專利名稱：一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型菌株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物疫苗工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一株豬胸膜肺炎放線桿菌血清2 型XT，同時還涉及一種豬胸膜肺炎放線桿菌的制備方法，該方法適用于高密度發(fā)酵豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT及其他血清型菌株，以大量制備抗原用于豬傳染性胸膜肺炎單價或多價疫苗。
背景技術(shù)：
豬傳染性胸膜肺炎(PorcineContagious Pleuropneumonia, PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus ρleuropneumoniae,APP)引起的以胸膜肺炎和出血性壞死性肺炎為特征的一種重要的豬呼吸道傳染病。其病原豬胸膜肺炎放線桿菌是高度專一寄生于豬呼吸道的一種革蘭氏陰性致病菌，病原本身根據(jù)研究年代的不同就曾經(jīng)被劃分于不同類屬的細(xì)菌，經(jīng)歷了一系列從表型鑒定到基因鑒定的過程，其毒力因子和保護(hù)性抗原因素復(fù)雜，目前為止根據(jù)其莢膜多糖和脂多糖抗原差異共有15個血清型，導(dǎo)致所引起疾病的病原學(xué)因素復(fù)雜，目前該病在全球呈暴發(fā)流行，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害。自我國發(fā)現(xiàn)PCP 流行以來，很多科研工作者對該病的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷及免疫防制等方面都進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成就。但目前該病在我國發(fā)病率仍逐年上升，有的豬場陽性率已達(dá)到70%以上，血清型有1、2、3、5、7與8型等，已經(jīng)成為當(dāng)前集約化豬場的主要傳染病之一， 嚴(yán)重危害著我國的養(yǎng)豬業(yè)。而且，APP產(chǎn)生的毒力因子對肺部防御系統(tǒng)的破壞，使得此病往往與副豬嗜血桿菌病、豬肺疫、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病等疾病混合或繼發(fā)感染， 進(jìn)一步加大疾病的危害，使之已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。疫苗免疫作為疾病防控的重要手段，隨著對該菌毒力因子在致病性和免疫保護(hù)作用研究的深入，國內(nèi)已經(jīng)有針對性防治豬胸膜肺炎放線桿菌血清型1型、3型、5型、7型感染的單價或多價疫苗的報(bào)道，但由于不同血清型所分泌毒素及表面抗原差異巨大，往往導(dǎo)致對其他血清型豬胸膜肺炎放線的保護(hù)效果不佳，而由于我國地域廣闊，又從許多國家進(jìn)口生豬，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗在對某一或幾種血清型株到達(dá)防治效果的同時，又會導(dǎo)致其他血清型的分離率上升，而豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型是在一種在全球廣泛流行的血清型，因此篩選到一株抗原效果好的2型菌顯得尤為必要。另一方面，長期以來我國細(xì)菌性疫苗的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)中，大規(guī)模的菌體高密度培養(yǎng)技術(shù)嚴(yán)重滯后，對豬胸膜肺炎放線桿菌的培養(yǎng)沒有系統(tǒng)優(yōu)化的培養(yǎng)基和針對其生長特性的培養(yǎng)條件控制手段，導(dǎo)致企業(yè)的生產(chǎn)成本高、效率低，從而使產(chǎn)品價格相對較高，影響了免疫普及率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型菌株，該菌具有適合用于滅活疫苗制備的毒力強(qiáng)，抗原效果好，保護(hù)力高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種豬胸膜肺炎放線桿菌的制備方法，該方法具有原料來源廣泛、價格低廉、質(zhì)量可控，菌體生長快、密度高，易于控制等優(yōu)點(diǎn)
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案完成其技術(shù)構(gòu)思是豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型菌株的分離、篩選和鑒定申請人從湖南湘潭市某豬場送檢的病料中分離并鑒定得到一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型菌，該菌株命名為豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT (Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2XT，XT為分離地湘潭拼音首字母)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 其保藏號為 CCTCC NO :M20114101. 1病料分離無菌取瀕死豬肺、咽喉扁桃體等組織，接種到TSA瓊脂培養(yǎng)上，10% C02、37°C條件下培養(yǎng)M 3 后挑選典型的單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。挑選純化好的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)液中，37°C搖床(220r/min)培養(yǎng)過夜。1. 2采用顯微觀察、PCR法、生化鑒定及瓊脂擴(kuò)散驗(yàn)進(jìn)行了分類和分型鑒定，具體步驟如下1.2. IPCR 鑒定模板的制備用接種環(huán)挑取數(shù)個純化后的菌落至裝有40 μ L無菌三蒸水的EP管中，水煮5 lOmin，立即放入冰水混合物中，待完全冷卻后，12000r/min離心3min，取上清 4°C保存?zhèn)溆肞CR 引物序列P1 :5，CCGACTTTTAAATCCGT3，；P2 :5，GAACAGTTGTTCGCTAA3，PCR 反應(yīng)條件10 倍緩沖液5μ L ；25mmol/L MgCl2 3μ L ； 2mmol/L dNTPs 1. 0μ L ； 1· 5 μ mol/L 上游引物(Pl) L 5 μ L ； 1· 5 μ mol/L 下游引物(P2) 1· 5 μ L ；TaqDNA 酶 0. 5 μ L ； 無菌水27. 5 μ L ；模板10 μ L。反應(yīng)程序94 V預(yù)變性^iin后，按94 °C 40s, 65 V 40s， 72°C lmin40s的循環(huán)程序進(jìn)行30次循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后再延伸lOmin，取PCR產(chǎn)物于含EB的0.8% (m/v)瓊脂糖膠中電泳，紫外線燈下觀察分析。預(yù)期擴(kuò)增的靶基因?yàn)锳PP外膜脂蛋白基因610bp大小的片段，并以豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型42^(Actin0bacillu spleuropneumoniae serotype 2 2264，由澳大利亞昆士蘭州動物研究所 Blackall 和 Ross fl|dr, |!H,Blackall PJ,Pahoff JL. Characterisation of porcine haemophili isolated fromAustralian pigs between 1988 and 1992,Aust Vet J. 1995 Jan ；72(1) :18-21.)作標(biāo)準(zhǔn)對照。1. 2. 2生化鑒定根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第八版》關(guān)于胸膜肺炎放線桿菌鑒定所需的生化項(xiàng)目，選擇所需的微量鑒定管(購于杭州天和微生物試劑有限公司)。按照微量鑒定管的說明書來操作。挑取1純化培養(yǎng)好的菌落接種于相應(yīng)培養(yǎng)基做尿酶、β -溶血、 NAD依賴性、cAMP等特性試驗(yàn)，并以豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型4226作標(biāo)準(zhǔn)對照。。1. 2. 3瓊脂擴(kuò)散鑒定用0. 15mol/L NaCl收集TSA平板上培養(yǎng)了 Mi的菌落，于 5000r/min離心15min，洗滌一次，沉淀菌體用68°C去離子水作適量稀釋，混勻后加等積的 68°C的平衡酚，于68°C水浴20min，其間不斷攪拌。取出后冰浴冷卻，4°C 7000r/min 20min, 取水相；再加與第一次等量的68°C的去離子水，如上法水浴冰浴，離心，取水相。將兩次水相混勻，即為抗原。抗血清由陳凡(陳凡等，2004，胸膜肺炎放線桿菌生物I型標(biāo)準(zhǔn)抗血清的制備及初步臨床應(yīng)用.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，沈(6) =458-461)將標(biāo)準(zhǔn)菌株免疫兔制備。瓊斯擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，將瓊脂lg，NaC18. 5g，溶于IOOmL蒸餾水中，在微波爐中加熱至充分溶解，倒入90mm平板中，瓊脂層3 4mm厚，待其凝固后，用打孔器在平板上按需要打孔(孔徑3mm、孔距4mm)，封底，中央孔加入抗原，周圍孔加入各型陽性血清，以加滿為宜(每孔約15 μ 1左右)，以未免疫家兔的血清為對照。放入濕盒中，置于37°C，24h后觀察結(jié)果。以抗原與抗體孔之間出現(xiàn)清晰白色沉淀線為陽性。根據(jù)以上鑒定結(jié)果，確定上述分離菌為豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型，命名為豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT。該菌的培養(yǎng)必須需要添加V因子，在綿陽血平板上，可產(chǎn)生穩(wěn)定的β溶血，金黃色葡萄球菌可增強(qiáng)其溶血圈(CAMP陽性)，在10% C02、37°C的條件下生長旺盛。在TSA(含NAD)固體培養(yǎng)基上，于10% C02、37°C下，培養(yǎng)24h后形成直徑1 2mm透明、圓潤的菌落。鏡檢呈革蘭氏陰性，菌體平直，兩極著色的短桿菌。發(fā)酵葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、海藻糖、密二糖，在麥康凱平板上不能生長。該菌的毒力較強(qiáng)，以TSB (含NAD) 12h培養(yǎng)物2ml滴鼻攻毒10周齡仔豬，6 8小時內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、食欲減退、精神沉郁、發(fā)燒、有的伴有嘔吐癥狀，20左右小時出現(xiàn)死亡。一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT的制備方法，其步驟是以豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT發(fā)酵一定時間后的活菌量(cfu/ml)為指標(biāo)， 通過兩水平正交實(shí)驗(yàn)從眾多營養(yǎng)組分中篩選出對豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT生長影響較顯著的組分，包括酵母粉、葡萄糖、谷氨酸鈉、K2HPO4, NaH2PO4, MgSO4, FeSO4 · 7H20、輔酶 I，接著通過爬坡實(shí)驗(yàn)找到影響最大的四種組分的最適濃度區(qū)間，再通過中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定其最終濃度。實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化培養(yǎng)基的組分及濃度范圍為酵母粉20 30g/L， 葡萄糖 3 5g/L，谷氨酸鈉 1 3g/L, K2HPO4 2 5g/L, NaH2PO4 0. 5 2g/L，MgSO4 0. 5 lg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 05 0. lg/L，輔酶 I (NAD) 0· 01 0. 03g/L,最優(yōu)配方濃度為酵母粉 27. 55g/L，葡萄糖 3. 45g/L，谷氨酸鈉 2. 77g/L，K2HPO4 4. 41g/L，NaH2PO4 1. 00g/L，MgSO4 0. 80g/L, FeSO4 · 7H20 0. lOg/L, NAD 0. 02g/L。上所述培養(yǎng)基的配制方法如下(1L體積)1、按上述配方稱取除酵母粉20 30g/L，葡萄糖3 5g/L，谷氨酸鈉1 3g/L， K2HPO4 2 5g/L, NaH2PO4 0. 5 2g/L, MgSO4 0. 5 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 05 0. lg/L,輔酶I (NAD) 0. 01 0. 03g/L,將除NaH2PO4, K2HPO4、輔酶I之外的其他組分，溶入900ml純水中，調(diào)節(jié)pH值到7. 4 士 0. 2，115°C下滅菌25min。2、將 NaH2P04、K2HP04 配成 10 倍濃度母液，121°C下滅菌 15min 后，取 100ml。3、將輔酶I配成1000倍濃度母液，0. 2 μ m孔徑濾膜過濾后，取1ml。4、將上述步驟1、2、3得到的溶液混合，即得到所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清2 型XT高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明進(jìn)一步在100L發(fā)酵罐(本發(fā)明使用高機(jī)BI0F6000型全自動發(fā)酵罐)中對豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT在上述優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長控制條件進(jìn)行控制摸索，確定工藝條件如下1.將凍干種子菌用添加有NAD的TSA平板37°C活化18 Mh，至明顯單菌落長
出ο2.挑取單菌落至添加有NAD的TSB搖瓶種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 他至0D_值達(dá)到 0. 4 0. 6。3.以3% 5%接種量將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到裝液系數(shù)為70%的優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵罐中。4.發(fā)酵初期lOOr/min低速攪拌，通氣量控制在1800L/h，溫控為恒溫37°C。
5.發(fā)酵后，逐步提高轉(zhuǎn)速到200r/min，通氣量到3000L/h，并在線補(bǔ)加NH3控制 pH在7.0左右。6.發(fā)酵IOh左右，觀察到NH3停止補(bǔ)加且溶氧DO值回升到80以上時，放罐收菌。最后，將本發(fā)明培養(yǎng)得到的豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT菌體制備成滅活疫苗，進(jìn)行免疫攻毒實(shí)驗(yàn)。 按如下工藝制備常規(guī)豬傳染性胸膜肺炎滅活疫苗1、滅活將檢驗(yàn)合格的菌液，按菌液總量的0.4% (體積比)加入甲醛溶液，37°C 滅活48小時，期間每隔4小時攪拌1次，然后取樣并進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。2、濃縮將滅活檢驗(yàn)合格的菌液離心，按滅活前的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果用生理鹽水調(diào)節(jié)豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT濃度到3 X 109CFU/ml。取樣做無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。3、配苗油相的制備，取埃克森美孚進(jìn)口白油94份(以毫升為單位)，加入硬脂酸鋁1份(以克為單位)，邊加邊攪拌，直到透明為止，再加入司本-80 6份(以毫升為單位)， 充分混勻，130°C滅菌30分鐘，冷卻至室溫Q0-25°C，以下相同)備用；水相的制備，將濃縮好的菌液加入滅菌后的吐溫-80，邊加邊攪拌，至完全溶解，使其終濃度為4. 0%。4、乳化與分裝水相與油相的比例為1 1.5。將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，剪切，制成均勻乳劑。定量分裝后，加塞密封，置2 8 °C保存。免疫試驗(yàn)方案用觀 35日齡健康斷奶仔豬12頭，其中5頭各肌肉注射發(fā)明制得的疫苗^iil，含 1個使用劑量，首免后21日進(jìn)行第二次免疫；另5頭免疫常規(guī)TSB (發(fā)酵制備疫苗作為對照組；剩下2頭作為未免疫組。免疫后測定動物體溫，觀察臨床表現(xiàn)。二免后14日，以同一批制苗強(qiáng)毒株1 培養(yǎng)物4mL滴鼻攻毒效檢，攻毒后觀察其臨床癥狀和死亡情況，計(jì)算兩組疫苗的保護(hù)率。本發(fā)明特點(diǎn)在于提供一株高致病豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT，通過培養(yǎng)基優(yōu)化得到適用于豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并通過發(fā)酵控制優(yōu)化保證菌體旺盛生長了一種可以用于豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT滅活疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模增殖培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，所用材料和工藝均以疫苗生產(chǎn)為最終目的。采用上述培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法培養(yǎng)豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT，與其他培養(yǎng)基相比能獲得較高的菌量，而且材料來源廣泛且價格低廉，在疫苗生產(chǎn)過程中能得到高純度的細(xì)菌。在100L發(fā)酵罐生產(chǎn)中的應(yīng)用顯示，本發(fā)明的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法發(fā)酵豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT，終點(diǎn)活菌數(shù)可達(dá)到94億/ml，菌體制備的滅活疫苗抗原效果好，攻毒免疫保護(hù)力高于80%。


圖1為一種病原菌PCR鑒定膠示意圖。其中1-4號泳道為肺臟分離菌，5-6號泳道為扁桃體分離菌，7號泳道為陰性對照， 8號泳道為APP標(biāo)準(zhǔn)菌株42 .圖2為豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT在裝有50ml本發(fā)明優(yōu)化培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基的250ml搖瓶培養(yǎng)過程中的生長曲線對比圖。圖3為一種是豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT在使用本發(fā)明優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法在100L發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 菌種分離及鑒定從豬場送檢的瀕死病料中無菌取豬肺、咽喉扁桃體等組織，接種到TSA瓊脂培養(yǎng)基上，10% CO2, 37°C培養(yǎng)M 3 后挑選典型的單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。挑選純化好的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)液中，37°C搖床(220r/min)培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)特性該菌在10% C02，37°C的條件下生長良好，液體培養(yǎng)基上生長旺盛。在 TSA(含NAD)固體培養(yǎng)基上，于10% 0)2、37°〇下，培養(yǎng)2411后形成直徑1 2mm透明、圓潤的菌落。病原的形態(tài)特征自然發(fā)病豬和實(shí)驗(yàn)感染小鼠的肺和純培養(yǎng)物鏡檢，可見有革蘭氏陰性，菌體平直，兩極著色的短桿菌。PCR檢測結(jié)果6個待檢樣品中有2個擴(kuò)出610bp特異性條帶(見圖1)，其中1_4 號為肺臟，5-6為扁桃體，說明肺臟和扁桃體均是APP的靶組織，提示可以用采集肺臟和扁桃體作為APP的待檢病料，該患豬已經(jīng)感染豬傳染性胸膜肺炎對從上述PCR鑒定陽性病料中分離的單菌落進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1，表1生化鑒定試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型菌株，其特征在于豬胸膜肺炎放線桿菌血清2 M XT(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2XT), CCTCC NO :M2011410。
2.權(quán)利要求1所述的一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT菌株的制備方法，其步驟是A、按配方稱取酵母粉20 30g/L、葡萄糖3 5g/L、谷氨酸鈉1 3g/L、K2HP042 5g/L、NaH2P04 0. 5 2g/L、MgS04 0. 5 lg/L、FeS04 ·7Η20 0· 05 0. lg/L、輔酶 I 0· 01 0. 03g/L，將除NaH2P04、K2HP04、輔酶I之外的其他組分，溶入900ml純水中，調(diào)節(jié)pH值到 7. 4士0. 2，115°C下滅菌 25min ；B、將NaH2P04、K2HP04配成10倍濃度母液，121°C下滅菌15min后，取IOOml；C、將輔酶I配成1000倍濃度母液，0.2 μ m孔徑濾膜過濾后，取Iml ；D、將上述步驟A、B、C得到的溶液混合，即得到所述的豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基；進(jìn)一步在100L發(fā)酵罐中對豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT在培養(yǎng)基中的生長控制條件進(jìn)行控制摸索，其條件是a、將凍干種子菌用添加有NAD的TSA平板37°C活化18 Mh，至單菌落長出；b、挑取單菌落至添加有NAD的TSB搖瓶種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 他至0D600值達(dá)到 0. 4 0. 6 ；C、以3% 5%接種量將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到裝液系數(shù)為70%的培養(yǎng)基發(fā)酵罐中；d、發(fā)酵初期lOOr/min攪拌，通氣量控制在1800L/h，溫控為恒溫37°C；e、發(fā)酵池后，提高轉(zhuǎn)速到200r/min，通氣量到3000L/h，并在線補(bǔ)加NH3控制pH在7. 0 ；f、發(fā)酵10h，觀察到NH3停止補(bǔ)加且溶氧DO值回升到80以上時，放罐收菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型菌株及制備方法，為豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT，CCTCC NO:M2011410。其步驟一培養(yǎng)基制備，A、稱取酵母粉、葡萄糖、谷氨酸鈉、MgSO4、FeSO4·7H2O，溶入純水中，調(diào)節(jié)pH值，滅菌；B、稱取NaH2PO4、K2HPO4配成母液，滅菌；C、稱取NAD配成母液，濾膜過濾；D、按量將步驟A、B、C得到的溶液混合，得到培養(yǎng)基；二發(fā)酵培養(yǎng)，a、將凍干種子用含NAD的TSA平板活化，至單菌落長出；b、挑取單菌落搖瓶培養(yǎng)；c、將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中；d、發(fā)酵初始低攪拌，低通氣；e、對數(shù)期，提高轉(zhuǎn)速和通氣，并在線控制pH；f、溶氧回升，放罐收菌。適合用于滅活疫苗制備的毒力強(qiáng)，抗原效果好，價格低廉，菌體生長快、密度高，易于控制。
文檔編號C12N1/20GK102391975SQ20111037889
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者周明光, 康超, 徐高原, 王楊波, 金梅林, 陳關(guān)平, 陳煥春, 陳章表 申請人:武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司