ；脈沖時(shí)間Ims ；脈沖次數(shù)3次；4)電穿孔完成后，從電轉(zhuǎn)槽中轉(zhuǎn)移胚胎至H印es-KSOM中清洗，轉(zhuǎn)移3-5次，每次更換新的溶液；5)將清洗后胚胎移入提前平衡至少30min的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)觀察，進(jìn)行后續(xù)干擾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。100ml KSOM 培養(yǎng)液配方如下:NaCl，0. 5552g ；KCl，0. 0186g ；KH2PO4,0. 0047g ； D-葡萄糖，0. 0036g ；NaHCO3,0. 2Ig ；丙酮酸鈉，0. 0022g ；L-谷氨酰胺，0. 0146g ；EDTA-Na2, 0. 0014g ；CaCl · 2H20,0. 0250g ；MgSO4,0. 0024g ；必需氨基酸(EAA, Invitrogen, 50 X)，2ml ； 非必需氨基酸(NEAA，Invitrogen, 100 X, Iml ；60%乳酸鈉，350 μ 1 ；牛血清白蛋白(BSA)， 0. 6 0. 8g。為了更好的說明電穿孔轉(zhuǎn)染胚胎的結(jié)果，具體結(jié)合統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和附圖對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行說明。透明帶消化時(shí)間對(duì)電穿孔效率的影響按照上述轉(zhuǎn)染方法，以消化Os作為對(duì)照，以轉(zhuǎn)染效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)消化10s、20s,30s實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體的結(jié)果如表1所示表1透明帶消化時(shí)間對(duì)電穿孔效率的影響
權(quán)利要求
1.一種SiRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，其特征在于，包括以下步驟1)將待轉(zhuǎn)染的胚胎置于臺(tái)氏液中，室溫孵育5 15s，然后終止消化并清洗；2)以opti-MEM為電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行稀釋，用稀釋好的待轉(zhuǎn)染siPORT 與siRNA按摩爾比 1 1 2混合后室溫靜置10 15min，得到含有siRNA的電穿孔溶液，其中siRNA的終濃度為 0. 1 lymol/L ；3)將胚胎置于含有siRNA的電穿孔溶液，在脈沖電場(chǎng)下，利用電穿孔法對(duì)胚胎進(jìn)行 siRNA轉(zhuǎn)染。
2.如權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，其特征在于，將胚胎在進(jìn)行臺(tái)氏液處理之前，還對(duì)胚胎用PBS-PVA溶液清洗，所述的PBS-PVA溶液為含有體積濃度為0. 2 0. 5% PVA 的 PBS 溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，其特征在于，所述的終止消化是將胚胎從臺(tái)氏液轉(zhuǎn)移到含血清的胚胎體外操作液中終止消化，然后將胚胎用opti-MEM溶液清洗。
4.如權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，其特征在于，所述的siRNA為進(jìn)行了熒光標(biāo)記的siRNA。
5.如權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染哺乳類動(dòng)物胚胎的電穿孔方法，其特征在于，電穿孔法進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染的參數(shù)控制為電壓20 40V ；脈沖時(shí)間1 2ms ；脈沖次數(shù)2 4次。
6.如權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染哺乳類動(dòng)物胚胎的電穿孔方法，其特征在于，電穿孔完成后，將胚胎清洗并轉(zhuǎn)移入提前平衡至少30min的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種siRNA轉(zhuǎn)染胚胎的電穿孔方法，包括以下步驟1)對(duì)胚胎透明帶進(jìn)行弱化處理；2)配制含siRNA的電穿孔溶液；3)將胚胎移入配制好的含siRNA的電穿孔溶液，室溫靜置，然后再將胚胎連同電穿孔溶液移入電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行電穿孔。本發(fā)明包括對(duì)胚胎的透明帶的弱化處理和siRNA的絡(luò)合處理，然后通過將胚胎置于脈沖電場(chǎng)作用下，導(dǎo)致其通透性和膜電導(dǎo)瞬時(shí)增大，使在正常生理情況下細(xì)胞膜難以通透的siRNA進(jìn)入細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)觀察分析表明，本發(fā)明存活胚胎穩(wěn)定陽性轉(zhuǎn)染率超過95％，采集的總胚胎實(shí)際有效利用率超過70％，是一種安全、簡(jiǎn)便、高效的siRNA轉(zhuǎn)染哺乳類動(dòng)物胚胎的技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N15/873GK102329819SQ20111030009
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者常博皞, 張涌, 彭輝, 蘇建民 申請(qǐng)人:楊凌科元克隆股份有限公司, 西北農(nóng)林科技大學(xué)