一種多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法
【專利摘要】一種多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，包括以下步驟：第一步，配種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補料罐培養(yǎng)液和培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液；第二步，對串聯(lián)發(fā)酵罐組、碳源補料罐、培養(yǎng)基補料罐、種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補料罐培養(yǎng)液、培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液以及血清瓶進行滅菌處理；第三步，取滅菌后的血清瓶，接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，通入CO2后再接入產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillussuccinogenes）NJ113搖床培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種；第四步，多級連續(xù)發(fā)酵。由于本發(fā)明生產方法簡單，丁二酸的產率和純度高，適合產業(yè)化生產。
【專利說明】一種多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于丁二酸制備領域，具體涉及一種多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法。

【背景技術】
[0002] 丁二酸，又名琥拍酸（succinate acid),是一種常見的天然有機酸，是三羧酸循環(huán) 的中間代謝產物之一，廣泛存在于動、植物和微生物中。作為一種重要的碳四平臺化合物， 丁二酸是重要的中間產物和1，4-丁二醇（BDO)、丁內酯、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮 (NMP)、已二酸、蘋果酸以及新型的生物降解塑料產品聚丁二酸丁二醇酯（PBS)等專業(yè)化學 制品的前體物質，這些化學品的市場總額達150億美金。最新的研究結果還表明丁二酸在 生物降解塑料的制備應用方面具有非常廣闊的前景。將丁二酸與1，4-丁二醇進行聚合反 應可生成一類新型的生物降解塑料產品--聚丁二酸丁二醇酯（PBS)。
[0003] 丁二酸的合成方法有化學法和生物法，目前工業(yè)應用的主要為化學法生產丁二 酸?；瘜W法主要有催化加氫法、石蠟氧化法、電化學合成法。但是化學法主要利用不可再生 的石油資源作為原料，成本高，污染嚴重而且無法可持續(xù)發(fā)展，嚴重限制了丁二酸的發(fā)展。 近年來，隨著石化資源的日益枯竭，環(huán)境危機日益加劇，越來越多的國內外研究者將目光放 在了生物法制備丁二酸上。與傳統(tǒng)化學法相比，生物法具有明顯的優(yōu)勢。生物法發(fā)酵丁二 酸具有成本低、優(yōu)良的環(huán)境效益以及具有固定溫室氣體C0 2等優(yōu)勢。丁二酸是三羧酸循環(huán) 的中間代謝產物，也是眾多厭氧微生物和兼性厭氧微生物的還原性終端代謝產物，幾乎所 有的動植物均能合成丁二酸，常用微生物有產琥珀酸厭氧螺菌，產琥珀酸放線桿菌，大腸桿 菌，谷氨酸棒桿菌，曼海姆產琥珀酸菌等。
[0004] 中國專利CN101857888 A公開了一種利用乳清發(fā)酵生產丁二酸的方法，采用產琥 拍酸放線桿菌swcciflogefles NJ113在含30?100g/L乳糖的乳清的培養(yǎng) 基中發(fā)酵產琥珀酸，產物濃度高達47. 51g/L，收率高達67. 9%。


【發(fā)明內容】

[0005] 解決的技術問題：針對現有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多級連續(xù)發(fā) 酵生產丁二酸的方法，制備過程簡單，丁二酸產量高。
[0006] 技術方案：為解決現有技術問題，本發(fā)明采取的技術方案： 一種多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，包括以下步驟： 第一步，配種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補料罐培養(yǎng)液和培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液； 第二步，對發(fā)酵罐、碳源補料罐、培養(yǎng)基補料罐、種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補 料罐培養(yǎng)液、培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液以及血清瓶進行滅菌處理； 第三步，取滅菌后的血清瓶，接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，通入co2后再接入產琥珀酸放 線桿菌)NJ113搖床培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種； 第四步，多級連續(xù)發(fā)酵，將滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入初始發(fā)酵培養(yǎng) 基，通入氣體，再按照接種量體積比為3-10%接入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐 流入二級發(fā)酵罐、三級發(fā)酵罐，依次流到最后一級發(fā)酵罐中，通過調節(jié)通氣量、一級發(fā)酵罐 的初糖濃度、各級發(fā)酵罐的補糖速率、發(fā)酵液流出速率和發(fā)酵液流入速率控制各級發(fā)酵罐 內的糖濃度，通過控制各級發(fā)酵罐中細胞生物量和細胞回流速率來完成丁二酸的發(fā)酵，發(fā) 酵全程pH為6. 5-7. 5,溫度為35-40°C進行50-750h。
[0007] 作為優(yōu)選的是，當發(fā)酵罐數量為3個時，該三級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級： 90%-80%殘?zhí)?；二級?0%-45%殘?zhí)?；三級?5%-0%殘?zhí)牵?當發(fā)酵罐數量為4個時，該四級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-85%殘?zhí)牵欢墸?70%-55%殘?zhí)?；三級?0%-25%殘?zhí)牵凰募墸?5%-0%殘?zhí)牵?當發(fā)酵罐數量為5個時，該五級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?75%-60%殘?zhí)牵蝗墸?5%-40%殘?zhí)?；四級?5%-20%殘?zhí)牵晃寮墸?5%-0%殘?zhí)牵?當發(fā)酵罐數量為6個時，該六級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-90%殘?zhí)牵欢墸?80%-70%殘?zhí)?；三級?0%-60%殘?zhí)?；四級?0%-40%殘?zhí)?；五級?0%-20%殘?zhí)?；六級?5%-0% 殘?zhí)牵?當發(fā)酵罐數量為7個時，該七級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-90%殘?zhí)?；?級：80%-70%殘?zhí)?；三級?0%-60%殘?zhí)牵凰募墸?0%-45%殘?zhí)?；五級?5%-35%殘?zhí)牵涣墸?35%-15%殘?zhí)?；七級?5%-0%殘?zhí)恰?br> [0008] 作為優(yōu)選的是，第四步，所述氣體為體積比為1:1的〇)2和!12的混合氣、純C0 2或 純隊中的一種，通氣量為0.01-0.04 L/ (min*L)。
[0009] 作為優(yōu)選的是，第四步，一級發(fā)酵罐的初糖濃度為50- 150 g/L，各級發(fā)酵罐的補 糖速率為10-40 ml/h，發(fā)酵液流出速率為40-160 ml/h，發(fā)酵液流入速率為10-150 ml/h，細 胞回流速率10-50 ml/h。
[0010] 作為優(yōu)選的是，碳源補料罐培養(yǎng)液為葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液、糖蜜或 木質纖維素水解液中一種。
[0011] 作為優(yōu)選的是，第四步，pH通過加入碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鎂、氫氧化鈉、氫氧化鉀 或氫氧化鎂中的一種或多種來調節(jié)。
[0012] 有益效果 本發(fā)明利用多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法簡單，易操作，與現有發(fā)酵技術相比，丁二 酸的產量高，適合工業(yè)化操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為丁二酸標準品的高效液相色譜圖； 圖2為實施例1的發(fā)酵產物的高效液相色譜圖。

【具體實施方式】
[0014] 下面的實施例可使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明所說的多級連續(xù)發(fā)酵是根據串聯(lián)發(fā)酵罐的個數來定，如串聯(lián)三個發(fā)酵罐即 為三級連續(xù)發(fā)酵，其中第一個發(fā)酵罐為一級發(fā)酵罐，第二個發(fā)酵罐為二級發(fā)酵罐，第三個發(fā) 酵罐為三級發(fā)酵罐。
[0016] 實施例1 一種多級連續(xù)發(fā)酵裝置生產丁二酸的方法，包括以下步驟： 第一步，配種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補料罐培養(yǎng)液和培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液， 配方如下： 種子培養(yǎng)基（g · L_〇 :葡萄糖10 (分消），酵母膏5,玉米漿5, NaHC03 10, NaH2P04 · 2H20 9· 6, Κ2ΗΡ04 · 3H20 15. 5, pH 7· 0。
[0017] 初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g·!/1):葡萄糖40(分消），酵母膏10,玉米漿10,乙酸鈉1.36， ΚΗ2Ρ04 3, MgCl2 · 6H20 0· 2, CaCl2 0· 2, NaCl 1，Na2HP04 · 12H20 0· 31，NaH2P04 · 2H20 1. 6， pH 7. 0。
[0018] 碳源補料罐培養(yǎng)液（g · L_〇 :葡萄糖750。
[0019] 培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液（g · Γ1):酵母膏30,玉米漿30,乙酸鈉4. 08, ΚΗ2Ρ04 9， MgCl2 · 6H20 0· 6, CaCl2 0· 6, NaCl 3, Na2HP04 · 12H20 0· 93, NaH2P04 · 2H20 4. 8, pH 7. 0。
[0020] 第二步，取五個1L發(fā)酵罐、碳源補料罐、培養(yǎng)基補料罐、種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培 養(yǎng)基、碳源補料罐培養(yǎng)液、培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液以及l(fā)〇〇ml的血清瓶在121°C下滅菌15分 鐘，備用； 第三步，取滅菌后的血清瓶，接入20ml的種子培養(yǎng)基，通入C02，再接入產琥珀酸放線 桿菌NJ113,搖床37°C轉速為180 rpm下培養(yǎng)10小時，作為發(fā)酵菌種； 第四步，將五個滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入600ml的初始發(fā)酵培養(yǎng) 基，通入體積比為1:1的C02和H2混合氣，利用儲氣罐控制通氣量為0. 02 L/(min*L)，按照 接種量為1〇%(ν/ν)接入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐流入二級、三級直到五級， 利用碳源補料罐和培養(yǎng)基補料罐控制發(fā)酵液流入速率20-30ml/h，葡萄糖補糖速率為10-20 ml/h，發(fā)酵液流出速率為40-50 ml/h，使得一級發(fā)酵罐中初糖濃度為50g/L，在連續(xù)發(fā)酵過 程中各級發(fā)酵罐中糖濃度相對發(fā)酵初始糖濃度依次為一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?5%-60% 殘?zhí)?；三級?5%-40%殘?zhí)?；四級?5%-20%殘?zhí)牵晃寮墸?5%-0%殘?zhí)?，全程使用氫氧化鈉控制 pH為6. 5,發(fā)酵溫度：37°C，控制細胞回流速率10 ml/h，發(fā)酵120 h后，取發(fā)酵產物進行高 效液相色譜分析，并測定發(fā)酵產物的量。
[0021] 實施例2 第一步至第三步同實施例1，其中碳源補料罐培養(yǎng)液為200g/L蔗糖溶液。
[0022] 第四步，將五個滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入600ml的初始發(fā)酵 培養(yǎng)基，通入體積比為1:1的C0 2和H2混合氣，利用儲氣罐控制通氣量為0. OIL/ (min*L)， 按照接種量為10% (v/V)接入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐流入二級、三級直到 五級，利用碳源補料罐和培養(yǎng)基補料罐控制發(fā)酵液流入速率120-150 ml/h，蔗糖補糖速率 為30 ml/h，發(fā)酵液流出速率為150-160 ml/h，使得一級發(fā)酵罐中初糖濃度為150g/L，在連 續(xù)發(fā)酵過程中各級發(fā)酵罐中糖濃度相對發(fā)酵初始糖濃度依次為一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?75%-60%殘?zhí)牵蝗墸?5%-40%殘?zhí)?；四級?5%-20%殘?zhí)牵晃寮墸?5%-0%殘?zhí)?，全程使用氫?化鎂控制pH為6. 5,細胞回流速率50 ml/h，發(fā)酵120 h后，取發(fā)酵產物進行高效液相色譜 分析，并測定發(fā)酵產物的量。
[0023] 實施例3 第一步至第三步同實施例2。
[0024] 第四步，將五個滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入600ml的初始發(fā)酵 培養(yǎng)基，利用儲氣罐控制純N2,通氣量為0. 04 L/ (min*L)，按照接種量為10% (v/v)接入 發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐流入二級、三級直到五級，利用碳源補料罐和培養(yǎng) 基補料罐控制發(fā)酵液流入速率90-110 ml/h，蔗糖補糖速率為20 ml/h，發(fā)酵液流出速率為 110 -140ml/h，使得一級發(fā)酵罐中初糖濃度為80g/L，在連續(xù)發(fā)酵過程中各級發(fā)酵罐中糖濃 度相對發(fā)酵初始糖濃度依次為一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?5%-60%殘?zhí)?；三級?5%-40%殘 糖；四級：35%-20%殘?zhí)?；五級?5%-0%殘?zhí)牵淌褂锰妓徕c控制pH為6. 5,細胞回流速率 40 ml/h，發(fā)酵120 h后，取發(fā)酵產物進行高效液相色譜分析，并測定發(fā)酵產物的量。
[0025] 實施例4 第一步至第三步同實施例1，其中碳源補料罐培養(yǎng)液為淀粉糖化液。
[0026] 第四步，將五個滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入600ml的初始發(fā)酵 培養(yǎng)基，通入純N 2，利用儲氣罐控制通氣量為0. 01 L/ (min*L)，按照接種量為10% (v/v)接 入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐流入二級、三級直到五級，利用碳源補料罐和培 養(yǎng)基補料罐控制發(fā)酵液流入速率50-70 ml/h，淀粉糖化液補糖速率為30-40 ml/h，發(fā)酵液 流出速率為80-110 ml/h，使得一級發(fā)酵罐中初糖濃度為50g/L，在連續(xù)發(fā)酵過程中各級發(fā) 酵罐中糖濃度相對發(fā)酵初始糖濃度依次為一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?5%-60%殘?zhí)?；三級?55%-40%殘?zhí)牵凰募墸?5%-20%殘?zhí)?；五級?5%-0%殘?zhí)牵淌褂锰妓徕浐吞妓徭V混合控制 pH為6. 5,細胞回流速率30 ml/h，發(fā)酵120 h后，測定發(fā)酵產物的量。
[0027] 實施例5 第一步至第三步同實施例1，其中碳源補料罐培養(yǎng)液為糖蜜。
[0028] 第四步，將五個滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入600ml的初始發(fā)酵 培養(yǎng)基，通入純C0 2，利用儲氣罐控制通氣量為0. 02 L/ (min*L)，按照接種量為10% (v/v) 接入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐流入二級、三級直到五級，利用碳源補料罐和 培養(yǎng)基補料罐控制發(fā)酵液流入速率110-130 ml/h，糖蜜補糖速率為30-40 ml/h，發(fā)酵液流 出速率為140-160 ml/h，使得一級發(fā)酵罐中初糖濃度為50g/L，在連續(xù)發(fā)酵過程中各級發(fā) 酵罐中糖濃度相對發(fā)酵初始糖濃度依次為一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?5%-60%殘?zhí)?；三級?55%-40%殘?zhí)?；四級?5%-20%殘?zhí)?；五級?5%-0%殘?zhí)?，全程使用氫氧化鉀控制pH為6. 5， 細胞回流速率50 ml/h發(fā)酵120 h后，測定發(fā)酵產物的量。
[0029] 實施例6 第一步至第三步同實施例1，其中碳源補料罐培養(yǎng)液為木質纖維素水解液。
[0030] 第四步，將五個滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入600ml的初始發(fā)酵 培養(yǎng)基，通入純N 2，利用儲氣罐控制通氣量為0. 04 L/ (min*L)，按照接種量為10% (v/v)接 入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐流入二級、三級直到五級，利用碳源補料罐和培 養(yǎng)基補料罐控制發(fā)酵液流入速率120-130 ml/h，木質纖維素水解液補糖速率為30-40 ml/ h，發(fā)酵液流出速率為150-160ml/h，使得一級發(fā)酵罐中初糖濃度為50g/L，在連續(xù)發(fā)酵過程 中各級發(fā)酵罐中糖濃度相對發(fā)酵初始糖濃度依次為一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?5%-60%殘 糖；三級：55%-40%殘?zhí)牵凰募墸?5%-20%殘?zhí)?；五級?5%-0%殘?zhí)?，全程使用碳酸鈉控制pH 為6. 5,細胞回流速率50 ml/h，發(fā)酵120 h后，測定發(fā)酵產物的量。
[0031] 對比例1 以目前文獻報道的連續(xù)發(fā)酵產丁二酸，以A 供《μ 130Z為出發(fā)菌株，采用單 級連續(xù)發(fā)酵的方式，控制葡萄糖糖濃度為20g/L，稀釋率為0. 2-1. 2, 丁二酸的最高濃度只 有 10. 4g/L。
[0032] 對比例2 以A swcciflici/Trot/wcefls ATCC No. 29305為出發(fā)菌株，采用單級連續(xù)發(fā)酵的方式， 控制乳糖濃度為20g/L，稀釋率為0. 03-0. 14, 丁二酸的最高濃度只有14. Og/L。
[0033] 將本發(fā)明的發(fā)酵產物進行液相色譜分析后，與丁二酸標準品的高效液相色譜圖對 t匕，確定本發(fā)明的發(fā)酵產物為丁二酸。與現有技術相比，本發(fā)明發(fā)酵生產丁二酸的產量高， 工藝簡單，適合規(guī)?；a發(fā)酵，其中表1為本發(fā)明不同實施例發(fā)酵得產物的量。
[0034] 表1本發(fā)明不同實施例發(fā)酵得產物的量

【權利要求】
1. 一種多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步驟： 第一步，配種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補料罐培養(yǎng)液和培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液； 第二步，對發(fā)酵罐、碳源補料罐、培養(yǎng)基補料罐、種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源補 料罐培養(yǎng)液、培養(yǎng)基補料罐培養(yǎng)液以及血清瓶進行滅菌處理； 第三步，取滅菌后的血清瓶，接入滅菌后的種子培養(yǎng)基，通入co2后再接入產琥珀酸放 線桿菌)NJ113搖床培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種； 第四步，多級連續(xù)發(fā)酵，將滅菌后的發(fā)酵罐串聯(lián)后，在一級發(fā)酵罐中接入初始發(fā)酵培養(yǎng) 基，通入氣體，再按照接種量體積比為3-10%接入發(fā)酵菌種，初始發(fā)酵培養(yǎng)基從一級發(fā)酵罐 流入二級發(fā)酵罐、三級發(fā)酵罐，依次流到最后一級發(fā)酵罐中，通過調節(jié)通氣量、一級發(fā)酵罐 的初糖濃度、各級發(fā)酵罐的補糖速率、發(fā)酵液流出速率和發(fā)酵液流入速率控制各級發(fā)酵罐 內的糖濃度，通過控制各級發(fā)酵罐中細胞生物量和細胞回流速率來完成丁二酸的發(fā)酵，發(fā) 酵全程pH為6. 5-7. 5,溫度為35-40°C進行50-750h。
2. 根據權利要求1所述多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于： 當發(fā)酵罐數量為3個時，該三級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：90%-80%殘?zhí)?；二級?60%-45%殘?zhí)?；三級?5%-0%殘?zhí)牵? 當發(fā)酵罐數量為4個時，該四級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?70%-55%殘?zhí)牵蝗墸?0%-25%殘?zhí)?；四級?5%-0%殘?zhí)牵? 當發(fā)酵罐數量為5個時，該五級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-85%殘?zhí)?；二級?75%-60%殘?zhí)?；三級?5%-40%殘?zhí)?；四級?5%-20%殘?zhí)?；五級?5%-0%殘?zhí)牵? 當發(fā)酵罐數量為6個時，該六級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-90%殘?zhí)?；二級?80%-70%殘?zhí)牵蝗墸?0%-60%殘?zhí)?；四級?0%-40%殘?zhí)?；五級?0%-20%殘?zhí)牵涣墸?5%-0% 殘?zhí)牵? 當發(fā)酵罐數量為7個時，該七級發(fā)酵罐各級罐內糖濃度為：一級：95%-90%殘?zhí)牵欢?級：80%-70%殘?zhí)?；三級?0%-60%殘?zhí)牵凰募墸?0%-45%殘?zhí)?；五級?5%-35%殘?zhí)牵涣墸?35%-15%殘?zhí)?；七級?5%-0%殘?zhí)恰?br> 3. 根據權利要求1所述多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于：第四步，所述氣 體為體積比為1:1的〇)2和!1 2的混合氣、純C02或純隊中的一種，通氣量為0.01-0.04L/ (min*L)〇
4. 根據權利要求1所述多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于：第四步，一級發(fā) 酵罐的初糖濃度為50- 150 g/L，各級發(fā)酵罐的補糖速率為10-40 ml/h，發(fā)酵液流出速率為 40-160 ml/h，發(fā)酵液流入速率為10-150 ml/h，細胞回流速率10-50 ml/h。
5. 根據權利要求1所述多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于：碳源補料罐培 養(yǎng)液為葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液、糖蜜或木質纖維素水解液中一種。
6. 根據權利要求1所述多級連續(xù)發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于：第四步，pH通過 加入碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鎂、氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鎂中的一種或多種來調節(jié)。
【文檔編號】C12R1/01GK104152497SQ201410459744
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權日:2014年9月11日
【發(fā)明者】陳可泉, 王震, 何珣, 肖文, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學