專利名稱：一種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白、編碼基因、表達(dá)載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬胸膜肺炎放線桿菌，尤其是一種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜
蛋白、編碼基因、表達(dá)載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae ， APP)引起豬傳染性胸 膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae ， PCP)，該病以肺出血、壞死和纖維素性
滲出為主要病變的接觸性傳染病。PCP在世界各地廣泛流行，常常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損 失，是國際公認(rèn)的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的五大疾病之一。英國的Paffison于1957年首次報(bào) 道了該病，Maffliews和Paffison于1961年從阿根廷爆發(fā)豬傳染性胸膜肺炎的豬群中分 離到此菌，至20世紀(jì)80年代已在世界廣泛流行，且有逐年增長趨勢(shì)，近年來國際公 認(rèn)為危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一 (Nicolet J.Taxonomy and serological identification of Actinobacillus pleuropneumoniae[J].Can Vet J， 1988， 29 : 578-580。 APP是革蘭氏陰 性，有莢膜的多形性小球桿菌，在血液瓊脂平板上呈不透明扁平的圓形菌落，其大小為 1 1.5mm，周圍呈13溶血，用白金耳觸之有粘性感，金黃色葡萄球菌可增強(qiáng)其溶血性 (CAMP實(shí)驗(yàn)陽性)，兼性厭氧，無運(yùn)動(dòng)力，生長需要V因子。目前由于該病致病菌的血 清型多、分布地域廣，加上其易產(chǎn)生抗藥性及傳統(tǒng)的滅活疫苗來防治該病仍不是很成功 等原因給該病的防制工作帶來很大困難。 APP可產(chǎn)生多種毒力因子，如Apx、菌毛和LPS等。Apx是APP分泌的一類溶 血毒素，也是APP主要的毒力因子，不同菌株血清型毒力的強(qiáng)弱與Apx毒素種類有關(guān)。 目前，發(fā)現(xiàn)的APP的15個(gè)血清型共產(chǎn)生四種Apx， Apxl、 ApxII、 ApxIII、 ApxIV。 它 們都屬于RTX(repeating structure toxin， RTX)。四種毒素都具有CAMP效應(yīng)，即與金黃色 葡萄球菌共培養(yǎng)時(shí)，其溶血效應(yīng)會(huì)加強(qiáng)。不同APP血清型產(chǎn)生的毒素不同。其中產(chǎn)Apx I和ApxII毒素的血清型毒力最強(qiáng)。在APP的致病過程中Apx毒素的作用是溶解紅細(xì)胞， 還具有調(diào)節(jié)白細(xì)胞活性的功能。ApxII有較弱的溶血活性，它對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和嗜中性白 血球也具有細(xì)胞毒性作用，ApxIII毒素沒有溶血活性，但是它對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和嗜中性 白細(xì)胞毒性很強(qiáng)。Apx具有強(qiáng)免疫原性，業(yè)已有許多關(guān)于Apx作為疫苗潛在成分的研究 矛艮道。Zhang(Y.Zhang， J.M.Tennent, A.Ingham et al.Identification of type4 fimbriae in Actino bacilluspleuropneumoniae[J]FEMS Microbiol丄ett. 189(2000)15-18.)等人鑒定出血清1、 2、 7 及12型APP的完整菌毛及菌毛亞單位，其他血清型是否產(chǎn)生菌毛尚未見報(bào)道。許多革蘭 氏陰性菌的LPS在其發(fā)病過程中起重要作用細(xì)菌粘附宿主細(xì)胞后，感染的建立取決于細(xì) 菌獲得生長必需的營養(yǎng)的能力。在呼吸道內(nèi)，能獲得足夠的碳水化合物和其他養(yǎng)分受到 限制。這種能夠在宿主內(nèi)克服營養(yǎng)的限制是感染發(fā)病的前提，此外克服鐵離子限制是對(duì) 許多細(xì)菌至關(guān)重要的。APP表達(dá)許多涉及鐵離子攝取的蛋白因子，利用豬的鐵轉(zhuǎn)移蛋白 作為鐵的唯一來源。在鐵離子限制的條件下，APP可產(chǎn)生兩種結(jié)合鐵轉(zhuǎn)移蛋白的蛋白因子，TbpA和TpbB。 TbpA分子量約為100kDa，可能形成鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)通過外膜的跨膜通 道；TbpB是一個(gè)脂蛋白，分子量為60kDa左右，結(jié)合在外膜上；這兩個(gè)蛋白存在于細(xì)菌 表面，主要結(jié)合于豬鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C葉區(qū)。TbpA和TpbB的基因tpbA和tpbB已被克隆 出，與exbBD基因連鎖和共轉(zhuǎn)錄。ExbB和ExbD與TonB結(jié)合形成內(nèi)膜蛋白復(fù)合物，為 鐵離子跨越外膜提供能量。Tonpitak等證實(shí)ExbB和ExbD是APP攝取鐵所必需的。對(duì)含 溶血素和轉(zhuǎn)鐵蛋白亞單位疫苗的免疫功能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，含溶血素和轉(zhuǎn)鐵蛋白 結(jié)合蛋白亞單位疫苗對(duì)攻毒提供部分保護(hù)(Janine T.Boss6， H&k腿Janson， Brian J.Sheehan et al.Actinobacillus pleuropneumoniae : pathobiology andpathogenesis of infection[J].Microbes and Infection 4(2002)225-235)。因此，對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌的研究，有助于進(jìn)一步了解 該病的發(fā)病機(jī)制，可更好的診斷并預(yù)防此病，具有十分重要的意義。 豬胸膜肺炎放線桿菌對(duì)培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，培養(yǎng)相對(duì)困難，因此通過成熟的基 因工程方法表達(dá)豬胸膜肺炎放線桿菌的天然抗原作為疫苗或檢測(cè)試劑成為越來越多的 選擇。胸膜肺炎放線桿菌一種外膜蛋白(OMPl)是APP重要的毒力因子。OMPl基 因全長1395bp，編碼1395核甘酸，共編碼465個(gè)氨基酸。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋 白含有23氨基酸的信號(hào)肽分析結(jié)果見圖1，預(yù)計(jì)成熟的蛋白分子量為48.766KD。 (H van den Bosch， J Frey Interference of outer membrane protein PalA with protective immunity against Actinobacillus pleuropneumoniae infections in vaccinated pigs Vaccine, 2003 V21， Issues25-26， 8， 3601-3607)本研究顯示OMP1具有一定的免疫原性，可介導(dǎo)保護(hù)性免疫 反應(yīng)。目前，國內(nèi)還沒有該蛋白的商品化產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種可以得到較高的表達(dá)產(chǎn)物收獲率，并 具有較好的抗原性的豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白、編碼基因、表達(dá)載體及其制 備方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種豬胸膜肺炎放線桿菌 的重組外膜蛋白，具有00或的重組外膜蛋白 [OOO7](a)由SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具免疫活 性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。 所述的豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之
(l)SEQ NO.l所示的DNA序列； (2)SEQN0.1限定的DNA序列具有90X以上的同源性，且編碼相同功能的蛋白 質(zhì)的DNA系列。 含有上述的基因表達(dá)載體。 —種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白的制備方法，包括以下步驟擴(kuò)增 SEQ NO.l中的基因；將目的片段與載體相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌；誘導(dǎo)表達(dá)目的得到目的蛋 白；重組蛋白的純化與復(fù)性。擴(kuò)增序列外膜基因所用的引物是，上游引物5' TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG3，，下游引物；5， -CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3，;得
到目的片段與載體pET15b經(jīng)酶切后連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)入表達(dá)型 菌體(BL21(DE3);挑取陽性菌落，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白；收集誘導(dǎo)的菌體經(jīng) 超聲波裂解后經(jīng)過Talon試劑盒純化，儲(chǔ)存8M的尿素中。本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明提供的基因，可以得到較高的表達(dá)產(chǎn)物收獲 率，每100mlLB培養(yǎng)基可收獲重組蛋白13mg，該重組蛋白具有較好的抗原性。因此， 利用該重組蛋白作為抗原，可以建立APP免疫診斷方法，或制備有效的亞單位疫苗。


圖1為豬胸膜肺炎放線桿菌0MP1的蛋白Western blot結(jié)果。 圖2為本發(fā)明豬胸膜肺炎放線桿菌0MP1的蛋白誘導(dǎo)純化結(jié)果(l :蛋白maker，
2:誘導(dǎo)全菌，3:未誘導(dǎo)的全菌，4和5:純化復(fù)性的蛋白)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明 本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌的一種外膜蛋白(0MP1)，是具有SEQ N0.2
氨基酸的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ N0.2的氨基酸或者將SEQ N0.2的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)
或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ N0.2的氨基酸殘基相同的活性的由SEQ
N0.2衍生的蛋白質(zhì)。豬胸膜肺炎放線桿菌7型菌的這種重組外膜蛋白編碼基因，是下列
核苷酸序列之一 1)序列表中的SEQ NO.l的DNA序列；2)與序列表中SEQ NO.l限定
的DNA序列具有90 %以上的同源性，且編碼相同功能的蛋白質(zhì)的DNA系列。 序列表中SEQ N0.2的蛋白質(zhì)是含有465個(gè)氨基酸殘基組成。 APP—個(gè)重組外膜蛋白(0MP1) APP0MP1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一； 1)序列表中的SEQ NO.l的DNA序列； 2)與序列表中SEQ NO.l限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且編碼相同 功能的蛋白質(zhì)的DNA系列. 序列表中SEQ NO.l編碼0MP1的基因由1738個(gè)核苷酸組成，其中1 69為信
號(hào)肽序列，70 1395為該基因的讀碼框。 制備APP重組0MP1，包括以下步驟 l)擴(kuò)增序列l(wèi)中的基因； 2)將目的片段與載體相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌； 3)誘導(dǎo)表達(dá)目的得到目的蛋白； 4)重組蛋白的純化與復(fù)性 擴(kuò)增序列外膜基因所用的引物是，上游引物5' TTACTCGAGGGACGGTTCGCT TGAACAAG3，，下游引物；5， -CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3，;得
到目的片段與載體pET15b經(jīng)酶切后連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)入表達(dá)型 菌體BL21(DE3);挑取陽性菌落，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白；收集誘導(dǎo)的菌體經(jīng)超 聲波裂解后經(jīng)過Talon試劑盒純化，儲(chǔ)存8M的尿素中。
實(shí)施例一、APPOMP1的制備
1主要材料 1.1菌株APP血清1型由Donahule教授提供，編號(hào)為ATCC33415(CCM5586)
1.2質(zhì)粒和感受態(tài) 原核表達(dá)載體pET15b由天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。
感受態(tài)DH5a和BL21(DE3)購自普博欣公司。
2.方法 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。2.1利用PCR方 法對(duì)豬胸膜肺炎0MP1基因SEQ NO.l中自5'端第70位到1395位核苷酸)進(jìn)行擴(kuò)增， 其中上游引物為5' TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG 3，含有XhoI酶切位點(diǎn) 引物，P2(5' -CCCGGATCCCTATCTTCTATATTTACCCGCC-3，)為3'引物，BamHI酶 切位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系TaqDNA0.5iU， 10 Xbuffer 5 y 1， 2.5mM的dNTP4 y 1，上下游引 物各2iU，提取的APP1基因組DNA2iU， 25mM CaC12 2 y 1，純水32.5iU，共50iU。
反應(yīng)條件94t:預(yù)變性3min， 92"C變性lmin， 57。C退火30s， 72"C延伸lmin 20s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min。
2.2表達(dá)重組0MP1菌株的構(gòu)建 由于PCR產(chǎn)物的兩端含有酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物及pET15b用Xhol和BamHI 酶切后回收，按載體與片段比為l : 3的比例進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
2.3重組質(zhì)粒的篩選與鑒定 挑轉(zhuǎn)化子若干個(gè)，在3mlLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h-16h，質(zhì)粒小抽提后經(jīng)1% 凝膠電泳，根據(jù)DNA分子量的大小，初步篩選陽性質(zhì)粒；取初步篩選的陽性質(zhì)粒進(jìn)行； XhoI和BamHI酶切，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析，進(jìn)一步篩選陽性質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒進(jìn) 行PCR反應(yīng)，比較PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物的大小。
2.4重組0MP1的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化在BL21(DE3)，在lmM IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，收 集菌體。然后擴(kuò)大培養(yǎng)。1000mlLB培養(yǎng)基(Amp濃度為100毫克/毫升)接種50ml過 夜培養(yǎng)的菌液，200r/m， 37"培養(yǎng)1.8h，至菌液濃度OD6。。0.7 0.8，加入IPTG至終濃度 lmM， 200r/m， 37tH秀導(dǎo)4h，離心收菌。
2.5表達(dá)蛋白的純化 用超聲波緩沖液(50mM的NaHJ04， 300mMNaCl)重懸菌體至適當(dāng)濃度，超聲 波裂解15分鐘，10秒間歇5秒，功率40%。采用Talon試劑盒提純?nèi)诤系鞍?，?M的尿素洗脫蛋白。純化的蛋白加等量1 倍上樣緩沖液IO(TC煮5min， SDS-PAGE電泳后染色觀察。
2.6重組0MP1的復(fù)性 將含有重組0MP1的緩沖液至6M的尿素的0.02MTris-Cl(pH8.0)的緩沖液透析6 個(gè)小時(shí)以上。 轉(zhuǎn)至4M的尿素的0.02MTris-Cl(pH8.0)的緩沖液透析6個(gè)小時(shí)以上。
轉(zhuǎn)至2M的尿素的0.02MTris-Cl(pH8.0)的緩沖液透析6個(gè)小時(shí)以上。
轉(zhuǎn)至0.02MTris-Cl(pH8.0)的緩沖液透析6個(gè)小時(shí)以上
3.收率 獲得的APP重組0MP1，生產(chǎn)量為1000mlLB培養(yǎng)基可獲得重組蛋白130mg。
該蛋白具有免疫學(xué)活性，可以剌激機(jī)體產(chǎn)生抗體，因此可以用于免疫診斷或免 疫預(yù)防。用純化的0MP1蛋白包被ELISA板，以制備的兔陽性血清為一抗(l : 100)， HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(l : 4000)，分析該融合蛋白的免疫原性。結(jié)果表明，純化的 0MP1蛋白與兔陽性血清反應(yīng)明顯，當(dāng)包被濃度為6iig/mL時(shí)，OD，皿值達(dá)2.7，隨著 包被濃度的降低，OD，皿值逐漸下降。同時(shí)，該蛋白與兔的陰性血清及空白對(duì)照反應(yīng)的 OD49。nm值則均在0.3以下，這說明該蛋白具有很好的免疫學(xué)活性。
實(shí)施例二
1.主要材料 —抗豬抗APP多克隆抗體，天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備制 備。 二抗HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG，購自西美杰公司
2.方法 實(shí)施例一所得的APP重組0MP1進(jìn)行10% SDS-PAGE， 230mA將凝膠上的蛋白
轉(zhuǎn)移至硝酸素纖維膜，膜經(jīng)過PBST漂洗后，用3XBSA封閉過夜，與一抗(l : IOO稀
釋)反應(yīng)2h， PBST充分漂洗后，與二抗(l : 4000稀釋)反應(yīng)2h， PBST充分漂洗后，
進(jìn)行顯色，其結(jié)果見圖2，說明表達(dá)的重組0MP1具有良好的抗原性。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)
人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤
飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。 序列表(SEQUENCE LISTING) <110>天津農(nóng)學(xué)院 <120>—種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白、編碼基因、表達(dá)載體及其制 備方法 <160>2<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1395
<212>DNA<213>豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1395)
<400>1atgaaacttt caaaattagc tttaacactc tccgttgtac ttgccttatc ggcttgttca 60
accacaaaat taagtgcgga cggttcgctt gaacaagcgc aggcgacata tcaacaatat 120
gaagaaatta ccaaacagtt ccaaattaat gagcaatggt ggcaaggtta taatgacagc 180
cagttaaatt cgttagttga gcaagcgatt gccaataact tggatttagc taaaagcgcc 240 attgcagtaa accgagcgct ttataatgcg aatttagtcg gcgcgaatct agtaccgacg 300 tttagcggat caggttcttc atctgcagcg aaaggtgtcg gttccacatc gaatcaaatt 360 tcaaccggca tatcgactat ttcacatacg gcaagtttta agttaagtta tacgcttgat 420 ttatggcaac gtttggctga tgcggcaagt gcggcggaat gggagcataa agctacggtt 480 gaagatttaa aagcgacacg tctttcatta ttaaattcgg tcgtttctac ttactaccaa 540 attgcttatt ataaagatgc catcgcagtg attgagcgta ccattaataa ttatcagcaa 600 atctcaacga ttttaaataa taaatatgcc gcaggtgcaa tcgatcgttt agcggtggaa 660 caagctcagc aggcaacatt aaacgcgcgt aatagtttaa tttcggagcg taccaatctt 720 aaaacggcag agcagacatt gcgtaatttg ttaaatttaa aaccgaatca agcgttacct 780 actcgttatc cgagtatttt aggtgttaaa ttgcaaggaa tcgatttaaa cgtaccggta 840 tcggcaatcg caaatcgccc ggatgttgta gcccgtttaa accgtttaca aagcgcattt 900 aaatcgctta ccgcaacaga aaaaagttgg ttcccgacag ttacgcttgg cggttcgatt 960 tcggcaagcg cctcaaaagt cgcaaatatt agcgataatc cggtcggtaa cggtgtgatt 1020 tcatttgatt taccgttttt agattggaat cgtgtgaaaa ataacgtgaa aatttccgag 1080 tcggattata tgacggcgaa attaaattat gaacagacgg tgaccagcgc attaaatgaa 1140 attgatcagc actactacgc ttatcaacaa tcactcagca gttatgcgac cctacaacaa 1200 gcatacgagc atgataaacg tatcagtaac tattataaaa atcgttatga acaaggcgta 1260 tccgagttcc gtgaatggat tagcgcacta aatacggaat taaattccca gctttctatt 1320 ttgaatcaga aatatatgat tctatcgaat gaaaatacgg tgtatcagtc tatggcgggt 1380 aaatatagaa gatag 1395 <210>2 <211>464 <212>PRT <213>豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) <400>2 Met Lys Leu Ser Lys Leu Ala Leu Thr Leu Ser Val Val Leu Ala Leu 15 10 15 Ser Ala Cys Ser Thr Thr Lys Leu Ser Ala Asp Gly Ser Leu Glu Gin 20 25 30 Ala Gin Ala Thr Tyr Gin Gin Tyr Glu Glu lie Thr Lys Gin Phe Gin 3540 45 lie Asn Glu Gin Trp Trp Gin Gly Tyr Asn Asp Ser Gin Leu Asn Ser 5055 60 Leu Val Glu Gin Ala lie Ala Asn Asn Leu Asp Leu Ala Lys Ser Ala 65 7075 80 lie Ala Val Asn Arg Ala Leu Tyr Asn Ala Asn Leu Val Gly Ala Asn 85 90 95 Leu Val Pro Thr Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ala Ala Lys Gly說明書
7/8頁
:0121] 100 105 110
:0122] Val Gly Ser Thr Ser Asn Gin lie Ser Thr Gly lie Ser Thr lie Ser
:0123] 115 120 125
.0124] His Thr Ala Ser Phe Lys Leu Ser Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Gin Arg
:0125] 130 135 140
:0126] Leu Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Glu Trp Glu His Lys Ala Thr Val
:0127] 145 150 155 160
:0128] Glu Asp Leu Lys Ala Thr Arg Leu Ser Leu Leu Asn Ser Val Val Ser
:0129] 165 170 175
:0130] Thr Tyr Tyr Gin lie Ala Tyr Tyr Lys Asp Ala lie Ala Val lie Glu
:0131] 180 185 190
:0132] Arg Thr lie Asn Asn Tyr Gin Gin lie Ser Thr lie Leu Asn Asn Lys
:0133] 195 200 205
:0134] Tyr Ala Ala Gly Ala lie Asp Arg Leu Ala Val Glu Gin Ala Gin Gin
:0135] 210 215 220
:0136] Ala Thr Leu Asn Ala Arg Asn Ser Leu lie Ser Glu Arg Thr Asn Leu
:0137] 225 230 235 240
.0138] Lys Thr Ala Glu Gin Thr Leu Arg Asn Leu Leu Asn Leu Lys Pro Asn
:0139] 245 250 255
:0140] Gin Ala Leu Pro Thr Arg Tyr Pro Ser lie Leu Gly Val Lys Leu Gin
:0141] 260 265 270
:0143] 275 280 285
:0144] Val Val Ala Arg Leu Asn Arg Leu Gin Ser Ala Phe Lys Ser Leu Thr
:0145] 290 295 300
:0146] Ala Thr Glu Lys Ser Trp Phe Pro Thr Val Thr Leu Gly Gly Ser lie
:0147] 305 310 315
:0148] Ser Ala Ser Ala Ser Lys Val Ala Asn lie Ser Asp Asn Pro Val Gly
:0149] 320 325 330 335
:0150] Asn Gly Val lie Ser Phe Asp Leu Pro Phe Leu Asp Trp Asn Arg Val
:0151] 340 345 350
:0152] Lys Asn Asn Val Lys lie Ser Glu Ser Asp Tyr Met Thr Ala Lys Leu
:0153] 355 360 365
:0154] Asn Tyr Glu Gin Thr Val Thr Ser Ala Leu Asn Glu lie Asp Gin His
:0155] 370 375 380
:0156] Tyr Tyr Ala Tyr Gin Gin Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Thr Leu Gin Gin
:0157] 385 390 395
.0158] Ala Tyr Glu His Asp Lys Arg lie Ser Asn Tyr Tyr Lys Asn Arg Tyr
:0159] 400 405 410 415
Glu Gin Gly Val Ser Glu Phe Arg Glu Trp lie Ser Ala Leu Asn Thr 420 425 430 Glu Leu Asn Ser Gin Leu Ser lie Leu Asn Gin Lys Tyr Met lie Leu 435 440 445 Ser Asn Glu Asn Thr Val Tyr Gin Ser Met Ala Gly Lys Tyr Arg Arg 450 455 460
權(quán)利要求
一種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白，其特征在于，具有(a)或(b)的重組外膜蛋白(a)由SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具免疫活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白的編碼基因，其特征在 于，是下列核苷酸序列之一(1) SEQ NO.l所示的DNA序列；(2) SEQN0.1限定的DNA序列具有90X以上的同源性，且編碼相同功能的蛋白質(zhì)的 DNA系列。
3. 含有權(quán)利要求2所述的基因表達(dá)載體。
4. 如權(quán)利要求1所述的豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白的制備方法，包括以下步驟擴(kuò)增SEQNO.l中的基因；將目的片段與載體相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌；誘導(dǎo)表達(dá)目的得到目的蛋白；重組蛋白的純化與復(fù)性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于擴(kuò)增序列外膜基因所用的引物是，上 游引物5' TTACTCGAGGGACGGTTCGCTTGAACAAG3，，下游引物；5， -CCCGGAT ￡￡CTATCTTCTATATTTACCCGCC-3，；得到目的片段與載體pET15b經(jīng)酶切后連接，轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)入表達(dá)型菌體BL21(DE3);挑取陽性菌落，經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白；收集誘導(dǎo)的菌體經(jīng)超聲波裂解后經(jīng)過Talon試劑盒純化，儲(chǔ)存8M 的尿素中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白、編碼基因、表達(dá)載體及其制備方法，具有(a)或(b)的重組外膜蛋白(a)由SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)在(a)中的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具免疫活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)SEQ NO.1所示的DNA序列；(2)SE QNO.1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且編碼相同功能的蛋白質(zhì)的DNA系列。利用本發(fā)明提供的基因，可以得到較高的表達(dá)產(chǎn)物收獲率，每100mlLB培養(yǎng)基可收獲重組蛋白13mg，該重組蛋白具有較好的抗原性。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101691396SQ20091007045
公開日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者劉燕霏, 張安國, 徐軍, 李本強(qiáng), 楊升, 楊建德, 楊百亮, 馬吉飛 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院