利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，所述方法包括菌體蛋白的提取、第一向IPG等點聚焦電泳、SDS?PAGE凝膠電泳、凝膠掃描和圖像分析等步驟。運用本方法能獲得蛋白質(zhì)清晰、背景清楚的雙向電泳凝膠圖譜，能夠明確得鑒定出產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中是否存在β?葡萄糖苷酶，從而解析產(chǎn)琥珀酸放線桿菌在二糖利用過程中的糖轉(zhuǎn)運和降解機制，對于后續(xù)利用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌工業(yè)化生產(chǎn)丁二酸的過程十分有利，尤其對于碳源優(yōu)化、發(fā)酵過程控制、降低成本有重要的意義。
【專利說明】
利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁二酸作為一種四碳化合物，在工業(yè)上具有重要的用途，它可作為有機合成的原材料、中間產(chǎn)物或?qū)Ｓ没瘜W(xué)品廣泛應(yīng)用于食品、香料、醫(yī)藥、油漆、塑料、材料等產(chǎn)業(yè)。生物法生產(chǎn)丁二酸具有許多優(yōu)點，因此受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前，利用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸是國內(nèi)外研究的熱點之一。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能利用多種糖類，包括一些二糖(例如纖維二糖)。研究表明，該菌株具有較強的利用纖維二糖發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的能力(Min Jiang, Rong Xu, Yong-Lan Xi, et al.Succinic acid product1n fromcellob1se by Actinobacillus succinogenes.B1resource Technology, 2013, 135
(5):469-474.)。該菌是如何攝入并降解利用纖維二糖的，纖維二糖是直接以二糖的形式進入細胞代謝網(wǎng)絡(luò)還是細胞將纖維二糖降解為兩分子的葡萄糖之后再被細胞降解利用，解析這一問題對于研究產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能利用多種碳源的機制有重要的意義。纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下，可被降解為兩分子葡萄糖。本專利旨在利用雙向電泳技術(shù)來檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌糖轉(zhuǎn)運機制中是否存在β-葡萄糖苷酶，從而更好地解析產(chǎn)琥珀酸放線桿菌在二糖利用過程中的糖轉(zhuǎn)運和降解機制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]利用酶活法測定菌體中是否存在某種酶對酶本身的活力和含量要求較高，特別對于一些含量比較低的蛋白，利用酶活測定法無法準(zhǔn)確獲知酶在該菌體中是否存在。本發(fā)明的目的在于提供一種利用雙向電泳技術(shù)來檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中葡萄糖苷酶的方法。
本發(fā)明所述的利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中葡萄糖苷酶的方法通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，包括以下步驟:
步驟I)培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，提取菌體蛋白；
步驟2)采用IPG固相膠條，水化上樣，進行等點聚焦，等電聚焦完成后平衡膠條；
步驟3)轉(zhuǎn)移步驟2)平衡后的膠條至SDS-PAGE凝膠上進行電泳；
步驟4)將所得凝膠染色脫色后，掃描并分析圖像。
[0004]具體地，所述步驟I)中產(chǎn)琥泊酸放線桿菌為產(chǎn)琥泊酸放線桿菌(Actinobac Hlussuccinogenesmil'i CGMCC N0.1716，培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌方法如下:將凍存于_70°C冰箱的菌種在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h;活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，充⑶2 2?3min，培養(yǎng)溫度35?37 °C，培養(yǎng)時間10?12h;將活化好的種子液接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比3?10%，溫度為35?40 °C，始終通入C02氣體來保持厭氧環(huán)境，纖維二糖作為碳源，整個發(fā)酵過程中PH控制在6.5-7.0,攪拌速度為100?300 rpm，發(fā)酵30?40 h。
[0005]具體地，所述步驟I)提取菌體蛋白的具體方法為:菌體以纖維二糖作為唯一碳源發(fā)酵12?16h后，取發(fā)酵液，離心去除上清獲得菌體沉淀，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品。利用clean-up試劑盒對該總蛋白樣品進行純化，試劑盒純化能去除蛋白樣品溶液中的雜質(zhì)，有利于獲得理想的電泳圖譜。
具體地，所述步驟2)具體為:將步驟I)提取的菌體蛋白與水化液混合成上樣液，加有已知酶的菌體蛋白與水化液混合成上樣液作為對照，水化上樣，泡漲IPG固相膠條，然后轉(zhuǎn)移至膠條槽中，進行等點聚焦，等點聚焦結(jié)束后將膠條依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡條件為搖床轉(zhuǎn)速40rpm下平衡15min;
其中，所述水化液:2%CHAPS，0.5%IPG緩沖液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚藍；
所述平衡液I: SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/膠條；
所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/膠條；
所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M尿素，2%SDS，0.002%溴酚藍，29.3%甘油。具體地，所述的酶為葡萄糖苷酶;所述上樣液體積為450HL，上樣液含有菌體蛋白I?2mg，泡漲時間10?12h，所述IPG固相膠條為24cm的線性的固相干膠條pH3_10，等點聚焦過程參數(shù)設(shè)置如下:30V運行10h，500V運行l(wèi)h，1000V運行l(wèi)h，1000V電壓2小時內(nèi)梯度升高至10000V，10000 V運行7?8h，1000V運行2?3h，上限電流為50μΑ/膠條，溫度為20 °C。
[0006]具體地，所述步驟3)中SDS-PAGE凝膠電泳中膠濃度為12.5%，電泳條件為3W/膠條4?5h，10-13W/膠條，直至溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。
[0007]具體地，所述步驟4)采用考馬斯亮藍染色;分析圖像具體方法為:將菌體蛋白樣品和加有已知酶的菌體蛋白樣品分別獲得的凝膠圖像進行比對，找出差異的蛋白點。
[0008]本發(fā)明所使用的菌株產(chǎn)琥?白酸放線桿菌(Ac t inobac illus succ inogenes )NJ 113的來源:在中國專利局或國際專利組織承認的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了專利程序保藏(保藏編號:CGMCC N0.1716)的，并在本申請日之前已授權(quán)(專利號200610085415.9，授權(quán)公告日2009年9月9日，授權(quán)公告號CN100537744 C)的生物材料。
[0009]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明所述方法提供了一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中葡萄糖苷酶的方法，本方法易操作，實驗結(jié)果分析簡便，而傳統(tǒng)的利用酶活法測定菌體中酶的方法對操作的要求高，整個操作必須保證酶的活性，而且對酶量的要求比較高，微量的酶通過酶活法很難檢測，而對于細胞膜上的酶的提取往往損失較為嚴(yán)重，很難獲得活性比較好的酶。本方法彌補了上述所有的缺陷，可以作為檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的有效手段。
【附圖說明】
[0010]圖1是采用24cm的線性的IPG固相干膠條ΡΗ3-10的雙向電泳凝膠考染圖，蛋白樣品為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌蛋白提取液。
[0011]圖2是采用24cm的線性的IPG固相干膠條pH3_lO的雙向電泳凝膠考染圖，蛋白樣品為加有β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌蛋白提取液。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段或者按照制造廠商所建議的條件。
[0013]本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均可通過通過商業(yè)化渠道購得。
[0014]實施例1
本發(fā)明所使用的菌株產(chǎn)琥泊酸放線桿菌(Ac t inobac ? I Ius succinogenes )NJ113的來源:在中國專利局或國際專利組織承認的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了專利程序保藏(保藏編號:CGMCC N0.1716)的，并在本申請日之前已授權(quán)(專利號200610085415.9，授權(quán)公告日2009年9月9日，授權(quán)公告號0肌00537744 C)的生物材料。
[0015]活化菌種:將凍存于-70 °C冰箱的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Ac ZinokcH/mssucc inogenes )NJ113菌種在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在37 C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h0
[00? 6] 種子培養(yǎng):將產(chǎn)琥I自酸放線桿菌(Ac / i I Ius succ inogenes )NJ113接種至種子培養(yǎng)基中，10mL血清瓶裝液量50mL，充⑶2 2?3min，培養(yǎng)溫度35?37°C，培養(yǎng)時間10?12h0
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)菌體:將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為體積比3?10%，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，纖維二糖作為碳源，整個發(fā)酵過程中pH控制在6.5-7.0,發(fā)酵溫度35?37°C，攪拌速度為100~300 rpm，發(fā)酵30?40 h。
[0018]上述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何可以被產(chǎn)琥珀酸放線桿菌利用的培養(yǎng)基成分。在本發(fā)明的實施例中，所述種子培養(yǎng)基組分為:葡萄糖10?20g/L，酵母膏 5 ?10 g/L，NaH2PO4.2H20 9.6 ?15.5g/L，K2HP04.3Η20 15.5 ?21.4 g/L，NaHCO3 10?18 g/L，玉米漿 5?10 g/L,pH 6.0?8.0。
[0019]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為:纖維二糖40 g/L，乙酸鈉1.36?2.8 g/L,NaCl I?2.2g/L，CaCl2 0.2?0.4 g/L，MgCl2 0.2?0.5 g/L,Na2HPO4 0.31 ?0.65 g/L,NaH2PO4 1.6 —3.5 g/L,K2HPO4 3?6.1 8/1，酵母膏10?2(^/1，？冊.0~8.0。
[0020]提取菌體蛋白:菌體以纖維二糖作為唯一碳源發(fā)酵12?16h后，取發(fā)酵液，離心去除上清獲得菌體沉淀，加入預(yù)冷的含有20mmol/LDTT的10%TCA丙酮溶液混勻后置于-20°C中過夜，離心去上清，風(fēng)干沉淀，向沉淀中加入雙向電泳裂解液(7M尿素，4%CHAPS，2%IPG緩沖液，40mM DTT)，室溫下浸提2h，離心取上清，即制得產(chǎn)琥I自酸放線桿菌(Act inobac Hlussucc inogenes )NJ113的總蛋白樣品溶液。用c I ean_up試劑盒(從GE公司購得)純化，試劑盒純化能去除蛋白樣品溶液中的雜質(zhì)，有利于獲得理想的電泳圖譜。
[0021 ]蛋白質(zhì)定量:用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。
[0022]水化上樣:將提取的菌體蛋白2mg與水化液(2%CHAPS，0.5%IPG緩沖液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚藍)混合成上樣液450UL，水化上樣，泡漲IPG固相膠條12h，IPG固相膠條為24cm的線性的固相干膠條pH3-10，設(shè)有三個平行膠條，平行樣之間的實驗條件完全一致。
[0023]等電聚焦:將泡漲好的膠條轉(zhuǎn)移至膠條槽中，進行等點聚焦，等點聚焦過程參數(shù)設(shè)置如下:30V運行10h，500V運行l(wèi)h，1000V運行l(wèi)h，1000V電壓2小時內(nèi)梯度升高至10000V，10000 V運行7?8h，1000V運行2?3h，上限電流為50μΑ/膠條，溫度為20 0C。
[0024]膠條平衡:等點聚焦結(jié)束后將膠條依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡條件為搖床轉(zhuǎn)速40rpm下平衡15min。所述平衡液1:SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/膠條；所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/膠條;所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M 尿素，2%SDS，0.002% 溴酚藍，29.3% 甘油。
SDS-PAGE凝膠電泳:使用垂直電泳，膠濃度為12.5%，將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至SDS-PAGE凝膠的上端，用瓊脂糖封頂。電泳的條件為3W/膠條4?5h，10-13W/膠條，直至溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。
[0025]考馬斯亮藍染色:將跑完的凝膠放于考馬斯亮藍R-250染色液(Ig考馬斯亮藍R-250粉末溶于300mL乙醇、10mL乙酸和600mL水的混合溶液中)中，震蕩染色過夜，將膠條轉(zhuǎn)移至脫色液[40%(v/v)乙醇、20%(v/v乙酸)，40%(v/v)超純水]中，震蕩脫色，直至凝膠背景透明。
[0026]凝膠掃描和圖像分析:將脫色過的凝膠置于掃描儀上掃描，保存圖片，如圖1所示。平行之間的凝膠圖片重復(fù)性比較高，沒有蛋白點丟失，本實施例證明采用上述電泳實驗可以獲得菌體的蛋白質(zhì)圖譜。
[0027]實施例2
取實施例1提取的菌體蛋白2mg，加入β-葡萄糖苷酶(從Fluka公司購買)0.1mg，與水化液混合上樣，其他條件同實施例1。
[0028]凝膠圖片如圖2所示。將圖1與圖2進行差異分析，圖2中方框標(biāo)出的點為β-葡萄糖苷酶，圖1中此位置沒有出現(xiàn)蛋白點，結(jié)果證明產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中不含β-葡萄糖苷酶，這對于研究產(chǎn)琥珀酸放線桿菌二糖代謝機理有很大的幫助。
【主權(quán)項】
1.一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，提取菌體蛋白； 步驟2)采用IPG固相膠條，水化上樣，進行等點聚焦，等電聚焦完成后平衡膠條； 步驟3)轉(zhuǎn)移步驟2)平衡后的膠條至SDS-PAGE凝膠上進行電泳； 步驟4)將所得凝膠染色脫色后，掃描并分析圖像。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟I)中產(chǎn)琥?自酸放線桿菌為產(chǎn)琥?自酸放線桿菌(Act inobaci I Iussuccinogenesmil'i CGMCC N0.1716，培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌方法如下:將凍存于_70°C冰箱的菌種在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在37 °(:厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h;活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，充⑶2 2?3min，培養(yǎng)溫度35?37 °C，培養(yǎng)時間10?12h;將活化好的種子液接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比3?10%，溫度為35?40 °C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，纖維二糖作為碳源，整個發(fā)酵過程中PH控制在6.5-7.0,攪拌速度為100?300 rpm，發(fā)酵30?40 h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟I)提取菌體蛋白的具體方法為:菌體以纖維二糖作為唯一碳源發(fā)酵12?16h后，取發(fā)酵液，離心去除上清獲得菌體沉淀，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品，利用clean-up試劑盒對該總蛋白樣品進行純化。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟2)具體為:將步驟I)提取的菌體蛋白與水化液混合成上樣液，加有已知酶的菌體蛋白與水化液混合成上樣液作為對照，水化上樣，泡漲IPG固相膠條，然后轉(zhuǎn)移至膠條槽中，進行等點聚焦，等點聚焦結(jié)束后將膠條依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡條件為搖床轉(zhuǎn)速40rpm下平衡15min; 其中，所述水化液:2%CHAPS，0.5%IPG緩沖液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚藍； 所述平衡液I: SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/膠條； 所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/膠條； 所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M尿素，2%SDS，0.002%溴酚藍，29.3%甘油。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述的酶為β-葡萄糖苷酶。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述上樣液體積為450yL，上樣液含有菌體蛋白I?2mg，泡漲時間10?12h，所述IPG固相膠條為24cm的線性的固相干膠條pH3-10，等點聚焦過程參數(shù)設(shè)置如下:30V運行10h，500V運行l(wèi)h，1000V運行l(wèi)h，1000V電壓2小時內(nèi)梯度升高至10000V，10000 V運行7?8h，100V運行2?3h，上限電流為50μΑ/膠條，溫度為20 °C。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟3)中SDS-PAGE凝膠電泳中膠濃度為12.5%，電泳條件為3W/膠條4?5h，10-13W/膠條，直至溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟4)采用考馬斯亮藍染色。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳技術(shù)檢測產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟4)中分析圖像具體方法為:將菌體蛋白樣品和加有已知酶的菌體蛋白樣品分別獲得的凝膠圖像進行比對，找出差異的蛋白點。
【文檔編號】G01N21/84GK105891303SQ201610305977
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】徐蓉, 徐為民, 徐世偉, 孫雨茜, 徐寸發(fā), 周昊
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院