專利名稱：減毒的活胸膜肺炎放線桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在編碼毒素基因中具有突變的減毒活胸膜肺炎放線桿菌，用于制備該細(xì)菌的方法，包括該細(xì)菌的疫苗，制備這種疫苗的方法，包括毒素的疫苗，制造這種疫苗的方法以及用于保護(hù)動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌感染的方法。
放線桿菌屬的細(xì)菌均產(chǎn)生所謂的RTX-毒素。(RTX代表毒素中的重復(fù))。
正是由于這些RTX-毒素的存在才高度地促成了這些細(xì)菌的病原性特征。
RTX-毒素已由Braun等進(jìn)行了廣泛綜述。(微生物學(xué)關(guān)鍵綜述18(2)115-158(1991))。革蘭氏陰性菌株的RTX-毒素也已由Welch，R.A.(分子微生物學(xué)5/3521-528(1991))和Welch等(感染源和疾病4254-272(1995))加以綜述。
所有已知的RTX-毒素顯示一定種類的細(xì)胞毒或溶細(xì)胞活性。然而依據(jù)毒素和?；牟町悾屑?xì)胞和宿主特異性各有不同(McWhinney等；細(xì)菌學(xué)雜志174291-297(1992)和Hackett等；生物化學(xué)雜志27020250-20253(1995))。由于靶細(xì)胞的不同，RTX-毒素家族的多種毒素稱為如溶血素、溶細(xì)胞素或細(xì)胞毒素。
放線桿菌屬包括許多不同種，特別是胸膜肺炎放線桿菌、體放線放線桿菌、豬放線桿菌、羅氏放線桿菌、馬駒放線桿菌(A.equuli)和李氏放線桿菌(A.Lignieresi)。
胸膜肺炎放線桿菌產(chǎn)生血清型依賴性RTX-毒素，其對(duì)豬、馬、牛和人類紅細(xì)胞、兔和豬嗜中性細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞是細(xì)胞毒性/溶細(xì)胞性的(Rosendel等；美國(guó)獸醫(yī)研究雜志，491053-1058(1998)，MaudsleyJ.R.和Kadis S；加拿大微生物學(xué)雜志，32801-805(1986)，F(xiàn)rey.J和Nicolet J；感染與免疫，562570-2575(1988)，Bendixon等；感染與免疫，33673-676(1981)，Kamp，E.M.和VanLeengoed，L.A.M.G.；臨床微生物學(xué)雜志，271187-1191(1989))。
豬中放線桿菌的感染，由于小豬的急性致死和大齡動(dòng)物體重凈增的下降而導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)中嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
革蘭氏陰性細(xì)菌中涉及RTX-毒素合成，激活和運(yùn)輸?shù)牟倏v子的遺傳結(jié)構(gòu)最近已由Coote，J.G加以綜述(FEMS微生物學(xué)綜述88137-162(1992))。Frey已在細(xì)菌蛋白毒素，Zbl Bakt增刊，24，p.322-，F(xiàn)reer等.(編)，Gustaf Fischer，Stuttgart，Jena，紐約，1994中對(duì)胸膜肺炎放線桿菌中的已知三種RTX-毒素進(jìn)行了具體的綜述。
在胸膜肺炎放線桿菌中，此種RTX-操縱子含有4個(gè)基因?qū)嶋H的毒素-基因(A)，激活基因(C)和2個(gè)編碼涉及毒素分泌至周圍介質(zhì)蛋白的基因(B和D)。毒素基因(A)的初級(jí)翻譯產(chǎn)物是無(wú)毒性的蛋白，其中的毒素活性由激活基因(C)產(chǎn)物所激活。
直到最近，認(rèn)為只有具有上述遺傳結(jié)構(gòu)或至少具有毒素-基因(A)及激活基因(C)的三種RTX-毒素才存在于放線桿菌中。
這三種RTX-毒素，ApxI、Apx-II和Apx-III分別具有顯著的溶血活性(ApxI)、溫和的溶血活性(Apx-II)或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(Apx-III)。
各種毒素的活性以不同的血清型相當(dāng)隨機(jī)地劃分。存在四種亞型由血清型1，5，9和11所代表的亞型A，產(chǎn)生ApxI和Apx-II，由血清型2，3，4，6和8所代表的亞型B，產(chǎn)生Apx-II和Apx-III，由血清型10所代表的亞型C，僅產(chǎn)生ApxI，由血清型7和12所代表的亞型D，僅產(chǎn)生Apx-II，已知，ApxI、-II和-III是抗胸膜肺炎放線桿菌感染的一般疫苗中的必需成分不包括至少ApxI、-II和III的疫苗將不提供對(duì)所有胸膜肺炎放線桿菌血清型的保護(hù)。同樣，不包括至少一種特異血清型Apx-毒素的疫苗將甚至不會(huì)誘導(dǎo)對(duì)單-血清型的保護(hù)。
較早時(shí)期已描述了基于體外合成，喪失其毒性的胸膜肺炎放線桿菌RTX-毒素的亞單位疫苗，如在歐洲專利EP NO.0354.628中所述，其中公開(kāi)了基于胸膜肺炎放線桿菌溶血素和細(xì)胞毒素的亞單位疫苗，并且在歐洲專利EP NO.0453.024中所述，其中公開(kāi)了基于溶血素、細(xì)胞毒素和外膜蛋白的胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗。
然而對(duì)亞單位疫苗來(lái)說(shuō)一般具有4個(gè)重要的不足·為了充分地激活免疫系統(tǒng)需要大量的免疫原性材料。
·通常僅B-細(xì)胞免疫被激活。
·幾種保護(hù)性抗原僅在體內(nèi)被激活，且因此不能夠以亞單位疫苗形式存在。
·活的病原性細(xì)菌具有許多重要的免疫原性分子，如外膜蛋白和莢膜蛋白，它們均對(duì)于保護(hù)至關(guān)重要且因此被包括進(jìn)有效的亞單位疫苗中。
僅次于上述第1和第2點(diǎn)，尤其是第4點(diǎn)的明顯問(wèn)題使得難以制備有效的亞單位疫苗。
這由例如在上述歐洲專利EP NO.0.453.024中公開(kāi)的胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗加以說(shuō)明，其中4種不同的亞單位(三種RTX-毒素和外膜蛋白)結(jié)合于一種疫苗中。
很顯然，為了克服抗Pasteurellaeeae感染亞單位疫苗的不足，一種活的減毒疫苗將是高度需要的。
活減毒疫苗具有下面的優(yōu)勢(shì)其可用低劑量施用(其是自我復(fù)制的)其密切模擬天然/野生-型感染其同時(shí)提供所有可能的免疫學(xué)重要的抗原。不過(guò)，盡管明顯的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明之前還沒(méi)有商業(yè)上可得到的基于胸膜肺炎放線桿菌的活疫苗。其原因在于下面似是而非的論點(diǎn)如前述，Apx-I、-II和-III均是抗胸膜肺炎放線桿菌感染普通疫苗的必需成分。因此活疫苗必需產(chǎn)生這三種RTX-毒素。然而這三種RTX-毒素是所有放線桿菌種類中強(qiáng)有力的毒性因子(見(jiàn)，如Coote，J.G.；FEMS微生物學(xué)綜述88137-162(1992))，Tascon等.；分子微生物學(xué)，14207-216(1994)，Jansen等.；感染與免疫.6327-37(1995))。
為了減弱活A(yù)pp菌株的毒力而對(duì)RTX-毒素的缺失在技術(shù)上是可行的，但其沒(méi)有提供解決問(wèn)題的途徑由于它們不再在宿主中誘導(dǎo)對(duì)胸膜肺炎放線桿菌溶血/細(xì)胞毒活性的免疫性，故這種RTX-陰性菌株作為活減毒疫苗菌株將是無(wú)用的。
然而到現(xiàn)在，盡管在誘導(dǎo)免疫性中是重要的，但在建立免疫性中較ApxI、-II和-III是次要的毒力因子還是未知的。
因此，在App基因組中具有這樣的位點(diǎn)是高度必要的，即該位點(diǎn)當(dāng)被修飾時(shí)有利于毒力且因此導(dǎo)致減毒的App菌株，而同時(shí)，盡管其在激發(fā)免疫性中是有用的，但從疫苗觀點(diǎn)來(lái)看是必不可少的。然而這樣的位點(diǎn)目前還是未知的。此外，如果這樣的位點(diǎn)將普遍存在于所有的App菌株中而不是局限于某些血清型中，該位點(diǎn)是高度必要的。那么這樣的位點(diǎn)將通過(guò)相同位點(diǎn)的缺失允許對(duì)所有不同的血清型減毒。
提供普遍存在于無(wú)論什么血清型的所有胸膜肺炎放線桿菌菌株中的這種減毒位點(diǎn)是本發(fā)明的目的之一。
最近，在胸膜肺炎放線桿菌血清型1菌株中發(fā)現(xiàn)了一種新的基因(論文T.J.Anderson Nov.1995)。
盡管該基因不象已知的放線桿菌的ApxI、-II和-III基因，但其與已知的腦膜炎奈氏球菌的RTX-毒素具有相似性，正是由于此原因?qū)⑵涿麨镽TX-基因apxIV。然而該基因幾乎在所有的方面均與上述存在于各種放線桿菌科的不同種中的三種已知RTX-毒素基因apxI、-II和-III不同。首先，基因組結(jié)構(gòu)完全不同。其次，沒(méi)有如同發(fā)現(xiàn)于已知Apx-毒素的激活機(jī)制。第三，在那時(shí)沒(méi)有特異性的體內(nèi)溶血或細(xì)胞毒活性可歸結(jié)于該基因或其可能的基因產(chǎn)物。
現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)該基因與三種已知的RTX-基因完全不同，無(wú)論其什么血清型存在于胸膜肺炎放線桿菌的所有種類中。這通過(guò)探針雜交加以測(cè)定，該探針包括apxIV編碼序列，此序列中具有實(shí)施例6和7中所述所有血清型胸膜肺炎放線桿菌的DNA限制性片段。出乎意料的是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，雖然apxIV缺失突變體是存活的，但與其具有apxIV的母本菌株相比，它們毒性較小。
因此，已確定該基因產(chǎn)物，ApxIV毒素是所有胸膜肺炎放線桿菌菌株中的毒力因子。這是個(gè)出乎意料的結(jié)論。因?yàn)榈侥壳盀橹?，根本沒(méi)有什么效應(yīng)，更不用說(shuō)可能影響毒力的效應(yīng)被歸結(jié)于該基因的體內(nèi)產(chǎn)物。實(shí)際上，直到現(xiàn)在無(wú)論如何甚至還沒(méi)有該基因在胸膜肺炎放線桿菌體內(nèi)或體外表達(dá)的證據(jù)。因此以下的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一·apxIV基因存在于任何血清型的所有胸膜肺炎放線桿菌菌株中；·apxIV基因產(chǎn)物是所有胸膜肺炎放線桿菌血清型中的毒力因子，·具有apxIV基因缺失的胸膜肺炎放線桿菌菌株仍然是存活的但具有降低的毒力而沒(méi)有顯著減弱該菌株的免疫原性，因此，本發(fā)明首次提供不產(chǎn)生有功能ApxIV毒素的胸膜肺炎放線桿菌活減毒細(xì)菌。
有功能的ApxIV毒素被認(rèn)為是這樣的一種蛋白即其具有在野生型細(xì)菌中表達(dá)ApxIV毒素的所有特征，并且以野生型水平表達(dá)。因此，無(wú)功能的ApxIV毒素被認(rèn)為是這樣的一種毒素即其缺乏在野生型細(xì)菌中表達(dá)ApxIV毒素的部分或所有特征，并且/或者以不足以獲得ApxIV毒素野生型效應(yīng)的水平表達(dá)。
產(chǎn)生ApxIV毒素能力的喪失可，例如是由于編碼ApxIV毒素編碼序列中的修飾。其也可是由于，例如，已知涉及apxIV基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，如啟動(dòng)子區(qū)域的修飾或由于涉及翻譯區(qū)域，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)的修飾。
apxIV基因的整體結(jié)構(gòu)列于圖1中。
該圖中，ApxIV毒素特征性的同向重復(fù)區(qū)由陰影框(dashed box)表示，而也是ApxIV特異的富含-甘氨酸的非肽(nonapeptide)區(qū)由黑箭頭表示。該重復(fù)區(qū)發(fā)現(xiàn)于ApxIV的C-末端部分。這些鑒別性特征存在于所有的胸膜肺炎放線桿菌血清型中。兩種血清型的核苷酸序列和氨基酸序列列于SEQ.ID NO.1-4中。SEQ.ID.NO.1顯示了App血清型1apxIV基因的核酸序列，且SEQ.ID.NO.2顯示了血清型1ApxIV毒素的相應(yīng)氨基酸序列。SEQ.ID.NO.3顯示了App血清型3apxIV基因的核苷酸序列，而SEQ.ID.NO.4顯示了血清型3ApxIV毒素的相應(yīng)氨基酸序列。圖2顯示各種胸膜肺炎放線桿菌血清型的Apx-毒素之間的氨基酸水平，特別位于N-末端的650個(gè)氨基酸具有相當(dāng)高水平的保守性。這也是apxIV基因的異常特性。從圖1中顯而易見(jiàn)，根據(jù)血清型的不同，位于該毒素C-末端重復(fù)數(shù)目的差異可能發(fā)生。此差異解釋了獲自各種血清型基因及編碼毒素大小的差異。
甚至在分離自相同血清型的胸膜肺炎放線桿菌不同分離物的apxIV基因之間可能有某些核苷酸序列的差異。這是由于本領(lǐng)域眾所周知的存在于所有有機(jī)體中的自然變異。在由apxIV基因編碼的ApxIV毒素中某些氨基酸由其它血清型ApxIV毒素中的別的氨基酸所替代是可能的，然而該多肽功能沒(méi)有改變。例如，在某一位點(diǎn)含有Asp的多肽和其相應(yīng)位點(diǎn)含有Asn的變異體仍然具有相同的特性。其中的氨基酸由功能類似氨基酸所替代的方法稱為功能性替換。此時(shí)的變異體蛋白稱為功能性變異體。另一種變異的原因是遺傳密碼簡(jiǎn)并現(xiàn)象。簡(jiǎn)言之，其意思為，例如氨基酸谷氨酸由GAT和GAA所編碼。除了Met和Trp以外，此現(xiàn)象適用于所有的氨基酸。因此，很明顯，例如本發(fā)明給出的血清型1ApxIV毒素可不僅由SEQ ID NO1中的核苷酸序列所編碼而且也可由很多種其它序列所編碼，所有的仍然得到相同或功能相同的多肽。
因此，編碼與ApxIV毒素功能相當(dāng)多肽的變異apxIV序列屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的活減毒細(xì)菌可以幾種方式獲得。獲得該菌一種可能的方式是通過(guò)經(jīng)典方法的途徑，如以誘變劑如堿基類似物處理野生型胸膜肺炎放線桿菌，以紫外光處理或溫度處理細(xì)菌。不產(chǎn)生有功能ApxIV毒素的菌株不誘導(dǎo)或以較小程度誘導(dǎo)抗ApxIV毒素抗體，且因此可容易地在動(dòng)物測(cè)試中加以篩選。必需的抗血清可按下面實(shí)施例3中描述獲得。另一種可能性是用重組DNA-技術(shù)有意識(shí)地向編碼ApxIV毒素的基因中導(dǎo)入詳細(xì)定義的突變。這樣的突變可以是插入、缺失、一個(gè)核苷酸被另一個(gè)所替代或其組合，唯一的條件是該突變基因不再編碼有功能的ApxIV毒素?？扇菀椎乜闯觯绕涫窃陂_(kāi)放閱讀框中導(dǎo)入終止密碼子的突變，或?qū)е麻_(kāi)放閱讀框中移碼的突變很適于獲得不再編碼有功能ApxIV毒素的菌株。這種突變可通過(guò)，例如，用Clontech銷售的Transformer試劑盒的體外定點(diǎn)誘變方法加以完成。許多其它標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)如以限制性酶消化基因，然后以內(nèi)切核酸酶處理和重新連接同樣是可用的。
因此，在優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的該實(shí)施方案涉及其中編碼ApxIV毒素的基因包括突變的活減毒細(xì)菌。
包括apxIV基因片段或甚至整個(gè)基因缺失，或異源DNA-片段插入的詳細(xì)定義的突變，與經(jīng)典誘導(dǎo)的突變相比，具有這樣的優(yōu)勢(shì)即它們將不回復(fù)到野生型狀況。
因此，在更為優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的該實(shí)施方案指其中編碼ApxIV毒素的基因包括插入和/或缺失的活減毒細(xì)菌。
如果現(xiàn)將大量的疫苗施于豬中，只要是為了降低接種費(fèi)用的原因，很明顯幾種疫苗的聯(lián)合施用將會(huì)是合乎需要的。因此，使用活體減毒疫苗菌株作為編碼選自其它病原性微生物或病毒抗原的異源基因的重組載體是很有吸引力的。施用這樣的重組載體具有這樣的優(yōu)勢(shì)，即施用該載體后，誘導(dǎo)出同時(shí)抗兩種或更多種疾病的免疫性。因?yàn)榫幋aApxIV毒素的基因可用作這樣異源基因的插入位點(diǎn)，所以根據(jù)本發(fā)明的活減毒細(xì)菌提供了異源基因很適宜的載體。ApxIV基因用作插入位點(diǎn)具有這樣的優(yōu)勢(shì)即apxIV基因被同時(shí)失活，并且新導(dǎo)入的異源基因可根據(jù)同源的胸膜肺炎放線桿菌基因來(lái)表達(dá)。這種重組載體的構(gòu)建可用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)如同源重組按常規(guī)地加以完成。因此，在甚至更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的活減毒的胸膜肺炎放線桿菌即其不產(chǎn)生有功能的ApxIV毒素，并且其中有異源基因插入到ApxIV基因中。如上述，這樣的異源基因可以是例如，編碼選自其它病原微生物或病毒抗原的基因。另一種可能性是插入編碼涉及激發(fā)免疫系統(tǒng)的蛋白，如白細(xì)胞介素或干擾素的基因。
在本發(fā)明更為優(yōu)選的形式中，異源基因編碼一個(gè)或更多個(gè)選自以下類群的抗原，包括豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)病毒、假狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritisvires)、輪狀病毒、大腸桿菌、豬丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管炎博德特氏菌、副豬嗜血菌及豬鏈球菌。
然而在重組載體中異源基因的表達(dá)有嚴(yán)重的潛在危險(xiǎn)已知這幾種蛋白如果在異源菌中表達(dá)是有毒的。因此，編碼該蛋白的基因決不可導(dǎo)入異源載體中，因?yàn)橛捎诒磉_(dá)一定量異源基因，故成功的重組體將會(huì)最終死亡。流感嗜血桿菌的P-2蛋白，僅列舉一個(gè)實(shí)施例，可簡(jiǎn)單地不在大腸桿菌中表達(dá)(Munson等，感染與免疫5788-94(1989))。本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供沒(méi)有此缺點(diǎn)的重組活載體。已意外發(fā)現(xiàn)，盡管apxIV基因在體內(nèi)有效表達(dá)(見(jiàn)實(shí)施例5)，但是其在體外不表達(dá)(見(jiàn)實(shí)施例4)。這是從未能在體外培養(yǎng)的胸膜肺炎放線桿菌培養(yǎng)物中顯示出ApxIV毒素的存在得出的。這意味著ApxIV的表達(dá)依賴于其中培養(yǎng)有胸膜肺炎放線桿菌外在環(huán)境來(lái)開(kāi)啟和關(guān)閉。該特征較已知的活重組載體提供了出乎預(yù)料的優(yōu)勢(shì)如果異源基因的表達(dá)受apxIV啟動(dòng)子控制，那么無(wú)論插入什么異源基因，根據(jù)本發(fā)明的胸膜肺炎放線桿菌活減毒載體可在體外培養(yǎng)至高密度，因?yàn)橥庠椿蛟谶@些條件下將不表達(dá)。施用許多細(xì)菌至宿主以后，異源基因的表達(dá)將開(kāi)始且在復(fù)制期間或細(xì)菌死后的某個(gè)時(shí)間，其將是宿主的免疫系統(tǒng)可利用的?？赏ㄟ^(guò)，例如，用異源基因的編碼區(qū)替代apxIV基因的編碼序列而將待表達(dá)的異源基因有功能地連接到apxIV啟動(dòng)子上。替代整個(gè)apxIV基因是不必要的以包括其終止密碼子的異源基因編碼區(qū)替代ApxIV的ATG密碼子就已足夠。通過(guò)建立融合構(gòu)建體在apxIV啟動(dòng)子影響下表達(dá)異源基因也是可能的。這可通過(guò)在具有apxIV ATG密碼子下游的apxIV閱讀框的框架中插入異源基因加以完成。
詞語(yǔ)“有功能地連接到apxIV啟動(dòng)子上”意思為異源基因的轉(zhuǎn)錄在apxIV啟動(dòng)子處起始。
不用說(shuō)，插入異源基因的每個(gè)位置，其中的異源基因有功能地連接到apxIV啟動(dòng)子上，存在于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
因此，該實(shí)施方案最為優(yōu)選的形式涉及本發(fā)明的活減毒細(xì)菌，其中帶有有功能地連接到apxIV啟動(dòng)子區(qū)域上的異源基因。
天然apxIV啟動(dòng)子是個(gè)可開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)子，其在體外關(guān)閉且在體內(nèi)打開(kāi)，該驚人的發(fā)現(xiàn)使該啟動(dòng)子成為其天然宿主中和作為其它細(xì)菌的異源啟動(dòng)子很通用的表達(dá)工具。當(dāng)用作其它細(xì)菌中的異源啟動(dòng)子時(shí)，包括該啟動(dòng)子的DNA可從其宿主中分離并轉(zhuǎn)入除胸膜肺炎放線桿菌以外的細(xì)菌中。
現(xiàn)在易行的另一種選擇是克隆數(shù)拷貝的apxIV啟動(dòng)子，其中每種控制著另一種基因的表達(dá)。這雖然能夠在宿主菌胸膜肺炎放線桿菌中加以完成，但該多拷貝原理同樣適用于其它細(xì)菌。如上述，該啟動(dòng)子可用于在體內(nèi)選擇性地表達(dá)一種或多種編碼選自其它病原微生物或病毒抗原的異源基因。該啟動(dòng)子也可用于表達(dá)編碼細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子或干擾素的異源DNA序列。已知數(shù)種細(xì)胞因子，如干擾素作為免疫調(diào)節(jié)劑而起重要作用。因此在apxIV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)這樣的遺傳信息可能是優(yōu)越的。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及帶有控制apxIV基因表達(dá)啟動(dòng)子的核苷酸序列。
在自然狀態(tài)下控制apxIV基因表達(dá)的可開(kāi)關(guān)啟動(dòng)子現(xiàn)被發(fā)現(xiàn)位于SEQID NO5中位置451和1132之間的DNA片段中。很明顯該DNA片段中那些非啟動(dòng)子必需成分的部分不必要存在于該片段中。因此，保留該啟動(dòng)子活性的此DNA片段的較短部分同樣適用于異源基因的表達(dá)。因此，該實(shí)施方案更為優(yōu)選的形式涉及包括SEQ ID NO5中位置451到1132DNA片段或其仍具有啟動(dòng)子活性子片段的核苷酸序列。
細(xì)菌啟動(dòng)子均具有兩個(gè)共有區(qū)，所謂的-10和-35區(qū)。雖然這些共有區(qū)的側(cè)翼序列可能在一定程度上影響啟動(dòng)子的效率，僅使用包括-35與ATG密碼子之間的DNA片段的啟動(dòng)子區(qū)域部分可能是優(yōu)越的。該DNA片段位于SEQ ID NO5的位置617與位置641之間。因此，在本發(fā)明該實(shí)施方案更為優(yōu)選的形式中涉及包括SEQ ID NO5中位置617至641之間DNA片段的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及作為亞單位疫苗成分的ApxIV毒素。亞單位疫苗將最為可能包括這三種已知的Apx-毒素。這一點(diǎn)上面已經(jīng)提到。然而，如上述，由于意外地發(fā)現(xiàn)ApsIV毒素存在于所有胸膜肺炎放線桿菌血清型中，故其是亞單位疫苗理想的添加成分產(chǎn)生的抗ApxIV毒素的中和抗體提供了對(duì)無(wú)論什么血清型的每種及所有胸膜肺炎放線桿菌株所產(chǎn)生ApxIV毒素的保護(hù)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于保護(hù)動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌細(xì)菌感染的亞單位疫苗，其中包括純化的ApxIV毒素。ApxIV毒素可單獨(dú)施用，或與任何或所有上述的毒素ApxI、-II和-III結(jié)合施用和/或，例如，與胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白(OMPs)結(jié)合施用?？赏ㄟ^(guò)將ApxIV毒素以足以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的量與藥物上可接受的載體混合而容易地制備該疫苗。通過(guò)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中導(dǎo)入apxIV基因、表達(dá)該基因及分離毒素而制備ApxIV毒素是可能的。本領(lǐng)域中已知有多種通用表達(dá)系統(tǒng)，如細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。在實(shí)施例3中描述了如何通過(guò)大腸桿菌中表達(dá)該基因而獲得ApxIV毒素。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及活減毒疫苗，其中包括上述用于保護(hù)動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌感染的活減毒細(xì)菌。這種疫苗可通過(guò)將活減毒細(xì)菌與藥物上可接受的載體混合而獲得。這些疫苗包括至少免疫原性有效量的根據(jù)本發(fā)明活減毒產(chǎn)生菌。免疫原性有效量意思為接種時(shí)施用的活減毒菌的量足以在宿主內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)產(chǎn)生毒性形式RTX-毒素菌的有效免疫反應(yīng)。待施用的有用劑量將隨著年齡、體重及接種的動(dòng)物，施用的方式和接種所要針對(duì)病原體的類型而改變。此疫苗包括足以導(dǎo)致免疫反應(yīng)的任何劑量的細(xì)菌。例如，103與105個(gè)細(xì)菌之間的劑量范圍是很合適的劑量。
藥物上可接受的載體可以是簡(jiǎn)單的如水，但其也可以包括，例如，在其中培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)液。其它合適的載體例如，生理鹽濃度的溶液。用于本發(fā)明其它藥物上可接受載體或稀釋劑的實(shí)例包括穩(wěn)定劑如SPGA、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白如清蛋白或酪蛋白、含有蛋白如牛血清或去脂牛奶的試劑及緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)。
任選地，具有佐劑活性的一種或多種化合物可加入到疫苗中。佐劑為非特異性的免疫系統(tǒng)刺激劑。它們?cè)鰪?qiáng)宿主對(duì)入侵病原體的免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域已知佐劑的實(shí)例有弗氏完全和不完全佐劑，維生素E，非離子型嵌段聚合物，胞壁酰二肽，ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物，參考如歐洲專利EP109942)，皂角苷，礦物油，植物油和Carbopol(均聚物)。特別是適用于粘膜應(yīng)用的佐劑有，例如，大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素(LT)或霍亂毒素(CT)。
其它合適的佐劑有，例如，氫氧化鋁，磷酸鋁或氧化鋁，油性乳劑(如Bayol F(R)或Marcol52(R)，皂角苷或維生素E-加溶物。
因此，在優(yōu)選形式中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括佐劑。
為了施用到動(dòng)物，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可特別地以鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、通過(guò)煙霧劑或肌肉內(nèi)施用。
有幾種保存亞單位和活生物的方式。例如在冰箱內(nèi)保存是眾所周知的方法。在含有甘油的緩沖液中于-70℃保存也常使用。細(xì)菌也可保存于液氮中。冷凍干燥是另一種保存方式。冷凍干燥的細(xì)菌可被保存并維持存活多年。冷凍干燥的細(xì)菌的保存溫度可位于零度以上而不損害其存活力。冷凍干燥同樣適用于亞單位。
冷凍干燥可根據(jù)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)冷凍干燥方法加以完成。任選有利的添加劑，如去脂牛奶、海藻糖、明膠或牛血清白蛋白可在冷凍過(guò)程中加入。
因此，在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗是冷凍的形式。
在該實(shí)施方案更為優(yōu)選的形式中，疫苗還額外包括一種或多種選自其它病原體微生物或病毒的抗原。這種疫苗可通過(guò)將選自其它病原菌或病毒的一種或多種抗原添加到根據(jù)本發(fā)明的活減毒菌及上述藥物上可接受的載體中而獲得。
當(dāng)然，不僅添加一種或多種抗原，而且添加一種或多種整個(gè)病原體如，失活或活性形式病原體是可能的。
作為選擇，可用上述已知的重組DNA技術(shù)將編碼一種或多種選自其它病原微生物或病毒的抗原的遺傳信息克隆到活減毒菌中而獲得疫苗。無(wú)論從醫(yī)學(xué)還是從身體角度看，這種疫苗當(dāng)然較以每種病原體單獨(dú)接種對(duì)接種的動(dòng)物產(chǎn)生較小的協(xié)迫。
在甚至更為優(yōu)選的形式中，這些抗原選自豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、大腸桿菌、豬丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管炎博德特氏菌、副豬嗜血菌及豬鏈球菌。
本發(fā)明也涉及不能產(chǎn)生有功能ApxIV毒素的各種活減毒胸膜肺炎放線桿菌的制備方法。這些方法包括在編碼apxIV蛋白的基因中導(dǎo)入突變。用誘變劑的經(jīng)典突變技術(shù)和本領(lǐng)域眾所周知的用于apxIV基因遺傳信息插入、替代或缺失的重組DNA技術(shù)是可用的。
在更為優(yōu)選的形式中，上述方法用于導(dǎo)入缺失。
包括將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌與藥物上可接受的載體混合的用于本發(fā)明活減毒疫苗制備的方法也是本發(fā)明的一部分。
用于亞單位疫苗制備的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。該方法包括將純化的ApxIV毒素與藥物上可接受的載體混合。
在活疫苗接種領(lǐng)域中另一個(gè)普遍認(rèn)識(shí)到的問(wèn)題如下在宿主動(dòng)物血清中抗某種病原體抗體的存在表明該宿主已被此毒性或減毒形式的病原體感染。然而區(qū)分野外感染的動(dòng)物與以活疫苗菌株接種的動(dòng)物是不可能的。根據(jù)本發(fā)明的活體減毒胸膜肺炎放線桿菌按如下提供了該問(wèn)題的解決方案如在實(shí)施例3中所述，胸膜肺炎放線桿菌血清型1的apxIV基因已被分離并在異源宿主細(xì)胞中表達(dá)。將此表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行PAAGE-凝膠電泳且然后用于Western-印跡。將印跡與獲自以胸膜肺炎放線桿菌有意識(shí)感染豬的恢復(fù)期血清及獲自野生菌株感染的血清孵育。發(fā)現(xiàn)apxIV基因在所有測(cè)試的胸膜肺炎放線桿菌野生菌株中均有體內(nèi)表達(dá)。這表明以胸膜肺炎放線桿菌感染的豬將一直具有抗所有感染菌株血清型的感染它們的菌株的抗體。由于apxIV基因的缺失，根據(jù)本發(fā)明的活減毒菌不再產(chǎn)生ApxIV毒素。因此以本發(fā)明的活減毒胸膜肺炎放線桿菌菌株接種的動(dòng)物在其血清中將不具有抗ApxIV毒素的抗體。
在比較測(cè)試，如ELISA測(cè)試中，該血清將因此與所有免疫原性的胸膜肺炎放線桿菌-蛋白如ApxI、II和/或III反應(yīng)，但將不與ApxIV起反應(yīng)。然而，以胸膜肺炎放線桿菌野生菌株感染豬的血清將與所有免疫原性的胸膜肺炎放線桿菌-蛋白，包括ApxIV起反應(yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明的活減毒胸膜肺炎放線桿菌證明是很適宜的標(biāo)記疫苗，即可與野生菌株區(qū)分的疫苗菌株。
用于區(qū)分疫苗菌株與野生菌株的診斷測(cè)試可以是簡(jiǎn)單的ELISA-測(cè)試，其中的純化ApxIV毒素涂到ELISA-平板的孔壁上。然后與待測(cè)的豬血清孵育，接著與，如標(biāo)記的抗豬抗體孵育可顯示抗ApxIV毒素的抗體存在與否。
另一種診斷測(cè)試系統(tǒng)的實(shí)例是，如，將包括純化ApxIV毒素的Western印跡與待測(cè)的豬血清孵育，接著檢測(cè)特異性的抗-ApxIV抗體。
因此，用于區(qū)分以胸膜肺炎放線桿菌野生菌株感染豬的血清與以包括本發(fā)明活減毒疫苗胸膜肺炎放線桿菌菌株疫苗接種豬的血清(包括純化ApxIV毒素)的診斷測(cè)試也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
豬健康保護(hù)中的另一問(wèn)題如下即難以用快捷而清晰的方式測(cè)定豬是否以胸膜肺炎放線桿菌或豬放線桿菌感染，或是二者共同感染。目前還沒(méi)有用于對(duì)豬放線桿菌特異性檢測(cè)的診斷測(cè)試。這主要是由于這樣的事實(shí)，即胸膜肺炎放線桿菌與豬放線桿菌共有許多相同的抗原。兩種高度抗原性的Apx-毒素可作為實(shí)例；在如豬放線桿菌中，ApxI與ApxII具有高度保守的同源物(Van Ostaayen等.，待發(fā)表)。
編碼ApxI、-II和-III毒素或同源物的已知RTX基因?qū)嶋H上發(fā)現(xiàn)于放線桿菌屬的所有成員中，如胸膜肺炎放線桿菌、豬放線桿菌、羅氏放線桿菌及馬駒放線桿菌。因此，本發(fā)明者最初認(rèn)為，新的RTX-毒素ApxIV在所有放線桿菌屬成員中是相同的。然而，測(cè)試豬病原性放線桿菌后發(fā)現(xiàn)，又一次與已知三種RTX-基因驚奇地形成鮮明對(duì)照，即該新的RTX-基因apxIV僅存在于豬病原體胸膜肺炎放線桿菌中。其沒(méi)有出現(xiàn)于所有其它常見(jiàn)的豬病原性放線桿菌各種類中，且因此它也沒(méi)有出現(xiàn)于豬放線桿菌中。見(jiàn)實(shí)施例6和7。因此，令人驚奇地注意到豬血清中抗ApxIV抗體的存在是豬被胸膜肺炎放線桿菌感染而不是被豬放線桿菌或任何其它豬病原體放線桿菌種類感染的快捷而又清晰的證據(jù)。
這樣，本發(fā)明也提供了基于抗ApxIV抗體存在與否的診斷測(cè)試，且因此用于特異性區(qū)分胸膜肺炎放線桿菌感染與豬放線桿菌感染的區(qū)別測(cè)試。這種測(cè)試可以是，如，ELISA測(cè)試，其在分離的小孔中包括既存在于胸膜肺炎放線桿菌又存在于豬放線桿菌中的ApxI及-II毒素和純化的ApxIV毒素。豬放線桿菌感染的動(dòng)物血清將僅與包括ApxI和Apx-II的小孔起反應(yīng)而胸膜肺炎放線桿菌感染的動(dòng)物也將與包括純化ApxIV毒素的小孔起反應(yīng)。
實(shí)施例1胸膜肺炎放線桿菌血清型1apxIV基因的克隆與分析標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(質(zhì)粒DNA分離，限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、Southern印跡、連接、轉(zhuǎn)化、電穿孔)，如果沒(méi)有另作說(shuō)明，基本上按Sambrook等(分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港、紐約，1989)或Ausubel等(當(dāng)前分子生物學(xué)方法，John Wiley &Sons，紐約，1987)的描述進(jìn)行。PCR基本上按Innis等(PCR方法，方法及應(yīng)用指南，學(xué)術(shù)出版公司，圣地亞哥，1990)所述進(jìn)行。染色體DNA分離根據(jù)Pitcher等(應(yīng)用微生物學(xué)通迅8；151-156，1989)完成。所有胸膜肺炎放線桿菌參比菌株(血清型1菌株4074；血清型2菌株S1536血清型3S1421；血清型4M62；血清型5aK17；血清型5bL20；血清型6femφ；血清型7WF83；血清型8405；血清型9CVI13261；血清型1013039；血清型1156153及血清型128329)的來(lái)源由Frey和Nicolet描述(臨床微生物雜志，28；232-236，1990)。胸膜肺炎放線桿菌血清型3菌株HV114為野生型分離子(即在Beck等，臨床微生物學(xué)雜志.，32；2749-2754，1994中測(cè)試的血清型3菌株之一)。所用的其它放線桿菌菌株；羅氏放線桿菌ATCC27072；馬駒放線桿菌ATCC19392；豬放線桿菌ATCC15558。溶血巴斯德氏菌1型菌株ATCC14003被使用。
所用的大腸桿菌宿主菌株XL1-blue(Stratagene，La Yolla，Ca；基因型rec A1 end A1 gyrA96 thi-1 hsd R17 sup E44 rel A 1lac[F’proABlaclqZDM 15 Tn10(Tetr)])及HMS174(DE3)(AMS生物技術(shù)公司，瑞士；基因型F-rec A(rk12-mk12+)rifrIDE3)。根據(jù)獲自T.J.，Anderson論文的初步序列數(shù)據(jù)(Guelph大學(xué)，1995)，合成兩條命名為APXIVA-1L(5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’)和APXIVA-1R(5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’)的引物。這些引物用于以胸膜肺炎放線桿菌血清型3菌株HV114和血清型1參照菌株4074的染色體DNA作為模板的PCR擴(kuò)增中。用兩種菌株擴(kuò)增出442bp的片段。將獲自血清型3染色體DNA的此片段根據(jù)制造商方法手冊(cè)以洋地黃毒苷-11-dUTP(寶靈曼)標(biāo)記(此片段命名為探針APXIVA，見(jiàn)圖4)。隨后將該標(biāo)記探針用于與含有ClaI消化的菌株4074染色體DNA的Southern印跡雜交。該探針與大約8.0kb的片段雜交。血清型1菌株4074的apxIV基因通過(guò)將ClaI消化的染色體DNA連接到ClaI消化的pBluescript II SK-(Stratagene美國(guó))中而加以分離。以連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-blue并將轉(zhuǎn)化體于含有100mg/ml氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。
用APXIVA探針通過(guò)平板硝酸纖維素復(fù)制品的菌落雜交篩選帶有apxIV的克隆。這樣，分離到命名為pROK7的質(zhì)粒并顯示其帶有約8kb的ClaI插入子。將ClaI插入子的頭6736bp進(jìn)行測(cè)序(SEQ ID1)并鑒定出編碼具有約186KD預(yù)期大小的編碼1657個(gè)氨基酸殘基蛋白(SEQID2)的4971個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框。該基因命名為apxIV-var1(見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例2胸膜肺炎放線桿菌血清型3apxIV基因的克隆與分析將標(biāo)記的探針APXIVA(在實(shí)施例1中提到)用于與含有ClaI消化的HV114菌株染色體DNA的Southern印跡雜交。探針與約7.0kb的片段雜交。將從HV114分離的染色體DNA以ClaI消化，并與ClaI消化的pBluescript II SK-(Stratagene美國(guó))連接。以連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-blue并于具有100mg/ml氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化體。用APXIVA探針通過(guò)平板的硝酸纖維素復(fù)制品的菌落雜交篩選帶有apxIV的克隆。因此，分離出一個(gè)名為pROK5的質(zhì)粒并顯示其帶有約7kb的ClaI插入子。通過(guò)序列分析分析該插入子(SEQ ID 3)。鑒定出一個(gè)4146bp的開(kāi)放閱讀框，其編碼具有約154KD預(yù)期大小的1382氨基酸殘基的蛋白(SEQ ID 4)。該基因命名為apxIV-var3(見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例3ApxIV var3-多聚組氨酸融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)由質(zhì)粒pROK5，制備一個(gè)缺失克隆，其中含有apxIV基因的3’末端，從Bam HI位點(diǎn)(SEQ ID NO3中核苷酸NO.2747)到apxIV基因插入下游末端的ClaI位點(diǎn)。將該質(zhì)粒命名為pROK1。用寡核苷酸APXIVAHIS1-L(5’-AGCCATATGGGCGATTTAAATTTCAG-3’)及APXIVAHIS1-R(5’-TATGGATCCTCCGTGCTTCTGAGC-3’)和質(zhì)粒pROK1 DNA作為模板，擴(kuò)增出2.1kb的DNA片段(見(jiàn)圖4)，其中含有分別位于5’和3’末端NdeI及BamHI限制性位點(diǎn)兩側(cè)的apxIV-var3(SEQID3)中3520到5643bp的區(qū)域。在表達(dá)載體pETHIS-1中克隆NdeI/BamHI消化的PCR片段后，以相同的酶消化，獲得名為pJFFapxIV6/10 his-1的質(zhì)粒。質(zhì)粒pETHIS-1是pET14b(Novagen公司.，Madison，Wi)的衍生物，其中的多克隆位點(diǎn)已被擴(kuò)展且已插入編碼組氨酸十聚體(decamer)的區(qū)域。因而，pJFFapxIV6/10 his-1質(zhì)粒含有T7啟動(dòng)子控制下的翻譯融合體，其編碼組氨酸六聚體、后接SEQ ID4中653到1360氨基酸殘基，后面再接上組氨酸十聚體。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至具有pLysS的大腸桿菌菌株HMS174(DE3)中，其中含有IPTG可誘導(dǎo)的T7RNA聚合酶基因和用于增加穩(wěn)定性的T7溶菌酶基因。將該菌株培養(yǎng)于含25mg/ml氯霉素及100mg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基至0.5的OD650，并以10mM濃度的異丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)。添加IPTG以后，細(xì)胞于37℃孵育2.5小時(shí)，離心收獲細(xì)胞，并且分離包涵體形式的80kD預(yù)期大小的融合蛋白。將包涵體溶解于pH8.0的6M鹽酸胍、300mM NaCl和50mMNaH2PO4溶液中且80kD融合蛋白通過(guò)用Ni2+螯合柱(Qiagen AG，Basel)的固定金屬親和層析(IMAC)(Schmitt等，分子生物學(xué)報(bào)告18；223-230，1993)進(jìn)一步加以純化。以pH5.0從柱中洗脫純凈蛋白。將收集的餾份于pH8.0的300mM NaCl和50mM NaH2PO4溶液中透析。以用1體積完全弗氏佐劑(Difco實(shí)驗(yàn)室，Detroit，MI)混合的500mg多聚組氨酸融合產(chǎn)物免疫兔子。3周后施以混合有不完全弗氏佐劑的相同量的增強(qiáng)劑量。增強(qiáng)免疫后四周，將兔子放血并獲得包括抗-ApxIV毒素抗體稱為血清522-409的超免疫血清。
實(shí)施例4apxIV基因在體外培養(yǎng)的胸膜肺炎放線桿菌中的表達(dá)將血清型1的胸膜肺炎放線桿菌參比菌株培養(yǎng)于補(bǔ)充以10mg/ml b-NAD的Columbia肉湯中并按所述(Beck等，臨床微生物雜志，32；2749-2754，1994)進(jìn)行收獲。在相鄰于包括ApxIA、ApxIIA和ApxIVA-多聚組氨酸融合蛋白道的位置通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Laemmli，自然227680-685，1970)分離濃縮的培養(yǎng)上清并進(jìn)行Western印跡方法(Towbin等，美國(guó)自然科學(xué)院院報(bào)764350-4354，1979)。將Western印跡按Beek等所述(臨床微生物學(xué)雜志，32；2749-2754，1994)與抗-ApxIA-和抗-ApxIIA單克隆抗體及抗-ApxIV血清522-409(見(jiàn)實(shí)施例3)起反應(yīng)。分離的血清型1RTX毒素餾份清楚地含有ApxIA和ApxIIA。ApxIVA的存在沒(méi)能得到證實(shí)(見(jiàn)圖5)。
實(shí)施例5apxIV基因在胸膜肺炎放線桿菌感染期間的體內(nèi)表達(dá)將含有80kD多聚組氨酸-ApxIV-var3融合蛋白(見(jiàn)實(shí)施例3)的聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將該膜分成細(xì)條帶(strips)與抗血清型1的(100倍稀釋的)恢復(fù)期野生血清或以血清型1的參比菌株(Frey和Nicolet，獸醫(yī)微生物學(xué)，28；61-73，1991)實(shí)驗(yàn)性感染的豬血清起反應(yīng)。用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG的偶聯(lián)物(Kirkegaard Perry公司，Graithersburg，Md)與NBT(4-氮藍(lán)四唑氯化物)及BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯)顯色觀察反應(yīng)(見(jiàn)圖6)。血清型1野生型血清及實(shí)驗(yàn)性感染的豬血清與80kD的多聚組氨酸-ApxIV-var3蛋白反應(yīng)。這表明ApxIV蛋白實(shí)際上表達(dá)，具有抗原性且在豬中胸膜肺炎放線桿菌感染過(guò)程中誘導(dǎo)抗-ApxIV毒素抗體。
實(shí)施例6用Southern印跡(證明)apxIV基因在所有胸膜肺炎放線桿菌血清型中的存在及其在非胸膜肺炎放線桿菌菌株中的不存在為了研究apxIV基因在各種胸膜肺炎放線桿菌血清型及相關(guān)細(xì)菌中的存在，制備三種探針(見(jiàn)圖4)。探針APXIVA在實(shí)施例1中描述過(guò)。探針APXIVA2在BamHI和NruI位點(diǎn)之間含有2015bp的DNA片段。通過(guò)用寡聚體APPIV1-L(5’-GGGACAGTGGCTCAATTAAG-3’)和(APPIV1-R(5’-AGCTGTAAACTCCACCAACG-3’)的PCR擴(kuò)增制備758bp的探針APPIVA1。所有的探針根據(jù)制造商手冊(cè)以洋地黃毒苷-11-dUTP(寶靈曼)標(biāo)記并與Southern印跡雜交，印跡中含有所有胸膜肺炎放線桿菌參比菌株和HV114野生菌株、豬放線桿菌(ATCC15558)、羅氏放線桿菌(ATCC27072)及馬駒放線桿菌(ATCC19392)的ClaI消化的染色體DNA。所有三個(gè)探針?lè)磻?yīng)類似(見(jiàn)圖7APXIVA2探針的結(jié)果)。所有的胸膜肺炎放線桿菌菌株反應(yīng)，而沒(méi)有觀察到與豬放線桿菌、馬駒放線桿菌及羅氏放線桿菌菌株的反應(yīng)。
實(shí)施例7用PCR擴(kuò)增(證實(shí))apxIV基因在胸膜肺炎放線桿菌及相關(guān)菌株中的存在用來(lái)自各種胸膜肺炎放線桿菌血清型、其它放線桿菌種類及溶血巴斯德氏菌的50ng染色體DNA作為模板，及引物APXIVA-1L(5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’)和APXIVA-IR(5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分析以后，在所有胸膜肺炎放線桿菌樣品中觀察到442bp預(yù)期大小的產(chǎn)物，但沒(méi)有在其它放線桿菌種類中觀察到(圖8)。這表明除了實(shí)施例6中的結(jié)果外，PCR也可用于區(qū)分胸膜肺炎放線桿菌與其它放線桿菌種類。
實(shí)施例8ApxIV-var1多聚組氨酸融合蛋白的過(guò)量表達(dá)以質(zhì)粒pROK-7(見(jiàn)實(shí)施例1)作為模板且寡核苷酸APX4/II5-L(5’-CGCCATATGACAAAATTAACTATGCAAG)及APX4II6-R(5’-CGCGAATTCAGCGACACAAGAGATAT)作為PCR-引物開(kāi)始，擴(kuò)增PCR片段。然后將足夠量的該片段以限制性酶NdeI和EcoRI消化并克隆入實(shí)施例3中所述的以相同酶消化的表達(dá)載體pETHIS-1中。根據(jù)得到的命名為pJFFApxIVA1His1的質(zhì)粒，按實(shí)施例3中所述在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)206kD的1841個(gè)氨基酸殘基的多聚組氨酸融合蛋白(PAGE中測(cè)定的MW)。如在SEQ ID NO5中所述，該蛋白由橫跨其中no.1132至6546核酸的編碼區(qū)所編碼。蛋白的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO6中。在Western印跡中，顯示此產(chǎn)物與特異性的抗-ApxIV血清522-409反應(yīng)(實(shí)施例3中描述的抗血清)。
實(shí)施例9通過(guò)以ApxIV接種保護(hù)小鼠免受APP感染兩種均源自血清型1參比菌株4074基因組材料的在實(shí)施例8中所述206KD多聚組氨酸-ApxIV融合蛋白和相應(yīng)的108KD多聚組氨酸-ApxIA-融合蛋白按實(shí)施例3中所述過(guò)量表達(dá)。將誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)胞沉淀物重懸于PBS緩沖液(1g細(xì)胞沉淀于6ml緩沖液中)并于冰上45秒鐘超聲粉碎2次用于細(xì)胞裂解。以22.000xg 4℃離心20分鐘后，棄上清并將3M的尿素(pH6.3)溶液洗得到的沉淀。22.000xg離心20分鐘后去除尿素，并將得到的沉淀溶于6M的鹽酸胍(pH8.0)中。經(jīng)PAGE凝膠的光密度測(cè)定后通過(guò)特定蛋白的濃度對(duì)蛋白樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。樣品以PBS稀釋并以油性佐劑配制。
15只小鼠為一組共3組以ApxIV抗原(36.3微克)、ApxIA抗原(36.3微克)或僅以佐劑進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫。以0.4ml體積施用疫苗。第一次接種24天后，將每組小鼠分成7只和8只小鼠的兩組，均以一半量的抗原增強(qiáng)免疫。7只小鼠的組以0.2ml的體積在腹膜內(nèi)進(jìn)行增強(qiáng)免疫且8只小鼠的組以0.1ml每只于后肢進(jìn)行肌肉內(nèi)接種。增強(qiáng)免疫13天后，將小鼠1.5108cfu的毒性血清型1菌株腹膜內(nèi)感染。
實(shí)施例10ApxIV的孔道形成能力表達(dá)ApxIV的新鮮誘導(dǎo)的大腸桿菌用作用于按Maier等，感染免疫，64；4415-4423(1996)所述在人工脂雙層中測(cè)試孔道形成的蛋白來(lái)源。用于黑色脂雙層實(shí)驗(yàn)的方法以前已有描述(Benz等；生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)511305-319(1978)。膜由1％的asolection溶液(Sigma的大豆凝集素型IV-S，St，Louis MO)于正癸烷中形成。形成10倍跨膜鹽梯度后5-10分鐘用Keithley 610C靜電計(jì)測(cè)量零電流膜電勢(shì)(Zero currentmembrane potential)(Benz等，生物化學(xué)生物物理雜志551238-247(1979)。在0.5％膽固醇存在時(shí)ApxIV的存在導(dǎo)致高頻率的孔道形成，平均單個(gè)通道電導(dǎo)率(G)為4nS。
這些結(jié)果表示ApxIV誘導(dǎo)進(jìn)入人工雙層的孔道且因此對(duì)真核細(xì)胞是有毒的且因此為胸膜肺炎放線桿菌的毒性因子。


圖1ApxIVA var1和ApxIVA var3(var代表血清型)的比較。圖示發(fā)現(xiàn)于C-末端的不同特征。陰影框代表ApxIVA中的同向重復(fù)區(qū)域。黑體豎線表示富含甘氨酸非肽(nonapeptides)的位置，且DNA聚合酶家族B特征以黑三角形表示。氨基酸序列YSDSANSKK代表ApxIVA var3基因中的間隔序列。在ApxIVAvar3中被缺失的ApxIVAvar1序列片段也顯示于圖中。
圖2ApxIVA var1和ApxIVA var3的同向重復(fù)1(A)、同向重復(fù)2(B)及同向重復(fù)3(C)的氨基酸序列的比較。同向重復(fù)1，2和3的每個(gè)拷貝由字母標(biāo)記以區(qū)分它們用于序列比較。變異的殘基以黑體字母顯示。
圖3pBLac7(T.J.Anderson學(xué)位論文.University ofGuelph，1995)，pROK7和pROK5的部分限制性圖譜。不同的開(kāi)放閱讀框(ORF’s)以箭頭表示。pROK7中的lacZ斷箭頭表示該基因的部分測(cè)序。潛在的rho-非依賴性轉(zhuǎn)錄終止子被標(biāo)出(W)。潛在的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)由三角形標(biāo)出。限制性位點(diǎn)A＝Asp700；B＝BamHI；C＝ClaI；E＝EcoRV；Ec＝EcoRI；H＝HindIII；N＝NruI；Nd＝NdeI，Nh＝NheI；P＝PstI；S＝SpeI；Sm＝SmI。
圖4各種寡核苷酸和探針在apxIVA var3基因圖譜上的位置。
圖5ApxIV在體外培養(yǎng)的血清型1參比菌株4074中的表達(dá)。A板與抗-ApxIA單克隆抗體反應(yīng)，板B與抗-ApxIIA單克隆抗體反應(yīng)且板C與抗-ApxIVA血清522-409反應(yīng)。1道含有ApxIA-多聚組氨酸融合蛋白，2道含有ApxIIA-多聚組氨酸融合蛋白，3道含有菌株4074濃縮培養(yǎng)物上清，4道含有ApxIVA多聚組氨酸融合蛋白。
圖6顯示以參比菌株血清型1實(shí)驗(yàn)性感染的豬血清(1道)或以80KD多聚組氨酸融合蛋白血清型1野生感染豬血清(2-4道)反應(yīng)性的免疫印跡。使用血清522-409作為陽(yáng)性對(duì)照(+)，用1000-倍稀釋的多克隆兔抗ApxI和ApxII(Frey等，感染免疫，57；2050-2056，1989)血清作為陰性對(duì)照(-)。
圖7與探針APXIVA2雜交的ClaI消化的基因組DNA的Southern印跡。1-13泳道胸膜肺炎放線桿菌參比菌株；1血清型1；2血清型2；3血清型；4血清型4；5血清型5a；6血清型5b；7血清型6；8血清型7；9血清型8；10血清型9；11血清型10；12血清型11；13血清型12；14HV114野生菌株；15豬放線桿菌(ATCC15558)；16羅氏放線桿菌(ATCC27072)；17馬駒放線桿菌(ATCC 19392)。分子大小標(biāo)記(以千堿基對(duì))顯示于左邊。
圖8用引物APXIVA-1L和APXIVA-1R的PCR擴(kuò)增。泳道分配1到13泳道分別含有胸膜肺炎放線桿菌參比菌株的1、2、3、4、5a、5b、6、7、8、9、10、11和12血清型；14泳道菌株HV114；15泳道豬放線桿菌ATCC 15558；16泳道羅氏放線桿菌ATCC 27072；17泳道馬駒放線桿菌ATCC 19392；18泳道李氏放線桿菌(A.lignieresii)ATCC 49236；19泳道溶血巴斯德氏菌1型ATCC14003。分子大小標(biāo)記(以千堿基對(duì))顯示于左邊。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱AKZO Noble N.V.
(B)街道Velperweg 76(C)城市Arnhem(E)國(guó)家荷蘭(F)郵編(ZIP)6824BM(ii)發(fā)明題目活體減毒胸膜肺炎放線桿菌(iii)序列數(shù)目4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利發(fā)布#1.0，1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6736個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)條件無(wú)
(iv)反義無(wú)(vi)最初來(lái)源(A)有機(jī)體胸膜肺炎放線桿菌(B)菌株4074(血清型1參比菌株)(vii)直接來(lái)源(B)克隆pROK7(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵CDS(B)位置1576…6549(D)其它信息/密碼子-起始-1576/功能＝“RTX毒素”/產(chǎn)物“ApxIV_var1”/基因＝“apxIV_var1”/數(shù)目＝1(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCGATATGC CGCCGGGTAC GGGCGATATC CAACTTACTC TTTCGCAACA AATTCCGGTT 60ACCGGTGCGG TGGTGGTAAC CACTCCGCAA GATATTGCGT TATTAGATGC GGTGAAAGGT120ATTTCAATGT TCCAAAAAGT GTCGGTACCG GTCTTAGGTA TCATTGAAAA TATGAGCGTA180CATATCTGCC AAAATTGCGG TCACCACGAA GATATTTTCG GCACCGGCGG TGCGGAGAAA240GTGGCGAAGA AATACGGTAC TAAAGTATTA GGACAAATGC CGTTGCATAT TCGCTTACGT300CAAGATTTGG ATGCCGGCAC ACCGACCGTC GTTGCGGCAC CGGAACACGA AACCAGCCGA360GCCTATATTG AATTAGCGGC AAAAGTCGCT TCGGAATTAT ACTGGCAAGG TTCGGTTATC 420CCGTCTGAAA TTATGATTCG TGAAGTAAAA TAAGTTTTAA TAACCACGAA AACACAAAGA 480ACACAAGCGG TAGAATTTGC AGAAAAATTT GCAAATCCTA CCGCTTTTTT ATTAGTACGA 540TTCGCTGTTG GACTGCTATT TGATTTGGTT TGTCAGGATA TTATGTTATT GTAATGAAAT 600GTTAGTGAAT TATTTTTATT AATTTGAAAG GAAACAAAAT GAAAATAAAA AAACGTTACA 660TTGCGCTGTT GGTCTTAGGT 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GGC AAA GGG AAT GAT GTG CTT AAA GGA ACT GAA 2283Val Val Tyr Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu225 230 235CAT GAG GAT TTG TTT CTC GGT GGT GAG GGG AAT GAT ACT TAT TAT GCG 2331His Glu Asp Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala240 245 250AGA GTA GGC GAT ACA ATT GAA GAC GCC GAC GGC AAA GGT AAA GTC TAT 2379Arg Val Gly Asp Thr Ile Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr255 260 265TTT GTG AGA GAA AAA GGG GTA CCT AAG GCG GAT CCT AAG CGG GTA GAG 2427Phe Val Arg Glu Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu270 275 280TTT AGC GAG TAC ATA ACG AAA GAA GAA ATA AAA GAG GTT GAA AAG GGG 2475Phe Ser Glu Tyr Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Glu Val Glu Lys Gly285 290 295 300TTA TTA ACT TAC GCA GTT TTA GAA AAT TAT AAT TGG GAA GAG AAA ACG 2523Leu Leu Thr Tyr Ala Val Leu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr305 310 315GCG ACT TTC GCT CAT GCG ACT ATG CTT AAT GAG CTT TTT ACT GAT TAT 2571Ala Thr Phe Ala His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr320 325 330ACT AAT TAT CGT TAT 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151015151520AAC GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC TTT AGC 5748Asn Asp Ile Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr Ile Phe Ser152515301535AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC 5796Lys Gly His Gly Gln Asp Ile Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn1540154515501555CGA GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT GTG AAT TAT GCG 5844Arg Ala Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala156015651570GAA GTG AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT 5892Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr157515801585CAT GAT ACG GAT TCG GTC ACG ATA AAA TCC TTC TAC AAC CAT GTA GAT 5940His Asp Thr Asp Ser Val Thr Ile Lys Ser Phe Tyr Asn His Val Asp159015951600TAT CAA TTT GAC AAA TTG GAA TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGT GAT 5988Tyr Gln Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser Ile Thr Arg Asp160516101615GAA CTA GGT AAA CAA GGT ATG GCA TTA TTT GGC ACT GAC GGT GAT GAT 6036Glu Leu Gly Lys Gln Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp1620162516301635AAT ATC AAC GAC TGG GGA CGT AAC TCG GTG ATT GAT GCC GGT GCG GGT 6084Asn Ile Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val Ile Asp Ala Gly Ala Gly164016451650AAT GAT ACG GTT AAT GGC GGT AAT GGC GAT GAC ACC CTC ATC GGC GGC 6132Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu Ile Gly Gly165516601665AAA GGT AAT GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC 6180Lys Gly Asn Asp Ile Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr Ile167016751680TTT AGC AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT 6228Phe Ser Lys Gly His Gly Gln Asp Ile Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn168516901695GAT AAC CGC GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT ATT AAT 6276Asp Asn Arg Ala Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Ile Asn1700170517101715TTA TCC GAA CTT TGG TTT AGC CGA GAA AAT AAC GAT TTG ATT ATT AAA 6324Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn Asp Leu Ile Ile Lys172017251730TCA TTA TTA AGT GAG GAT AAA GTC ACG GTT CAA AAT TGG TAT TCA CAC 6372Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gln Asn Trp Tyr Ser His173517401745CAA GAT CAT AAA ATA GAA AAT ATT CGT TTA TCG AAT GAG CAA ACG TTG 6420Gln Asp His Lys Ile Glu Asn Ile Arg Leu Ser Asn Glu Gln Thr Leu175017551760GTG AGC ACT CAG GTG GAG AAG ATG GTT GAG TCG ATG GCC GGC TTT GCT 6468Val Ser Thr Gln Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala Gly Phe Ala176517701775CAG AAG CAC GGA GGA GAG ATA TCT CTT GTG TCG CTT GAA GAG GTA AAA 6516Gln Lys His Gly Gly Glu Ile Ser Leu Val Ser Leu Glu Glu Val Lys1780178517901795CAA TAT ATC AAT AGC TTA ACA GCT GCT TTA TAA CATACGAAAG AAATCGGCAC6569Gln Tyr Ile Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu *18001805AGTTTTTTTG AACTGTGCCG ATTTGATTTT AGTGTAAGAA TATAGCCTGA TTTTAAGAAA6629TTTACTCTTG GCTAATAACT ATTTCCCATT TTATAAGTTA TTGACGGATG GTTTTATCAA6689ATATGAGATC AAATCTTATT TTAAATTCGC TTTCCATTAA GCGATAT 6736(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度151個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO6Ile Asp Met Pro Pro Gly Thr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Leu Ser Gln1 5 10 15Gln Ile Pro Val Thr Gly Ala Val Val Val Thr Thr Pro Gln 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Ile65 70 75 80Arg Ser Gln Gln Glu Lys Ile Leu Val Gly Leu Lys Pro Gly Lys Tyr85 90 95Ser Lys Ala Gln Ile Leu Glu Met Leu Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Glu100 105 110Val Val Asn Gly Met Phe Ala Gly Glu Val Gln Thr Leu Gly Phe Tyr115 120 125Asp Asp Gly Lys Gly Asp Leu Leu Glu Arg Ala Tyr Ile Trp Asn Thr130 135 140Thr Gly Phe Lys Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val Ile Glu Glu Ser145 150 155 160Gly Lys Arg Tyr Ile Glu Asn Phe Gly Ile Glu Pro Leu Gly Lys Gln165 170 175Glu Asp Phe Asp Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg180 185 190Gly Leu Glu Ser Ile Ile Asp Pro Ser Gly Ile Gly Gly Thr Val Asn195 200 205Leu Asn Phe Thr Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thr Arg210 215 220Phe Lys Ala Glu Ala Ala Lys Lys Ser His Trp Ser Leu Val Asn Ala225 230 235 240Ala Lys Val Tyr Gly Gly Leu Asp Gln Ile Ile Lys Lys Leu Trp Asp245 250 255Ser Gly Ser Ile Lys His Leu Tyr Gln Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu260 265 270Lys Pro Ile Ile Tyr Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys Ile Glu Gly275 280 285Thr Lys Ile Thr Arg Arg Ile Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp Ile290 295 300Ala Asn Gln Lys Ile Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser305 310 315 320Val Ser Gly Ser Asp Ile Ile Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro325 330 335Thr Leu Asn Arg Met Leu Leu Ser Gln Leu Ile Gln Ser Phe Ser Asp340 345 350Ser Leu Ala Lys Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly355 360 365Val Val Tyr Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu370 375 380His Glu Asp Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala385 390 395 400Arg Val Gly Asp Thr Ile Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr405 410 415Phe Val Arg Glu Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu420 425 430Phe Ser Glu Tyr Ile Thr Lys Glu Glu Ile Lys Glu Val Glu Lys Gly435 440 445Leu Leu Thr Tyr Ala Val Leu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr450 455 460Ala Thr Phe Ala His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr465 470 475480Thr Asn Tyr Arg Tyr Glu Val Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys485 490 495Lys Leu Lys Ser Pro Leu Val Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val500 505 510Thr Pro Ile Asp Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Glu Lys Ser Ile Thr515 520 525Val Lys Asn Phe Lys Asn Gly Asp Leu Gly Ile Arg Leu Leu Asp Pro530 535 540Asn Ser Tyr Tyr Tyr Phe Leu Glu Gly Gln Asp Thr Gly Phe Tyr Gly545 550 555 560Pro Ala Phe Tyr Ile Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ala Lys Asn Asn565 570 575Ser Ser Gly Ala Gly Asn Ser Lys Asp Trp Gly Gly Asn Gly His Gly580 585 590Asn His Arg Asn Asn Ala Ser Asp Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Asn595 600 605Gly Asn Asn Gln Asn Asn Gly Ser Asn Gln Asp Asn His Ser Asp Val610 615 620Asn Ala Pro Asn Asn Pro Gly Arg Asn Tyr Asp Ile Tyr Asp Pro Leu625 630 635 640Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Leu Glu Thr Val Ser Met Asn Gly645 650 655Arg Gln Gly Ala Leu Phe Asp His Glu Gly Lys Gly Ile Arg Thr Ala
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157015751580Phe Gly Tyr His Asp Thr Asp Ser Val Thr Ile Lys Ser Phe Tyr Asn1585159015951600His Val Asp Tyr Gln Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser Ile160516101615Thr Arg Asp Glu Leu Gly Lys Gln Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp162016251630Gly Asp Asp Asn Ile Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val Ile Asp Ala163516401645Gly Ala Gly Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu165016551660Ile Gly Gly Lys Gly Asn Asp Ile Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp1665167016751680Thr Tyr Ile Phe Ser Lys Gly His Gly Gln Asp Ile Val Tyr Glu Asp168516901695Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr170017051710Asp Ile Asn Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn Asp Leu171517201725Ile Ile Lys Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gln Asn Trp173017351740Tyr Ser His Gln Asp His Lys Ile Glu Asn Ile Arg Leu Ser Asn Glu1745175017551760Gln Thr Leu Val Ser Thr Gln Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala176517701775Gly Phe Ala Gln Lys His Gly Gly Glu Ile Ser Leu Val Ser Leu Glu178017851790Glu Val Lys Gln Tyr Ile Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu *17951800180權(quán)利要求
1.減毒的活胸膜肺炎放線桿菌，其特征在于所述的細(xì)菌產(chǎn)生無(wú)功能的ApxIV毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的活減毒菌，其特征在于編碼ApxIV毒素的基因包括一個(gè)突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的活減毒菌，其特征在于所述的突變?yōu)椴迦牒?或缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的活減毒菌，其特征在于插入包括異源基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的活減毒菌，其特征在于所述的異源基因編碼一個(gè)或多個(gè)選自以下類群的抗原，包括豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)病毒、假狂犬病病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、大腸桿菌、豬丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌，支氣管炎博德特氏菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的活減毒菌，其特征在于所述的異源基因有功能地連接到apxIV基因的啟動(dòng)子區(qū)域。
7.核苷酸序列，其中帶有控制apxIV基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的核苷酸序列，其特征在于其包括SEQ ID NO5中位置451到1132的DNA片段或仍具有啟動(dòng)子活性的其子片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的核苷酸序列，其特征在于其包括SEQ ID NO5中位置617到641的DNA片段。
10.用于保護(hù)動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌種類的細(xì)菌感染的亞單位疫苗，其特征在于所述的疫苗包括純化的ApxIV毒素和藥物上可接受的載體。
11.用于保護(hù)動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌種類的細(xì)菌感染的活減毒疫苗，其特征在于所述的疫苗包括根據(jù)權(quán)利要求1-6的活減毒菌和藥物上可接受的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的疫苗，特征在于其包括佐劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12的疫苗，特征在于該疫苗為凍干的形式。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13的疫苗，特征在于其額外包括一種或多種來(lái)自豬病原性微生物或病毒的抗原。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗，特征在于其額外包括一種或多種選自以下類群的抗原，包括豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)病毒、假狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、大腸桿菌、豬丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管炎博德特氏菌、副豬嗜血桿菌及豬鏈球菌。
16.用于保護(hù)易感動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌感染的方法，所述的方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求10-15的疫苗。
17.用于制備產(chǎn)生無(wú)功能ApxIV毒素胸膜肺炎放線桿菌種類活減毒菌的方法，特征在于所述的方法包括在編碼apxIV蛋白的基因中導(dǎo)入突變。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，特征在于所述的突變通過(guò)導(dǎo)入缺失而獲得。
19.用于制備根據(jù)權(quán)利要求11-15活減毒疫苗的方法，所述的方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-6的細(xì)菌與藥物上可接受的載體混合。
20.用于制備根據(jù)權(quán)利要求10疫苗的方法，所述的方法包括將純化的ApxIV毒素與藥物上可接受的載體混合。
21.診斷測(cè)試，其用于區(qū)分以胸膜肺炎放線桿菌野生菌株感染的豬血清與包括根據(jù)權(quán)利要求1活減毒胸膜肺炎放線桿菌菌株的疫苗接種的豬血清，所述的測(cè)試特征在于該測(cè)試包括純化的ApxIV毒素。
22.用于區(qū)分豬中胸膜肺炎放線桿菌感染與豬中豬放線桿菌感染的診斷測(cè)試，特征在于所述的測(cè)試包括純化的ApxIV毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及在apxⅣ基因中具有突變從而不能產(chǎn)生有功能的ApxⅣ毒素的胸膜肺炎放線桿菌屬活減毒菌。本發(fā)明也涉及制備這種細(xì)菌的方法。包括這種細(xì)菌的疫苗及用于制備該疫苗的方法也是本發(fā)明的部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括ApxⅣ毒素的亞單位疫苗,制備該疫苗的方法及用于保護(hù)動(dòng)物免受胸膜肺炎放線桿菌屬細(xì)菌感染的方法。此外,本發(fā)明涉及apxⅣ基因的啟動(dòng)子。最后,本發(fā)明涉及用于選擇性診斷胸膜肺炎放線桿菌感染的診斷測(cè)試及區(qū)分胸膜肺炎放線桿菌野生菌株與疫苗菌株的診斷測(cè)試。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1202523SQ98109848
公開(kāi)日1998年12月23日 申請(qǐng)日期1998年4月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月10日
發(fā)明者R·P·A·M·塞格斯, J·夫雷 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司