專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗腫瘤單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，尤其是一種抗腫瘤單克隆抗體 及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類(lèi)健康的重大疾病。惡性腫瘤成為我國(guó)居民第一死因，占死亡原因 20%以上，其中90%以上死于腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，與此同時(shí)，“癌譜”也發(fā)生了很大變化，乳腺癌、 大腸癌躍居惡性腫瘤發(fā)病前10位；胰腺癌、腎癌發(fā)病率上升顯著；胃癌、肝癌發(fā)病率居高不 下。目前我國(guó)癌癥病人的臨床治愈率普遍比發(fā)達(dá)國(guó)家低，其中抗轉(zhuǎn)移治療措施的缺乏是腫 瘤患者致死的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥區(qū)別于其他疾病的顯著特征，也是治療的難點(diǎn)。研究表明70% 以上的惡性腫瘤患者，在初次診斷時(shí)就已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。目前，90%以上的惡性腫瘤患者，死于 腫瘤的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移。“在腫瘤臨床學(xué)上有個(gè)重要指標(biāo)叫五年生存率，又叫臨床治愈率，是指 經(jīng)過(guò)治療后五年內(nèi)，如果沒(méi)有再發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移灶、復(fù)發(fā)灶，就視為臨床治愈；之后，腫瘤復(fù) 發(fā)、轉(zhuǎn)移概率降到10%以下，基本上可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期生存。目前，我國(guó)腫瘤病人五年生存率僅為 10%?，F(xiàn)在常見(jiàn)治療腫瘤的方法以放/化療、介入、手術(shù)切除為主。所謂放療是以放射性的物質(zhì)如鐳、鈷、所放射出來(lái)的放射線進(jìn)行照射腫瘤達(dá)到治 療的效果。雖然達(dá)到了殺死腫瘤細(xì)胞的目的，但是正常的免疫細(xì)胞也一同被殺死了。由于 放射線的破壞，病人的血象改變、骨髓肌體受到損傷、白細(xì)胞和血小板減少，嚴(yán)重的甚至導(dǎo) 致敗血癥；口腔黏膜潰瘍；唾液腺萎縮，口干難忍；甚至發(fā)生放射形肺炎、充血和水腫，所有 這些的損傷很可能是終身性的；化療則是把“化學(xué)藥物”注入體內(nèi)用以毒死癌細(xì)胞。這類(lèi)化 學(xué)藥物對(duì)人身體的損傷是相當(dāng)明顯的，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)人體正常細(xì)胞同樣帶來(lái)嚴(yán) 重的損傷，造成骨髓造血功能的嚴(yán)重抑制，嚴(yán)重殺傷體內(nèi)的免疫細(xì)胞，造成白細(xì)胞、紅細(xì)胞 和血小板的嚴(yán)重降低，免疫力十分低下，患者身體素質(zhì)極度虛弱，對(duì)胃腸黏膜細(xì)胞的嚴(yán)重抑 制，嚴(yán)重的打擊了消化功能，胃腸道出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，患者最突出的表現(xiàn)是惡心、嘔吐、食 欲不振等。所有這些藥物都必需經(jīng)過(guò)內(nèi)臟的分解，同樣在不同程度地對(duì)肝臟、腎臟等重要臟 器帶來(lái)?yè)p害。此外，放/化療也可以引起脫發(fā)、皮膚損害等，給患者心理、生活造成極大的壓 力和影響。介入化療的毒副作用現(xiàn)已被公認(rèn)，在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也大量殺滅了人體的正常 免疫細(xì)胞，介入后帶來(lái)的各種副作用給患者的身體造成的痛苦幾乎難以想像高燒、抽搐、 渾身無(wú)力、身體消瘦，胃腸的消化吸收功能?chē)?yán)重不良，最終導(dǎo)致結(jié)果是患者的健康每況愈
下。臺(tái)灣國(guó)家衛(wèi)生研究院的報(bào)告說(shuō)明“......因此治療以全身性的化學(xué)藥物療法為主，有
八成以上的反應(yīng)率?？上У氖墙?jīng)治療緩解后，大多數(shù)病例在兩年內(nèi)會(huì)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后即對(duì)治
療發(fā)生抗性......”。在診斷時(shí)可經(jīng)開(kāi)刀的早期病例僅約四分之一，而可切除的病例不過(guò)
15-18%，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的機(jī)率甚高，而不能開(kāi)刀的病例對(duì)化學(xué)藥物及放射線治療大多不敏感，由于上述原因，肺癌病人的預(yù)后不佳。整體而言，5年的存活率僅約10%。綜上所述，當(dāng)癌癥患者的身體受到癌細(xì)胞侵襲后，在身體素質(zhì)下降的情況下，又受 到放化療介入治療的破壞，身體已經(jīng)不可能在短期內(nèi)恢復(fù)健康狀態(tài)就又承受第二次治療， 毒副作用在體內(nèi)倍增，病人的健康每況愈下，最后的結(jié)果就只能是“瘤消人亡”了。這種機(jī) 體與癌癥同消的做法，與自殺沒(méi)有什么兩樣。目前國(guó)際上普遍使用的一些抗腫瘤藥物雖然有一定的療效，但副作用較多，表現(xiàn) 在高熱、寒戰(zhàn)、頭痛、關(guān)節(jié)痛、食欲不振、惡心嘔吐、腹痛腹瀉，貧血、過(guò)敏、肝臟損害等多方 面，且價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種抗腫瘤單克隆抗體。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供產(chǎn)生上述抗腫瘤單克隆抗體的淋巴細(xì) 胞雜交瘤。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供產(chǎn)生上述抗腫瘤單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供產(chǎn)生上述抗腫瘤單克隆抗體的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種抗腫瘤單克隆抗體，所述抗體的氨基酸序列為DPNVKTATKPMAKYTKSCVV。優(yōu)選的，上述抗腫瘤單克隆抗體，球蛋白，直徑7-8nm，帶糖鏈，有beta 1，4糖苷鍵 特異性并可被Schiff’ s試劑染色，分子量45kDa，沒(méi)有4級(jí)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，上述抗腫瘤單克隆抗體，等電點(diǎn)6. 7、溫度58度以上失活、pH :6_8內(nèi)穩(wěn) 定、金屬離子Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Co2+離子對(duì)抗體有不同程度的抑制作用，而且大多 數(shù)表現(xiàn)為離子濃度越大抑制作用越強(qiáng)，其中Fe3+and Mn2+在濃度3-12nM時(shí)候會(huì)使其失活； Na+、K+、Ca2+、Mg2+金屬激活酶中的金屬離子對(duì)抗體的激活作用也并不顯著。上述抗腫瘤單克隆抗體的制備方法，骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合，形成 能分泌針對(duì)該抗原的均質(zhì)的高特異性的抗體——單克隆抗體，這種技術(shù)通稱(chēng)為雜交瘤技 術(shù)。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代，而脾細(xì)胞是終末 細(xì)胞，不能在體外繁殖。如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌某種抗體或因子的淋巴細(xì)胞融合，則 融合細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的特性，又具有淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體或因子的能 力，同時(shí)也克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外繁殖的缺點(diǎn)，融合的細(xì)胞稱(chēng)為淋巴細(xì)胞雜交瘤， 從雜交瘤細(xì)胞上清液中或或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體，具體包 括(1)將目的基因和畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建目的基因表達(dá)載體根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)目的基因進(jìn)行必要的修飾改造，以使其適應(yīng)畢赤 酵母的表達(dá)，選取適當(dāng)?shù)漠叧嘟湍副磉_(dá)質(zhì)粒和經(jīng)過(guò)改造后的目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接， 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。(2)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆擴(kuò)增將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并對(duì)重組子進(jìn)行篩選和鑒定(3)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)
從重組大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，獲得 重組畢赤酵母工程菌。通過(guò)平板法和PCR法對(duì)工程菌進(jìn)行表型鑒定。對(duì)畢赤酵母進(jìn)行甲醇 誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析，并篩選出高表達(dá)菌株。(4)對(duì)畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究在搖瓶水平上對(duì)畢赤酵母工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)5L發(fā)酵罐進(jìn)行放 大培養(yǎng)研究(5)粗提樣品制備發(fā)酵液-SOOOrpm/15min離心取上清-硫酸銨60%飽和度聚 沉-對(duì)PBS透析(6)親和層析柱制備將制備的單克隆抗體連接在用溴化腈活化后的 SepharoseCL-4B 上(7)將粗提樣品過(guò)親和層析柱，洗脫雜蛋白后換用可剪切糖苷鍵的洗脫液獲取目 的蛋白(8)目的蛋白檢測(cè)上述抗腫瘤單克隆抗體作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。優(yōu)選的，上述抗腫瘤單克隆抗體作為制備抗乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或 結(jié)腸癌細(xì)胞的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是上述抗腫瘤單克隆抗體對(duì)乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 均有不同程度的抑制，且對(duì)人體的正常細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，具有特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞， 并誘導(dǎo)其凋亡而對(duì)正常細(xì)胞并無(wú)毒副作用的優(yōu)越性。


圖1為利用免疫熒光法檢測(cè)被此活性蛋白誘導(dǎo)致凋亡的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7所 表達(dá)的凋亡蛋白CASPASE-3的情況；圖 2 為=Collagen gel Droplet Drug Sensitivity Test 法檢測(cè)乳腺癌病人原代 細(xì)胞對(duì)活性蛋白藥物的敏感性；圖3-1為小鼠肝癌、乳腺癌、白血病的實(shí)驗(yàn)治療目的蛋白檢測(cè)SDS-PAGE圖譜；圖3-2為小鼠肝癌、乳腺癌、白血病的實(shí)驗(yàn)治療目的蛋白檢測(cè)HPLC圖譜；
具體實(shí)施例方式下面對(duì)發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1一種抗腫瘤單克隆抗體，通過(guò)對(duì)該蛋白N端和C端的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)并合成出相應(yīng) 的探針從采用SMART技術(shù)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中篩選出編碼該蛋白的基因，經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)行密 碼子偏愛(ài)性以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)的改造，將tbl基因和pPIC9載體相連接構(gòu)建pPIC9-tbl 表達(dá)載體，將此表達(dá)載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)入GS115畢赤酵母表達(dá)宿主菌，構(gòu)建重組畢 赤酵母工程菌，將其在畢赤酵母中表達(dá)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化確定甘油添加量為4%，YNB 添加量為1. 25%，培養(yǎng)基pH6. 0，甲醇誘導(dǎo)濃度1%，發(fā)酵時(shí)間84h的最佳發(fā)酵條件，具體包 括
(1)將目的基因和畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建目的基因表達(dá)載體根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)目的基因進(jìn)行必要的修飾改造，以使其適應(yīng)畢赤 酵母的表達(dá)，選取適當(dāng)?shù)漠叧嘟湍副磉_(dá)質(zhì)粒和經(jīng)過(guò)改造后的目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接， 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。(2)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆擴(kuò)增將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并對(duì)重組子進(jìn)行篩選和鑒定(3)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)從重組大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，獲得 重組畢赤酵母工程菌。通過(guò)平板法和PCR法對(duì)工程菌進(jìn)行表型鑒定。對(duì)畢赤酵母進(jìn)行甲醇 誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析，并篩選出高表達(dá)菌株。(4)對(duì)畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究在搖瓶水平上對(duì)畢赤酵母工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)5L發(fā)酵罐進(jìn)行放 大培養(yǎng)研究(5)粗提樣品制備發(fā)酵液-SOOOrpm/15min離心取上清-硫酸銨60%飽和度聚 沉-對(duì)PBS透析(6)親和層析柱制備將制備的單克隆抗體連接在用溴化腈活化后的 SepharoseCL-4B 上(7)將粗提樣品過(guò)親和層析柱，洗脫雜蛋白后換用可剪切糖苷鍵的洗脫液獲取目 的蛋白(8)目的蛋白檢測(cè)所述抗體的氨基酸序列為DPNVKTATKPMAKYTKSCVV，為球蛋白，直徑7_8nm，帶糖 鏈，有beta 1，4糖苷鍵特異性并可被Schiff’ s試劑染色，分子量45kDa，沒(méi)有4級(jí)結(jié)構(gòu)； 等電點(diǎn)6. 7、溫度58度以上失活、pH 6-8內(nèi)穩(wěn)定、金屬離子Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Co2+ 離子對(duì)抗體有不同程度的抑制作用，而且大多數(shù)表現(xiàn)為離子濃度越大抑制作用越強(qiáng)，其中 Fe 3+and Mn2+在濃度3_12nM時(shí)候會(huì)使其失活；Na+、K+、Ca2+、Mg2+金屬激活酶中的金屬 離子對(duì)抗體的激活作用也并不顯著。實(shí)施例2如圖1所示，在和順鉬以及5-氟尿嘧啶組的對(duì)比試驗(yàn)中得出tb-Ι蛋白對(duì)人乳腺 癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。利用免疫熒光法檢測(cè)被此活性蛋白誘導(dǎo)致凋亡的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7所表達(dá)的 凋亡蛋白CASPASE-3的情況。(實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)天津腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室)酶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如下Protocol =Unnamed Date Run :星期五乂V月 15，200812 54:20Ρ· Μ· Endpoint Read Test Wavelength :405Endpoint Read Test Wavelength 4052345678
A
B0.0680.1330.1950.3340.6761.1830.12
C0.0740.1410.20.3610.6921.2750.132
D0.0670.1440.1820.330.661.0810.122
E產(chǎn)生的CASPASE-3和表品濃度對(duì)比0. 069 0. 139 0. 192333 0. 341667 0. 676 1. 179667 0. 12450102050 100200 7. 394如圖2 所示，Collagen gel Droplet Drug Sensitivity Test 法檢測(cè)乳腺癌病人 原代細(xì)胞對(duì)此活性蛋白藥物的敏感性。(實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)天津腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室藥敏檢 測(cè)室)A.腫瘤細(xì)胞來(lái)源天津腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室手術(shù)采樣的鮮活組織B.給藥時(shí)間24hC.抑制率32%Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，相當(dāng)于線蟲(chóng)中的ced-3，這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋 亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號(hào)途徑激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。 它們均有以下特點(diǎn)①酶活性依賴(lài)于半胱氨酸殘基的親核性；②總是在天冬氨酸之后切斷 底物，所以命名為caspase (cysteine aspartate-specific protease),方便起見(jiàn)本文稱(chēng)之 為凋亡酶；③都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切 割后產(chǎn)生兩個(gè)活性亞基。本實(shí)驗(yàn)得出CASPASE-3產(chǎn)生的濃度為7. 394微摩爾。結(jié)果是反應(yīng)40分鐘后得到 的，比規(guī)定的時(shí)間(1-多個(gè)小時(shí))快許多，可以肯定如果適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或增加濃度可以 得到更深的顏色。顯示tb-Ι蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。此外，還可以利用TOSTERN-BLOTTING檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7受到此活性蛋白誘 導(dǎo)致凋亡后所表達(dá)的凋亡蛋白BCL-2的情況。體內(nèi)抗腫瘤活性結(jié)果(實(shí)驗(yàn)單位天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. MTD 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及條件(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明，二級(jí)，雌雄各半，6-8周齡，20_22g，天津動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。(2)受試物T1、B蛋白(3)實(shí)驗(yàn)條件①實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)天津動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心②飼養(yǎng)條件動(dòng)物由獲得資格認(rèn)證的專(zhuān)業(yè)人員飼養(yǎng)，室溫25 士 5 °C，濕度 50 士 20 %，每天清潔飼養(yǎng)籠一次。③檢疫過(guò)程動(dòng)物到達(dá)后檢疫三天，觀察動(dòng)物的疾病和死亡指征，如無(wú)異常方可用 于實(shí)驗(yàn)。④飼料及飲用水以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，從動(dòng)物到達(dá)至研究結(jié)束自由攝食。用飲水瓶供 應(yīng)自來(lái)水，由動(dòng)物自由飲用，每日沖洗水瓶并換水。實(shí)驗(yàn)方法(1)藥物配制以緩沖液溶解蛋白，濃度lg/mL為最高極限濃度。
(2)給藥途徑及劑量以小鼠能承受的最大胃容積0. 4mL/10g灌胃一次。(3)實(shí)驗(yàn)方法參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《中藥新藥研究的技術(shù)要求》中“最大耐受量(MTD) 的測(cè)定”的相關(guān)要求，用昆明小鼠60只，18-22g，雌雄各半。正常飼養(yǎng)觀察3天后如無(wú)異常， 禁食(不禁水)12小時(shí)后，分別取60只各分為3組，20只/組，雌雄各半。以?xún)煞N受試物 混懸液的最大濃度和動(dòng)物可承受的最大胃容積一次性口服給藥?？瞻讓?duì)照組，給予灌胃相 同體積的生理鹽水。此后每日觀察連續(xù)十四日，逐天詳細(xì)記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)，觀察指標(biāo)為體 重、攝食量、行為活動(dòng)等共九項(xiàng)。2.小鼠肝癌、乳腺癌、白血病的實(shí)驗(yàn)治療實(shí)驗(yàn)材料及條件(以肝癌細(xì)胞H-22為例)(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明，二級(jí)，18_22g，雌、雄各半，天津動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。(2)瘤株小鼠肝癌H-22，天津動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。(3)實(shí)驗(yàn)條件①實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)天津動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心②飼養(yǎng)條件動(dòng)物由獲得資格認(rèn)證的專(zhuān)業(yè)人員飼養(yǎng)，室溫25 士 2 °C，濕度 50 士 10 %，每天清潔飼養(yǎng)籠一次。③檢疫過(guò)程動(dòng)物到達(dá)后檢疫三天，觀察動(dòng)物的疾病和死亡指征，如無(wú)異常方可用 于實(shí)驗(yàn)。④飼料及飲用水以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，從動(dòng)物到達(dá)至研究結(jié)束自由攝食。用飲水瓶供 應(yīng)自來(lái)水，由動(dòng)物自由飲用，每日沖洗水瓶并換水。(4)受試物T1蛋白，由天津南華生物科技有限公司提供實(shí)驗(yàn)方法(1)劑量設(shè)置受試物組參照小鼠一次口服MTD實(shí)驗(yàn)結(jié)果，受試物按劑量分為高、中、低g/kg。(2)給藥途徑靜脈注射。(3)實(shí)驗(yàn)方法參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《中藥新藥研究的技術(shù)要求》中“治療惡性腫瘤中藥 的藥效學(xué)研究”的有關(guān)要求，及徐叔云等主編《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第60章“動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩 選法”中相關(guān)方法。取昆明小鼠70只，同一性別，19-21g，常規(guī)腋下接種小鼠肝癌H-22后隨 機(jī)分組，10只/組，共7組。其中受試物6個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別按給藥種類(lèi)不同分別設(shè)為相應(yīng)高、 中、低三組，同時(shí)設(shè)單純對(duì)照組。接種次日開(kāi)始給藥，1次/天，共10次，末次給藥后次日處 死動(dòng)物稱(chēng)體重，剝?nèi)∧[瘤稱(chēng)瘤重，按公式[(對(duì)照組平均瘤重_實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/對(duì)照組 平均瘤重]X 100%，計(jì)算腫瘤抑制率，并以t檢驗(yàn)對(duì)瘤重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。上述實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的急性毒理實(shí)驗(yàn)步驟得知，天津南華生物科技投資發(fā)展有限公司產(chǎn)品對(duì) 昆明小鼠不存在明顯的毒性。如圖3-1、圖3-2所示，該重組基因工程菌表達(dá)活性蛋白經(jīng)過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)表明，它對(duì)乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制(詳見(jiàn)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果)；在CD-DST實(shí)驗(yàn)中，該活性蛋白在24小時(shí)之內(nèi)，對(duì)包埋凝膠中的元代人乳腺癌細(xì) 胞的生長(zhǎng)具有良好的抑制作用。尤其值得注意的是，在使用HLF及其他人正常細(xì)胞作為對(duì) 照組的實(shí)驗(yàn)條件下，此蛋白藥物并未像其他傳統(tǒng)化療藥物一樣顯現(xiàn)出明顯的抑制作用，從 一個(gè)側(cè)面表明了其特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并誘導(dǎo)其凋亡而對(duì)正常細(xì)胞并無(wú)毒副作用的優(yōu)越 性。為了確定此蛋白的結(jié)構(gòu)，做了 SDS-PAGE、2DIMENTIONAL PAGE、糖基化位點(diǎn)的測(cè)定、 圓二色譜、AFM顯微成像等實(shí)驗(yàn)，揭示了導(dǎo)致其特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面糖鏈并因此改變腫 瘤細(xì)胞膜通透性，最終誘導(dǎo)其凋亡的結(jié)構(gòu)依據(jù)。序列表<110> 陸建新<120> 一種抗腫瘤單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用<160>20<170>PatentIn version 3.3<212>PRT<223>抗腫瘤單克隆抗體的氨基酸序列<400>DPNVKTATKPMAKYTKSCVV
權(quán)利要求
一種抗腫瘤單克隆抗體，其特征在于所述抗體的氨基酸序列為DPNVKTATKPMAKYTKSCVV。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤單克隆抗體，其特征在于為一種球蛋白，直徑 7-8nm，帶糖鏈，有beta 1，4糖苷鍵特異性并可被Schiff，s試劑染色，分子量45kDa，沒(méi)有 4級(jí)結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤單克隆抗體，其特征在于等電點(diǎn)6.7、溫度58 度以上失活、pH:6-8內(nèi)穩(wěn)定、金屬離子Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Co2+離子對(duì)抗體有不同程 度的抑制作用。
4.權(quán)利要求1-3所述的一種抗腫瘤單克隆抗體的制備方法，其特征在于具體包括(1)將目的基因和畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建目的基因表達(dá)載體；(2)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆擴(kuò)增；(3)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(4)對(duì)畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究；(5)粗提樣品制備；(6)親和層析柱制備；(7)將粗提樣品過(guò)親和層析柱；(8)目的蛋白檢測(cè)。
5.權(quán)利要求1-3所述的一種抗腫瘤單克隆抗體為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗腫瘤單克隆抗體作為制備抗乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì) 胞、肝癌細(xì)胞或結(jié)腸癌細(xì)胞的藥物的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤單克隆抗體，所述抗體的氨基酸序列為DPNVKTATKPMAKYTKSCVV，為球蛋白，直徑7-8nm，帶糖鏈，有beta 1，4糖苷鍵特異性并可被Schiff’s試劑染色，分子量45kDa，沒(méi)有4級(jí)結(jié)構(gòu)；所述抗腫瘤單克隆抗體對(duì)乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制，且對(duì)人體的正常細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，具有特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并誘導(dǎo)其凋亡而對(duì)正常細(xì)胞并無(wú)毒副作用的優(yōu)越性。
文檔編號(hào)C12P21/08GK101993493SQ200910070128
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者陸建新 申請(qǐng)人:陸建新