專利名稱：豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗，特別是針對胸膜肺炎放線桿菌所引起的豬胸膜肺炎之疫苗。
背景技術(shù)：
1964年Shope{J.Exp.Med.，119357-368}首先于阿根廷報告豬胸膜肺炎暴發(fā)流行情形，并可分離到Haemophiluspleuropneumoniae(已改為Actinobacillus pleuropneumoniae簡稱Ap)。在此之后，其他類似之報告在瑞士有Nicolet及Koning[Vorl.Mitt.Path.Microbiol.29301-306(1966)]。在丹麥、瑞士、英國、加拿大及澳洲有Nielsen[IPVS，p103(1984)]，Little[Vet.Rec.87399-402(1970)]，Schiefer等人[Can.J.Comp.Med.3899-104(1974)]及Mylrea等人[Austr.-Vet.J.50255-259(1974)]。在日本Kume等人[Jpn.J.Vet.Sci.48965-970(1986)]，Nakai及Kume[Jpn.J.Vet.Sci.491141-1144(1987)]及Suzuki等人[Jpn.J.Vet.Sci.501264-1267(1988)]。韓國Gunnarsson等人[Am.J.Vet.Res.381111-1114(1977)]亦有本病之報告。本省首次暴發(fā)此病是于1975年7月由徐氏等人所報告[臺糖畜產(chǎn)研究所64/65年期研究實驗報告，191-197]，以3至6個月齡之肥豬居多，近多年來甚至在4周齡之哺乳豬亦可致病[邱鴻英碩士論文，國立中興大學獸醫(yī)研究所，臺中，臺灣(1987)]，且血清型在1975年至1985年間最常見的為第5血清型，至今除第5型外，尚有第1、2及3型等血清型，并出現(xiàn)很多的抗藥性菌株，尤以第1血清型為甚[張，中華民國獸醫(yī)學會志，22129-135(1996)]，造成養(yǎng)豬經(jīng)濟之損失頗鉅。因為此病多為急性感染，常因來不及治療即已暴斃，因此，即使是有效的藥物但如未能及時使用，將導致無法挽救之地步，因而凸顯開發(fā)有效的疫苗作防疫乃為當務(wù)之急。
Ap為Gram氏陰性菌，有12個血清型，其所分泌的外毒素是屬于Actinobacillus pleueopneumoniae RTX toxin，簡稱Apx，分為ApxI、ApxII及ApxIII，其分子量分別為105kDa、103kDa及120kDa[Kamd et al.，Infect.Immun.593079-3085(1991)]，惟新舊分類方法有所不同，近來文獻多采用統(tǒng)一命名(即ApxI、ApxII、ApxIII)。ApxI可取自血清型1、5a、5b、10、11等，具有細胞毒性及溶血作用；ApxII可取自血清型1、2、3、4、6、7、8、9、11、12等，具有細胞毒性及較弱的溶血作用；ApxIII可取血清型2、3、4、6、8等，具有細胞毒性，但無溶血作用{Kamp etal.，Infect.Immun.593079-3085(1991)；Chang et al.，DNA8635-647(1989)；Chang et al.，J.Bacteriol.1735151-5158(1991)及Frey et al.，Infect.Immun.601671-1676(1992)}。
在過去的文獻報告中指出許多Gram氏陰性菌會分泌一些高分子量(100kDa～110kDa)的細胞毒素。該細胞毒素產(chǎn)生細胞毒性時須有鈣離子介入其反應(yīng)而且與E.coli的a溶血素(Alpha-hemolysin，HlyA)在免疫學上及其基因均有密切的關(guān)系。這些毒素后來被歸納為RTX族群(PTX family)，RTX族群之命名是基于發(fā)現(xiàn)在這群毒素蛋白的靠C端三分之一處富含有g(shù)lycine/aspartic acid的重復排列情形，因此，RTX即表示Repeat Toxin[Forestier etal.，Infect.Immun.594212-4220(1991)；Strathdee andLo.，J.Bacteriol.171916-928(1989)]。另者，與這些RTX毒素有關(guān)的基因有四個C、A、B、D等(除了ApxII的B、D基因可能在演化過程中消失掉，因此ApxII無B、D基因)A基因?qū)儆诙舅刂Y(jié)構(gòu)基因，C基因產(chǎn)物藉由acylation反應(yīng)去活化A基因，即C基因為activator基因，而B與D基因與RTX毒素的分泌過程有關(guān)，即B與D基因具有transporter之角色[Jansen et al.，Infect.Immun.63688-3695(1993)]。
過去20年來有翁氏等人[中華民國獸醫(yī)學會志，267-71(1976)；臺糖畜產(chǎn)研究所65/66年期研究實驗報告，219-224(1977)]，徐氏等人[臺糖畜產(chǎn)研究所65/66年期研究實驗報告，147-155(1978)]以及張氏等人[臺糖畜產(chǎn)研究所67/68年期研究實驗報告，163-173(1979)；臺糖畜產(chǎn)研究所68/69年期研究實驗報告，103-11(1980)；臺糖畜產(chǎn)研究所70/71年期研究實驗報告，83-87(1982)]曾分別對死菌疫苗之研制及其免疫學上各問題進行探討。羅氏[中華民國獸醫(yī)學會志，13119-126(1987)]亦曾應(yīng)用第5型血清型莢膜抗原免疫豬只后作評估，上述各作者均頗有成就。惟至目前為止，尚未有任何文獻報告涉及應(yīng)用基因工程的方法將Ap所分泌之毒素制成次單位疫苗作為此病之預防。我們多年的經(jīng)驗深知ApxI(105kDa)深厚的潛力，雖然張甘楠(本件發(fā)明人之一)過去曾利用Ap第一血清型所分泌之外毒素(104kDa)制成類毒素與死菌混合疫苗(已取得專利權(quán)，經(jīng)濟部中央標準局專利證書，專利權(quán)號數(shù)發(fā)明第50415號)其免疫保護率高達82％以上，由于Ap第一血清型在本省地區(qū)是最具毒性且最具有抗藥性之菌株，該毒素取自第一血清型的Ap，然而以傳統(tǒng)方法培養(yǎng)抽取Ap外毒素需用昂貴的NAD(Nicotinamide adeninedinucleotide)，導致制造成本偏高，若采用基因重組方法制成次單位疫苗則可降低10倍左右之成本，因而提高效益及實用性，可造福養(yǎng)豬業(yè)界。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是有關(guān)一新穎胸膜肺炎放線桿菌疫苗，特別是針對豬胸膜肺炎之疫苗。包括以分子選殖之方法取自Ap第1血清型之ApxI基因所得之重組ApxI多勝肽，以及Ap第1血清型、第2血清型與第5血清型之死菌混合疫苗。不同于Frey與Nicolet[Infect.Immun.562570-2575(1998)]及Frey等人[Infect.Immun.572050-2056(1989)]于Ap第1血清型的細胞培養(yǎng)上層液內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的分子量為105kDa，PI值為4.3之不耐熱溶血素以及分子量僅為27kDa之輔溶血素(cohaemolysin)，本案發(fā)明人利用50％至70％的硫酸銨鹽析方法自Ap細胞培養(yǎng)上層液內(nèi)分離純化蛋白，初期得到主要含有一分子量為104kDa，pI值為7.1，不具有溶血作用之耐熱的多勝肽[Chang and Chen，Proceedings，The 8thSeminaron S cience andTechnology，p.103-115(1988)]。本案發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，當以此新分離的多勝肽以人工接種方式感染小白鼠與豬只之呼吸系統(tǒng)時，其于小白鼠與豬只肺部引起的組織病變類似于以Ap活菌進行感染者，其所導致的肺部損害包括單核細胞與多形核細胞的浸潤，出血，水腫等。此外，當以豬抗Ap血清與此多勝肽進行抗原抗體反應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)該抗血清會與此多勝肽結(jié)合，因此這些實驗結(jié)果應(yīng)可證明此新分離出的多勝肽是Ap所分泌之一種溶血素可能與Ap之毒性或致病力有關(guān)，職是，以該多勝肽作為免疫豬只不受Ap感染之疫苗或其有效成分應(yīng)是可行。
本案發(fā)明人于是進一步研究，當以上述新穎之基因工程重組多勝肽混撬Ap死菌來配制疫苗時，其對豬只是否能產(chǎn)生免疫保護效用。令人興奮地，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由此Ap之ApxI類毒素與Ap第1、2及5血清型之死菌所構(gòu)成之混合疫苗確實可提供較傳統(tǒng)式死菌疫苗為優(yōu)之免疫保護作用(表二)。
選擇適用于配制本案胸膜肺炎放線菌類毒素ApxI與死菌混合疫苗之佐劑，應(yīng)屬熟于此項技藝人士所知之范圍，而配合施予疫苗之方式，該等佐劑可包括氫氧化鋁水性佐劑、礦物油、明礬、合成聚合物以及完全或不完全Freund氏佐劑等，尤以不完全Freund氏佐劑為佳。
本案混合疫苗之組成可以1ml之死菌疫苗，其中該死菌是將Ap第1、第2及5血清型之死菌等量混合而成，其每型之死菌濃度以50mg/ml為佳，再加上1ml之Ap類毒素混合即成，其中該類毒素之濃度為2mg/ml。于配制此疫苗時可加入1ml之不完全Freund氏佐劑予以乳化。
應(yīng)注意的是本發(fā)明疫苗之施予方式并不限于此處所教示者，其依制備型式而可分為肌肉內(nèi)、皮下或者與飼料混合或制成錠劑以口服式施予。


圖1、說明ApxI PCR DNA片段及載體pET32a DNA1.λ/HindIII分子標示2.ApxI PCR DNA片段(3.0kbp)3.載體pET32a DNA(5.9kbp)圖2、說明篩選之ApxI-9864 DNA用BamHI及XhoI切之結(jié)果Mλ/HindIII分子標示1ApxI DNA片段(3.0kb)及Vector pET32a DNA(5.9kbp)圖3、說明本發(fā)明所研發(fā)之pET32a與ApxI之重組構(gòu)筑圖。
圖4、說明SDS平板電泳分析結(jié)果M分子量標示1ApxI(取自選殖株CH9864)以8M尿素萃取之粗制蛋白質(zhì)2～6為Ni-NTA親和性管柱分離純化之各階段(fraction)，其中5及6均可得到純化，分子量為130kDa之重組ApxI重組蛋白質(zhì)7取自Ap第1血清型之ApxI(104kDa)(對照組)圖5、說明西方氏轉(zhuǎn)漬法分析結(jié)果M分子量標示1ApxI(取自選殖株ApxI-9864)表現(xiàn)之重組融合蛋白，分子量為130kDa2取自Ap第1血清型之溶血素(分子量為104kDa)3pET32a在E.coli BL21(DE-3)所表現(xiàn)之蛋白質(zhì)(對照組)圖6、說明以基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗免疫之豬只以3×109活菌(Ap第1、2、5血清型各為1×109混合而成)點鼻攻擊后，肺臟之組織病理無特異性之變化。
圖7、說明以商品化死菌免疫之豬只以3×109活菌(Ap第1、2、
5血清型各為1×109混合而成)點鼻攻擊后，肺臟之組織仍會呈現(xiàn)水腫、出血等病灶。
圖8及圖9、說明對照組之豬只以3×109活菌(Ap第1、2、5血清型各為1×109混合而成)點鼻攻擊后之(圖9)肉眼病變，肺呈現(xiàn)腫脹、出血、硬塊之病灶；及組織病理變化，呈現(xiàn)出血、水腫及單核細胞呈紡錘狀(或燕麥型細胞)漩渦狀排列，即呈現(xiàn)典型的放線桿菌胸膜肺炎之病變。
該疫苗現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址北京市中關(guān)村北一條13號中科院微生物所；保藏日期2002年7月22日；保藏編號0778；分類命名大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
具體實施例方式
實驗案例一、菌株(1)野外菌株自臺灣南部各養(yǎng)豬場之病例中分離，以下述標準菌株免疫兔子后所得之抗血清加以鑒定之。該野外菌株進一步供作本案發(fā)明人所自制之死菌疫苗成分。
(2)標準菌株(供鑒定上述野外菌株用)Ap第1、2及5血清型由臺糖畜產(chǎn)研究所張靖男博士分讓。
案例二、胸膜肺炎放線桿菌(Ap)第1血清型溶血素ApxI之制備(1)細菌基因體(genomic)DNA的制備細菌基因體DNA的制備是Roussel及Chabbert{J.Gen.Microbioi，104269-276(1978)}的方法稍作修改將第1血清型之Ap野外株(CH9800)培養(yǎng)于200ml的BHI培養(yǎng)液并含有0.01％NAD(nicotinamide adenine dinucleotide，Sigma)18小時候，于4℃，10,000xg離心30分鐘后，取其沉淀加15ml之TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，Ph8.0)混合，再以10,000xg離心15分鐘，取其沉淀物加4ml TE，并同時加入100μl之Lysosome(10mg/ml in TE)及100μl之Rnase A(10mg/ml in 0.15MNaCl)于37℃作用30分鐘后，再加入200μl之20％sodium laurylsulphate及最后濃度為100μl/ml的proteinase K，于室溫作用18小時，再以12,000xg，于4℃離心30分鐘，取上清液加入等體積的phenolchloroformisoamylacohol(25∶24∶1)萃取溶液，均勻混合，以10,000xg離心10分鐘后，取上清液，重復萃取一次，再緩緩加入等量的乙醚，10,000xg離心10分鐘后取底層溶液(含genomic DNA)置于68℃水浴槽中直到無乙醚味道，加入1/25體積的5M NaCl及2.5倍體積的100％酒精，置于-70℃中15分鐘加入5ml的70％酒精，再以12,000xg，于4℃離心10分鐘后，棄上清液，將沉淀物置于真空干燥機中干燥15分鐘，加入適量TE溶液使genomicDNA充分溶解后備用。
(2)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)根據(jù)已發(fā)表的第1血清型Ap之ApxI基因合成兩個引子(ApxI-B15’GCGGGATCCATGGCTAACTCTCAGCTCGA3’及ApxI-XS5’AAGCCCGGCTCGAGTTAAGCTGCTTGTGCTAAAGAATA3’，其中GGATCC為限制酶BamHI切位，CCCGGG為限制酶SmaI切位，CTCGAG為限制酶XhoI切位)。利用這兩個引子及第1血清型之Ap基因體DNA為模板進行PCR反應(yīng)，而得到一具有3072核苷酸(3.072kbp)的DNA產(chǎn)物。
PCR的反應(yīng)過程如下于94℃下作用5分鐘，將兩股DNA分開(即所謂的變性)之后再重復下列反應(yīng)35次；94℃變性1分鐘之后于50℃，1分鐘使引子粘至DNA上互補的位置，再于68℃，1.5分鐘讓DNA聚合酶進行DNA的合成，每次反應(yīng)后之68C的反應(yīng)時間比前次增加3秒鐘，35次后再于68℃反應(yīng)5分鐘。
(3)表現(xiàn)載體pET32a表現(xiàn)載體pET32a購自美國Novagen公司(Novagen，WI，USA)。此載體能大量表現(xiàn)選殖于其上的基因，而且所表現(xiàn)之融合蛋白質(zhì)上帶有6X His·Taq，以方便而后蛋白質(zhì)的純化。
(4)重組表現(xiàn)載體之構(gòu)筑將上述聚合肽鏈反應(yīng)DNA產(chǎn)物以限制酶BamHI及XhoI處理后再粘結(jié)(ligated)到用相同之限制酶處理并去磷過的表現(xiàn)載體pET32a。將粘結(jié)完畢之重組載體DNA轉(zhuǎn)形(transform)到E.coliBL21(DE-3)，并將此轉(zhuǎn)形菌液均勻地涂抹于含ampilillin(100μg/ml)及chloramphenicol(34μg/ml)的LB agarplate上，經(jīng)18小時的培養(yǎng)。之后，從培養(yǎng)基中挑選單獨之菌落于4ml，含ampicillin(100μg/ml)及chloramphenicol(34μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)18小時后，抽取質(zhì)體(plasmid)。將抽取之質(zhì)體DNA，用限制酶BamHI及XhoI處理后，經(jīng)agarose電泳分析以判定所選殖的菌株中的載體是否含有插入的外源ApxI基因(3.072kbp)，并將DNA定序以確定ApxI基因之核苷酸序列。
(5)DNA定序核苷酸序列之決定是利用DNA自動分析儀(DNA antomatedsequencer，ABI Prism，model 337，version 3.0，AppliedBiosystems，USA)行之，在定序過程，所用的引子是根據(jù)前面已解析出來的核苷酸序列而設(shè)計。
(6)ApxI蛋白質(zhì)之表現(xiàn)將選殖成功之菌株于4ml，含ampicillin(100μg/ml)及chloramphenicol(34μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18小時，取1ml菌液加入9ml同樣的培養(yǎng)基中再于37℃培養(yǎng)2.5小時，加入10μl之IPTG(1M)后，于37℃再培養(yǎng)4小時。在4℃把菌液以10,000xg離心15分鐘后，取其沉淀加2ml含10％glycerin之PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4.7H2O，1.4Mm KH2PO4，pH7.3)溶液，用sonicator將細胞打破，再以12,000xg離心15分鐘，去上清液后將沉淀物加入0.8ml的蛋白質(zhì)萃取緩沖液(proteinextraction buffer1.5％N-lauryl sarcosin，25mM Tris-HCl，1 mMEDTA，pH8.0)，或采用8M尿素(urea)溶于0.1M磷酸緩沖溶液(pH8.0)內(nèi)，置于4°C作用18小時，以12,000xg離心15分鐘后取上清液，將此萃取液裝入透析膜并置入PBS內(nèi)透析18小時，即得粗制之表現(xiàn)蛋白質(zhì)。
(7)蛋白質(zhì)之純化蛋白質(zhì)之純化是以Ni-NTA column(QUAGEN GmbH，Hilden，Germany)進行，先組合Ni-NTA所附之column，加入600μl緩沖液B(8M Urea，0.1M Na-phosphate，0.01M Tris-HCl，pH8.0)于column中，以2,000xg離心2分鐘，丟棄離心下來之液體，重新組合column并加入上述之萃取蛋白質(zhì)上清液600μl(經(jīng)緩沖液B處理過)，以2,000xg離心2分鐘后，保存離心下之液體(此為a部份)，再將Ni-NTAcolumn重新組合加入600μl緩沖液C(8M Urea，0.1M Na-phosphate，0.01M Tris-HCl，pH6.3)，以2,000xg離心2分鐘后，保存離心下之液體(此為b部份)，再將Ni-NTA column重新組合加入200μl緩沖液E(8M Urea，0.1M Na-phosphate，0.01M Tris-HCl，pH4.5)，以2,000xg離心2分鐘后，保存離心下之液體(此為c部份)，取適當量之a(chǎn)，b，c做SDS-PAGE電泳分析，判讀結(jié)果。
(8)SDS-PAGE電泳分析根據(jù)Sambrook等人{Molecular Cloning，p.18.47-18.48(1989)}的方法將表現(xiàn)所得的純化蛋白質(zhì)和SDS sample buffer以等量混合，于100℃煮2.5分鐘后，用12％SDS-PAGE經(jīng)150伏特，1.5小時電泳，后以0.2％Coomassie brilliant blue染色，7％醋酸溶液脫色后觀看結(jié)果。
案例三、死菌之制備將第1、2及5血清型之胸膜肺炎放線桿菌分別培養(yǎng)于上述BHI中6小時，然后以4℃，10,000xg，離心30分鐘，取其沉淀之菌體(上清液供制備外毒素之用)，經(jīng)0.9％NaCl，洗滌三次，然后分別將每一血清型之菌液以0.9％NaCl調(diào)制適當量，加0.2％福馬林于37℃，18小時后，再以0.9％NNTal洗滌三次，然后將菌液分別調(diào)至50mg/ml(濕重)之菌液。將第1、2及5型(50mg/ml)之菌液做成等體積之混合，存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 案例四、胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素與死菌混合疫苗之制備如上述案例三所制備之死菌，即Ap血清第1、2及5型之死菌各50mg與上述二以分子基因選殖所表現(xiàn)的ApxI粗制蛋白2mg混合成1ml(經(jīng)0.2％福馬林化)，然后與佛氏不完全佐劑等量混合乳化后，即為對每一頭豬的一個免疫劑量。免疫時，對豬行肌肉注射，至于小鼠之免疫途徑則按“動物用藥品管理法”之規(guī)定進行之。
案例五、安全及效力試驗(1)安全試驗(a)選10～15公克健康小白鼠40只，各以本劑腹腔接種0.5公攝，另取40只為對照，觀察二周，須無任何反應(yīng)而健存。
(b)選體重約350公克健康天竺鼠2只，各以本劑皮下接種1公攝，觀察10天，須無任何反應(yīng)而健存。
(c)選嗜血桿菌抗體陰性(6至8周齡)小豬2頭，依用法各接種5劑量，觀察2周，須無任何不良反應(yīng)而健存。
(2)效力試驗將安全試驗后之免疫小白鼠，分成四組，各組分別以強毒菌株培養(yǎng)液之100至10-3稀釋量接種于腹腔內(nèi)攻擊；對照小白鼠亦分四組，各以10-1至10-4四個稀釋量菌液接種于腹腔內(nèi)，觀察一周，然后二群分別依Beherens-Karber法計算LD50，結(jié)果其防御力價大于10倍以上。
案例六、實驗動物及飼料實驗動物為體重20公克之小鼠(BALB/C)及六周齡豬(LYD三品種)；飼料之主要成分為玉米、豆粉、魚粉、鈣、磷、維他命等。
案例七、抗體之測定采用細菌凝集試驗{Gunnarsson et al.，Am.J.Vet.Re s.381111-1114(1977)}，陽性對照組采用人工感染之豬血清，而陰性對照組用SPF豬血清。
案例八、西方氏墨點轉(zhuǎn)漬法(Wesern Blotting Assay)[Towbinet al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 764350-4354(1978)]蛋白質(zhì)經(jīng)上述SDS平板電泳完成后立即使用西方氏墨點轉(zhuǎn)漬套組(Bio-Rad)將SDS-聚丙烯醯胺膠片轉(zhuǎn)漬至Nitrocellulose紙(0.2μm)上，實施之條件為1A，150V，1小時，并有冰水冷卻循環(huán)系統(tǒng)。第一抗體使用Ap外毒素免疫豬或Ap感染豬之血清，第二抗體使用兔抗豬之IgG抗體與過氧化氫的結(jié)合體，基質(zhì)為0.1％H2O2，呈色劑為Diamino-benzidine(DAB，Sigma)。
案例九、蛋白質(zhì)濃度之測定采用Bio-Rad系統(tǒng)測定之[張甘楠，中華民國獸醫(yī)學會志，1341-56(1976)]。
案例十、等電焦點(Isolectric Focussing，IEF)采用Pharmaciapha stsystem，pH3-10梯度聚丙烯醯胺膠片實施，條件為2000V，2.5mA，3.5W，410Vh，染色及脫色如上述SDS-平板電泳方式。
案例十一、病理組織切片經(jīng)過人工接種攻擊后，及肺臟除肉眼判定其肺臟病灶點數(shù){張甘楠，中華民國獸醫(yī)學會志，1745-57(1991)}外，將有病變或必要之組織如氣管、肺門淋巴及肺組織固定于10％福馬林溶液內(nèi)后以石臘包埋，作成切片，經(jīng)H.E.染色，鏡檢。本發(fā)明所以采用組織病理學來評估疫苗之效力是因為在攻擊后，雖然活存但肺如有組織病理變化時則僅僅依其活存率來評估疫苗之效力并非客觀，因此免疫豬在攻擊后一周尚存活者予以全部撲殺剖檢，檢視其組織病理之變化，以求得真正的免疫保護效力。
結(jié)果本發(fā)明是采用基因遺傳工程方法，將取自Ap(Actinobacilluspleuropneumoniae)第1血清型之菌體DNA(genomic DNA)當作模版，設(shè)計一對特異性的引子(primer)，以聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerasechain reaction，PCR)方法以增幅其ApxI之基因(大小為3.0kb)做為嵌入DNA(insert DNA)，并采用pET32a為載體(vector，其大小為5.9kb)，以進行DNA重組，經(jīng)選殖手續(xù)，得一重組DNA之選殖株(clone)，命名為ApxI-9864，該重組DNA載體，pApxI-9864以BamHI及SamI限制酶切割后，經(jīng)1.2％瓊脂平板(agarose)電泳分析結(jié)果確實可得到一嵌入DNA為3.0kb，載體為5.9kb(如圖1)。本發(fā)明所研發(fā)之pET32a與ApxI之重組構(gòu)筑圖，如圖2所示。
該重組之DNA(圖2)經(jīng)轉(zhuǎn)殖于大腸桿菌BL21(DE-3)后，以1mMIPTG誘發(fā)進行蛋白質(zhì)表現(xiàn)，經(jīng)SDS平板電泳分析結(jié)果獲知其主要成分為含有一分子量為130kDa之ApxI溶血素之融合多勝肽，與取自Ap第1血清型之6小時培養(yǎng)液上層液所得之溶血素104kDa有所區(qū)別(如圖3)，但西方氏轉(zhuǎn)漬法分析結(jié)果顯示取自Ap CH9864重組之融合蛋白與Ap第1血清型之溶血素特異性抗體有強烈的結(jié)合反應(yīng)(如圖4)。
本發(fā)明所提出申請專利之選殖株ApxI-9864經(jīng)DNA之核苷酸及蛋白質(zhì)之氨基酸序列分析如圖5所述。
本發(fā)明是采用Ap血清型第1、2、5型之死菌各50mg與上述選殖株ApxI-9864所表現(xiàn)的粗制蛋白ApxI 2mg混合成1ml，然后與等量的佛氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)混合，乳化后即為每一頭豬之一個免疫劑量，免疫豬時采用肌肉注射，至于小鼠之免疫途徑則依照“動物用藥品管理法”之規(guī)定進行之。免疫后之結(jié)果如表一，表二及表三所示表一豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗之效力試驗項目 攻 擊 前攻擊后之保護效力b攻擊 免疫組 對照組 免疫組 對照組 防御菌量a (小鼠總數(shù))(小鼠總數(shù))(小鼠死亡/總數(shù)) (小鼠死亡/總數(shù)) 力價10010 - 10/10 -10-110 10 1/10 10/1010-210 10 0/10 7/10 101.910-310 10 0/10 3/10 (74.9)10-4-10 - 0/10a攻擊之菌量為Ap血清型1、2、5型等三種，經(jīng)18小時培養(yǎng)之菌液以等量混合，其菌量為4×109/ml，攻擊菌量為此菌量依10倍稀釋法連續(xù)稀釋之。
b攻擊后觀察一周，然后免疫組與對照組分別依Beherens-Karber法計算其LD50，求其防御力價須大于10倍以上才算合格。本試驗之防御力價為免疫組LD50/對照組LD50＝10-0.6/10-2.6＝101.9＝74.9＞10。因此，按“動物用藥品管理法”第五十八節(jié)第138條第六項效力試驗，防御力價大于10倍以上，即為合格之疫苗。
表二豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗使用于胸膜肺炎放線桿菌污染豬場之效力試驗。
項目商品化死菌疫苗a基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗b免疫豬頭數(shù) 100 64免疫后有咳嗽癥狀頭數(shù)72 15免疫后發(fā)病死亡頭數(shù) 37 9
保護效力 63％(63/100) 85.9(55/64)a免疫時間為第六周齡及第九周齡，各免疫注射一次(肌肉注射)，然后現(xiàn)場追蹤其臨床癥狀及死亡情形，觀察期間為八周(即至豬只至第17周齡為止)。
b凡死亡之豬只攜回實驗室進行病理解剖，并進行Ap細菌分離及鑒定，并以組織病理學方法評估之，以上確定有分離到Ap者及特征之組織病理變化者判定為死亡病例。
表三豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗或死菌疫苗免疫豬只后，對以活菌攻擊的豬只之保護效力測試。

a以胸膜肺炎放線桿菌(Ap)血清型1、2、5活菌(每一血清型1×109)共3×109/ml對每一頭豬以點鼻方式行人工攻擊。攻擊后1～3天進行肺臟病灶點數(shù)判讀。
b肺臟病灶點數(shù)(lesion scorse)之判讀0正常，1輕微病灶，2中等程度，3嚴重程序，4死亡。
c細菌回收試驗是從肺臟病灶處，每個肺臟以四個巧克力培養(yǎng)基分離以Api系統(tǒng)進行細菌鑒定，并采用標準血清進行血清型之鑒定。
+可分離到Ap，-不能分離到Ap。
由表一可知本發(fā)明之豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗之防御力價為74.9倍(大于10倍)，此結(jié)果符合。
由表二獲知在污染豬胸膜肺炎放線桿菌之養(yǎng)豬場，若使用本發(fā)明之基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗免疫之豬只，其保護效力高達85.9％(55/64)，優(yōu)于商品化之死菌疫苗之保護效力63％(63/100)，此為現(xiàn)場追蹤之結(jié)果。另者，本發(fā)明之試驗過程中將現(xiàn)場免疫后之豬只攜回實驗室以3×109活菌進行人工點鼻攻擊及細菌回收試驗，結(jié)果得知基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗免疫之豬只其肺臟病灶點數(shù)(lesion scores)平均為0.3，死菌疫苗免疫組平均0.75，而對照組(未經(jīng)免疫)平均為3.75，各組之間有著顯著之差異(p＜0.01)。至于細菌回收試驗結(jié)果，基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗免疫組在攻擊后其細菌回收率為10％(3/30)，死菌疫苗免疫組(商品化之死菌疫苗)細菌回收率為50％(6/12)，而對照組之細菌回收率為83.330％(10/12)?？傊景l(fā)明之基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗對豬胸膜肺炎放線桿菌之回收率低(10％)均優(yōu)于市售之商品化死菌疫苗。市售死菌疫苗細菌回收率為50％。
死菌疫苗之菌株若與現(xiàn)場所流行之菌株之血清型不同時，疫苗之效力將會大打折扣，而基因工程類毒素ApxI刺激豬只產(chǎn)生抗ApxI之抗體，可以克服不同血清型之困擾，因為ApxI毒素有許多血清型均會分泌，如此以CloneApxI-9864所產(chǎn)生的抗體可以涵蓋多種血清型之特異性免疫反應(yīng)，致使類毒素ApxI疫苗呈現(xiàn)優(yōu)異的保護效力，至于類毒素ApxI混合死菌之理由，乃是取該死菌之K-抗原，本發(fā)明不愿放棄Ap之K-抗原，使本發(fā)明之豬胸膜肺炎放線桿菌類毒素ApxI與死菌混合疫苗之抗原性具備其周全性。
另者，本發(fā)明之試驗過程中特以組織病理學來評估以3×109活菌點鼻攻擊后各免疫組之肺臟組織病理學變化，并計算其病變點數(shù)(lesion scores)因為攻擊后之豬只存活乃為假象，應(yīng)以實際上肺臟之病灶點數(shù)及肺的組織病理學病變?yōu)檎嬲卸ㄖ畼藴剩拍艽_定疫苗真正的效力。試驗結(jié)果獲知以本發(fā)明之基因工程類毒素ApxI與死菌混合疫苗免疫后之豬只經(jīng)上述活菌攻擊后其肺臟無特異性之病變(如圖6)，而死菌疫苗(商品化之死菌疫苗)免疫后之豬只其肺臟仍有出血、水腫等之病變(如圖7)，至于對照組則呈現(xiàn)肉眼可見之放線桿菌豬胸膜肺炎的明顯病變(如圖8)組織病理學變化亦呈現(xiàn)出血、水腫、單核細胞之浸潤、而且單核細胞呈紡錘狀且有漩渦狀之排列(如圖9)。
CloneApxI-9864ATG GCT AAC TCT CAG CTC GAT AGA GTC AAA GGA TTG ATT GAT TCA CTT AAT 51Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu AsnCAA CAT ACA AAA AGT GCA GCT AAA TCA GGT GCC GGC GCA TTA AAA AAT GGT 102Gln Hls Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys Asn GlyTTG GGA CAG GTG AAG CAA GCA GGG CAG AAA TTA ATT TTA TAT ATT CCG AAA 153Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu lle Leu Tyr Ile Pro LysGAT TAT CAA GCT AGT ACC GGC TCA AGT CTT AAT GAT TTA GTG AAA GCG GCG 204Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala AlaGAG GCT TTA GGG ATC GAA GTA CAT CGC TCG GAA AAA AAC GGT ACC GCA CTA 255Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val Hls Arg Ser Glu Lys Asn Gly Thr Ala LeuGCG AAA GAA TTA TTC GGT ACA ACG GAA AAA CTA TTA GGT TTC TCG GAA CGA 306Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu Leu Gly Phe Ser Glu ArgGGC ATC GCA TTA TTT GCA CCT CAG TTT GAT AAG TTA CTG AAT AAG AAC CAA 357Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp Lys Leu Leu Asn Lys Asn GlnAAA TTA AGT AAA TCG CTC GGC GGC TCA TCG GAA GCA TTA GGA CAA CGT TTA 408Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg LeuAAT AAA ACG CAA ACG GCA CTT TCA GCC TTA CAA AGT TTC TTA GGT ACG GCT 459Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr AlaATT GCG GGT ATG GAT CTT GAT AGC CTG CTT CGT CGC CGT AGA AAC GGT GAG 510Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly GluGAC GTC AGT GGT TCG GAA TTA GCT AAA GCA GGT GTG GAT CTA GCC GCT CAG 561Asp Val Ser Gly Ser Glu Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala GlnTTA GTG GAT AAC ATT GCA AGT GCA ACG GGT ACG GTG GAT GCG TTT GCC GAA 612Leu Val Asp Asn Ile Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Lla Phe Ala GluCAA TTA GGT AAA TTG GGC AAT GCC TTA TCT AAC ACT CGC TTA AGC GGT TTA 663Gln Leu Gly Lys Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly LeuGCA AGT AAG TTA AAT AAC CTT CCA GAT TTA AGC CTT GCA GGA CCT GGG TTT 714Ala Ser Lys Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly PheGAT GCC GTA TCA GGT ATC TTA TCT GTT GTT TCG GCT TCA TTC ATT TTA AGT 765Asp Ala Val Ser Gly lle Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe lle Leu SerAAT AAA GAT GCC GAT GCA GGT ACA AAA GCG GCG GCA GGT ATT GAA ATC TCA 816Asn Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly lle Glu Ile SerACT AAA ATC TTA GGC AAT ATC GGT AAA GCG GTT TCT CAA TAT ATT ATT GCG 867Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile AlaCAA CGT GTG GCG GCA GGC TTA TCC ACA ACT GCG GCA ACC GGT GGT TTA ATC 918Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly Leu Ile
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權(quán)利要求
1.一種豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI，其特征在于以基因工程方法制造之胸膜肺炎放線桿菌Ap第1血清型的溶血素ApxI，該溶血素系Clone自ApxI-9864。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI，其特征在于其基因DNA序列及氨基酸序列為(如圖6內(nèi)容)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI，其特征在于其系以基因工程方法選殖自胸膜肺炎放線桿菌第一血清型之菌體DNA，并構(gòu)筑于表現(xiàn)載體pET32a，經(jīng)轉(zhuǎn)形于大腸桿菌大量表現(xiàn)而得到之類毒素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI，其特征在于該基因工程類毒素ApxI為分子量為130kDa之融合蛋白，不具溶血作用，但能與胸膜肺炎放線桿菌第1血清型之溶血素104kDa之特異性抗體產(chǎn)生強烈之結(jié)合反應(yīng)。
5.一種防治溫血動物感染疾病之疫苗，其特征在于其含有根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌基因工程類毒素ApxI，胸膜肺炎放線桿菌第1血清型、第2血清型及第5血清型死菌，及制造疫苗容許之佐劑及賦型劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于其中所含類毒素ApxI之濃度為0.1mg/ml至5mg/ml，其中以2mg/ml為最佳。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于其中死菌系由Ap第1血清型、第2血清型或第5血清型，并以0.2％福馬林化之死菌疫苗等量混合而成，死菌之濃度為10mg/ml至70mg/ml之間，其中以50mg/ml為佳。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于其中之佐劑如水性氫氧化鋁、礦物油、明礬、合成聚眾合物例如poly(I)、poly(A)、poly(U)或poly(C)、Freund氏不完全佐劑及大腸桿菌忌熱性腸毒素LT(heat-labile enterotoxin)及該LT之次單位LTA2/B或LTB，其中以Freund氏不完全佐劑為佳。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于免疫途徑系以肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、混合于動物飼料中，或制成錠劑以口服方法施予。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1制造溶血素ApxI的方法，其包含(i)將ApxI基因構(gòu)筑于pET32a之表現(xiàn)質(zhì)體，可得到clone ApxI-9864，以容許之誘導劑誘導后經(jīng)4小時37℃震蕩表現(xiàn)經(jīng)10％甘油磷酸緩沖溶液處理再以蛋白質(zhì)萃取緩沖溶液(1.5％N-lauryl sarcosin，25mMTris-Hcl，1mM EDTA，pH8.0)或8M尿素(Urea)溶于0.1M磷酸緩沖溶液(pH8.0)內(nèi)獲得類毒素ApxI。(ii)根據(jù)申請專利范圍第5項該類毒素ApxI可標定效價，其中以每頭豬2mg的劑量為佳。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至5項中的任一項，其特征在于類毒素ApxI基因之構(gòu)筑可連接其他細菌或病毒之基因進行蛋白質(zhì)表現(xiàn)，及其所衍生出來的具有類似與本發(fā)明之類毒素ApxI功能之融合蛋白。
全文摘要
一種含有以基因工程方法所研制之胸膜肺炎放線桿菌(Ap)第1血清型的溶血素ApxI加入胸膜肺炎放線桿菌第1血清型、第2血清型與第5血清型死菌之混合疫苗。該ApxI溶血素是以基因工程方法選殖自胸膜肺炎放線桿菌第一血清型之菌體DNA，并構(gòu)筑于表現(xiàn)載體pET32a經(jīng)轉(zhuǎn)形于大腸桿菌大量表現(xiàn)而得到之類毒素ApxI，其主要萬分為含有一分子量為130kDa之ApxI溶血素的融合多勝肽，是一種強力之免疫原，但不具有溶血作用。
文檔編號C07K14/195GK1511844SQ02138068
公開日2004年7月14日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日
發(fā)明者張甘楠, 何國杰 申請人:張甘楠, 何國杰