專(zhuān)利名稱(chēng)：一種精子蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程、細(xì)胞工程和腫瘤的免疫診斷領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，該抗體能特異識(shí)別一種腫瘤相關(guān)抗原，該抗原是一種正常情況下在睪丸和精子中表達(dá)、但在某些惡性腫瘤組織中異常出現(xiàn)的精子蛋白；本發(fā)明還涉及該蛋白特異性單克隆抗體的制備方法及該單克隆抗體在制備惡性腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
與正常組織相比，腫瘤細(xì)胞經(jīng)常發(fā)生基因的異常表達(dá)，產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原。這些抗原可以作為診斷腫瘤分子標(biāo)志物，或可以用作腫瘤生物治療的靶分子。為人熟知的腫瘤相關(guān)抗原如甲胎蛋白。近年在各種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)多種正常睪丸蛋白的表達(dá)[1]，并將這些蛋白歸屬為一類(lèi)新的腫瘤相關(guān)抗原，統(tǒng)稱(chēng)為癌瘤-睪丸(cancer-testis，CT)抗原。CT抗原具有如下特征(1)在男性成熟生殖細(xì)胞中高水平表達(dá)；(2)在正常體細(xì)胞中很少表達(dá)；(3)在多種類(lèi)型的腫瘤中異常表達(dá)。已知的CT抗原包括黑色素瘤抗原(MAGE，BAGE，GAGE)，食管癌抗原(NY-ESO-1)和腎癌抗原(SCP-1)等。
精子蛋白17(sperm protein 17，Sp17)是一種高度保守的、在人和動(dòng)物成熟生殖細(xì)胞中高水平表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，其功能主要是參與精子與卵子的結(jié)合，促進(jìn)受精過(guò)程[2]。人和其他哺乳動(dòng)物Sp17有很高的同源性，人與狒狒Sp17的同源性為97％，與鼠、兔的同源性為61％。人Sp17分子由151個(gè)氨基酸組成，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的表觀分子質(zhì)量為24.5kDa[3]。已有的研究表明，Sp17在人和動(dòng)物的正常組織中限制性表達(dá)[4-5]，是一種局限在睪丸組織和精子細(xì)胞的特異性蛋白，很少出現(xiàn)在其他正常組織和外周血中。測(cè)定的組織包括骨髓、腦、結(jié)腸、心、腎、肝、肺、胰腺、前列腺、骨骼肌、脾和睪丸，結(jié)果在正常睪丸組織中檢測(cè)到很強(qiáng)的Sp17表達(dá)信號(hào)，在前列腺中微弱表達(dá)，其他組織無(wú)表達(dá)。在正常人睪丸中，精母細(xì)胞、早期和晚期精細(xì)胞、以及成熟精子Sp17強(qiáng)陽(yáng)性，而精原細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞則陰性[6]。
近年發(fā)現(xiàn)，Sp17基因在一些惡性腫瘤組織如多發(fā)性骨髓瘤、上皮性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中被激活并高水平異常表達(dá)，是一種新的癌瘤-睪丸(cancer-testis，CT)抗原[7～9]。Sp17在正常組織中的局限性表達(dá)和在惡性組織中的異常表達(dá)，使它成為相關(guān)腫瘤診斷的分子標(biāo)志物和免疫治療的靶點(diǎn)。檢測(cè)腫瘤組織中Sp17蛋白分子的表達(dá)，有助于判斷腫瘤類(lèi)型。
因此，制備出特異性識(shí)別Sp17蛋白、且與之高親和力結(jié)合的單克隆抗體，用于配制診斷腫瘤的試劑組合物，是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提供一種針對(duì)Sp17的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供該單克隆抗體在制備惡性腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的單克隆抗體應(yīng)理解為可以是IgG或IgM，也可以是該抗體的Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈抗體等。
本發(fā)明典型的雜交瘤細(xì)胞株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No.1434，保藏時(shí)間為2005年8月10日，這里將分泌sp17單克隆抗體的細(xì)胞株表示為“Sp17-3D6”。
可通過(guò)實(shí)質(zhì)上通用的基因重組技術(shù)，獲得人或動(dòng)物Sp17基因工程蛋白用于動(dòng)物的免疫接種和篩選、鑒定抗體的抗原，但本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)載體pET-28a(+)，使目的基因的表達(dá)最有效，最易于純化。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案本發(fā)明的技術(shù)方案首先用基因工程技術(shù)制備人或動(dòng)物Sp17蛋白。從人或動(dòng)物睪丸組織中提取Sp17基因，對(duì)該基因進(jìn)行克隆，并構(gòu)建攜帶該基因的原核細(xì)胞表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌高效表達(dá)Sp17蛋白。再用獲得的該基因工程蛋白接種小鼠，待動(dòng)物體內(nèi)對(duì)Sp17蛋白形成免疫應(yīng)答后，從該動(dòng)物體內(nèi)提取脾淋巴細(xì)胞，與能在體外無(wú)限增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞系，從該細(xì)胞系中篩選出所有能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞株。對(duì)產(chǎn)生抗體的這些細(xì)胞株進(jìn)行反復(fù)篩選和單克隆化培養(yǎng)，優(yōu)選出抗體親和力最強(qiáng)，特異性最高的單克隆細(xì)胞株，所產(chǎn)生的抗體即為本發(fā)明的單克隆抗體。
本發(fā)明采用ELISA法對(duì)分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，采用Western印跡法、免疫組織化學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)法以及阻斷試驗(yàn)對(duì)所制備的單克隆抗體的特異性進(jìn)行了鑒定。
以下是本發(fā)明的具體技術(shù)措施一種精子蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏號(hào)為CGMCC No.1434的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
所述的單克隆抗體，其抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征。
分泌上述單克隆抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞系。所述的無(wú)限增殖細(xì)胞系為雜交瘤細(xì)胞系；該雜交瘤細(xì)胞系為保藏于CGMCC保藏號(hào)為CGMCC No.1434的雜交瘤細(xì)胞系。
所述的精子蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟a、克隆人或動(dòng)物的一種精子蛋白的基因；b、將克隆的人或動(dòng)物精子蛋白的基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體；c、將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)獲得該精子蛋白的高效表達(dá)產(chǎn)物，再經(jīng)親和層析，得到純化的該精子蛋白的重組蛋白；d、用純化的該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞系；e、從上述雜交瘤細(xì)胞系中篩選分泌該精子蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選出最穩(wěn)定、抗體活性最高的細(xì)胞株，它們所產(chǎn)生的抗體即為權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
所述的精子蛋白單克隆抗體的制備方法，其中克隆人或動(dòng)物精子蛋白的基因是用逆轉(zhuǎn)錄PCR法從人或動(dòng)物睪丸mRNA中擴(kuò)增出精子蛋白Sp17的cDNA。
所述的精子蛋白單克隆抗體的制備方法，其中表達(dá)載體優(yōu)選pET-28a(+)。
一種用于診斷腫瘤的試劑組合物，該組合物含有作為活性成分的有效量的上述單克隆抗體。
所述的單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果；首先，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該抗體能特異性結(jié)合于人或動(dòng)物睪丸組織、以及精液中精子細(xì)胞正常表達(dá)的Sp17蛋白，該抗體也能特異性結(jié)合于惡性腫瘤組織中異常產(chǎn)生的Sp17蛋白，包括釋放到外周血中的Sp17蛋白。
本發(fā)明單克隆抗體的具有高度特異性和強(qiáng)親和力，能用于診斷腫瘤的檢測(cè)試劑制備。
本發(fā)明所制備的單克隆抗體可適用于檢測(cè)腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移的病人的腹水癌細(xì)胞中異常表達(dá)的Sp17蛋白，以幫助判斷腫瘤的來(lái)源。
本發(fā)明所制備的單克隆抗體適用于檢測(cè)腫瘤組織中異常表達(dá)的Sp17蛋白，以幫助判斷腫瘤的類(lèi)型。


圖1RT-PCR擴(kuò)增Sp17DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖其中1.100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.RT-PCR產(chǎn)物。
圖2瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒pGEM-T/Sp17的PCR及酶切產(chǎn)物其中1.pGEM-T/Sp17未經(jīng)限制酶處理；2.pGEM-T/Sp17經(jīng)Nde I和BamH I處理；3.PCR產(chǎn)物；4.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3pET-28a(+)/Sp17在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的SDS-PAGE分析其中1.低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；2～6.IPTG誘導(dǎo)的5個(gè)陽(yáng)性克?。?.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的陽(yáng)性克??；8.pET-28a(+)/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)。
圖4鎳離子親和層析純化重組Sp17的SDS-PAGE分析其中1.純化的重組蛋白；2.pET-28a/Sp17質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli BL21菌裂解液。
圖5Western blot印跡鑒定Sp17單克隆抗體的特異性其中1.3C12株2.3D6株。
圖6IsoStrip小鼠單克隆抗體亞類(lèi)(型)測(cè)定結(jié)果。
圖7大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖抗Sp17單克隆抗體與大鼠睪丸中精母細(xì)胞、精細(xì)胞和成熟精子正常表達(dá)的Sp17發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，細(xì)胞染成黃褐色。
圖8人睪丸組織免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖之一精母細(xì)胞、精細(xì)胞和成熟精子表達(dá)的Sp17與抗Sp17單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，細(xì)胞染成黃褐色。
圖9人睪丸組織免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖之二人睪丸組織中與抗Sp17單克隆抗體的反應(yīng)被游離的Sp17蛋白所阻斷，未出現(xiàn)黃褐色細(xì)胞。
圖10人精液中的精子細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)分析的光鏡圖正常表達(dá)的Sp17與抗Sp17單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，精子尾部染成黃褐色。
圖11卵巢癌免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖癌細(xì)胞中異常表達(dá)的Sp17與抗Sp17單克隆抗體反應(yīng)，癌細(xì)胞被染成黃褐色。
圖12子宮內(nèi)膜癌免疫組織化學(xué)分析的光鏡圖癌細(xì)胞中異常表達(dá)的Sp17與抗Sp17單克隆抗體反應(yīng)，癌細(xì)胞被染成黃褐色。
圖13用本發(fā)明單克隆抗體進(jìn)行腹水中轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的檢測(cè)光鏡圖之一。
圖14用本發(fā)明單克隆抗體進(jìn)行腹水中轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的檢測(cè)光鏡圖之二。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1人精子蛋白17基因的克隆及原核表達(dá)要制備Sp17單克隆抗體，首先要進(jìn)行Sp17基因的克隆和原核表達(dá)，為制備Sp17單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。我們利用RT-PCR法和T/A克隆策略，從正常生育男性睪丸組織中克隆Sp17基因，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切鑒定后，進(jìn)行DNA測(cè)序(SEQ ID No.1)。然后，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)/Sp17，經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)重組Sp17，鎳離子親和層析純化重組蛋白。
1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本人睪丸組織1.2制備Sp17雙鏈cDNA片段1.2.1引物設(shè)計(jì)用DNAMAN分析軟件設(shè)計(jì)，PCR引物序列如下上游引物(primer 1)5′-CCACGCACATATGTCGATTCCATTCTCCAAC-3′(SEQID No.2)(劃線處為Nde I酶切位點(diǎn))下游引物(primer 2)5′-CGGGGATCCTCACTTGTTTTCCTCTTTTTC-3′(SEQ IDNo.3)(劃線處為BamH I酶切位點(diǎn))。
1.2.2人睪丸組織總RNA的提取切取50mg組織塊放入研缽中，立即加入適量的液氮，在組織呈凍結(jié)狀態(tài)下充分研磨，使之成為粉末狀，緊接著轉(zhuǎn)移至含1ml Tripure RNA提取液的離心管中，顛倒混勻，室溫放置15分鐘。加入0.2ml氯仿，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上層無(wú)色水相至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘。4℃12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml 75％乙醇，渦旋振蕩，4℃ 7500rpm離心5分鐘。棄上清，用50μl DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水溶解RNA沉淀，8g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取的效果，將標(biāo)本RNA溶液凍存在-70℃冰箱待用。
1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總反應(yīng)體系(20μl)組成如下10×RT-緩沖液 2μl25mmol/L MgCl24μl10mmol/L dNTP 2μlRNase抑制劑 0.5μl總RNA溶液 3μl隨機(jī)引物 1μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶 0.75μl(15U)無(wú)核酸酶超純水(無(wú)核酶水)補(bǔ)足反應(yīng)體積至20.0μl按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)70℃孵育RNA溶液10分鐘，立即冰浴5分鐘；加入其他反應(yīng)成分，振蕩混勻，瞬時(shí)離心，室溫孵育10分鐘；42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30分鐘，95℃加熱5分鐘，滅活A(yù)MV逆轉(zhuǎn)錄酶，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 1.2.4PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系(25μl)組成如下10×PCR-緩沖液2.5μl25mmol/L MgCl21.5μl10mmol/L dNTP 0.5μl5μmol/L Sp17上游引物 1.0μl5μmol/L Sp17下游引物 1.0μl總cDNA單鏈模板1.0μl滅菌蒸餾水16.5μlTaq酶(0.5U/μl) 1.0μlPCR參數(shù)為94℃預(yù)變性5分鐘，95℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7分鐘。17g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1。
1.2.5PCR產(chǎn)物的純化及定量利用市售的純化試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用紫外分光光度計(jì)定量DNA溶液的濃度。
1.3重組克隆載體pGEM-T/nSp17的構(gòu)建及鑒定
1.3.1連接反應(yīng)總反應(yīng)體系(10μl)組成如下10×連接酶緩沖液1.0μlSp17雙鏈cDNA2.0μl(27ng/μl)pGEM-T載體 1.0μl(50ng/μl)T4DNA連接酶 1.0μl無(wú)核酸酶水 5.0μl振蕩混勻反應(yīng)體系，4℃連接反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，65℃保溫10分鐘，滅活T4DNA連接酶。
1.3.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞將10μl連接反應(yīng)液加入到100μl JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕拍動(dòng)管壁數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，置于冰浴30分鐘。將離心管置于42℃水浴中90秒，立即轉(zhuǎn)至冰浴，靜置2分鐘。緩慢加入LB培養(yǎng)基0.5ml，37℃ 100rpm振搖培養(yǎng)45分鐘，將菌液涂布在含氨芐青霉素(0.1g/L)、5’-溴-4-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(0.3g/L)及異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(0.3g/L)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
1.3.3篩選和擴(kuò)增培養(yǎng)陽(yáng)性克隆隨機(jī)挑取5個(gè)白色單菌落，分別接種于5只培養(yǎng)試管(含0.1g/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中，37℃ 250rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。
1.3.4DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒將經(jīng)過(guò)PCR和酶切鑒定的重組質(zhì)粒，送上海博亞生物公司，用通用引物進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Genbank及其他文獻(xiàn)報(bào)道中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖2。
1.4構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)/Sp171.4.1割膠純化酶切后的Sp17 DNA片段1.4.2試劑盒提取質(zhì)粒pET-28a(+)1.4.3Nde I、BamH I雙酶切質(zhì)粒pET-28a(+)總反應(yīng)體系(100μl)組成如下滅菌蒸餾水50.0μl10×K緩沖液 10.0μl
質(zhì)粒pET-28a(+)(0.16mg/ml)30.0μlNde I(10U/μl) 5.0μlBamH I(10U/μl) 5.0μl振蕩混勻反應(yīng)體系，37℃孵育1h，加入10μl 10×Loading緩沖液終止酶切反應(yīng)，10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。
1.4.5割膠純化線性化質(zhì)粒pET-28a(+)。
1.4.6連接反應(yīng)(反應(yīng)體系組成如下)10×連接酶緩沖液 1.0μl純化后Sp17 DNA 2.0μl(43μg/ml)純化后線性化質(zhì)粒pET-28a(+) 1.0μl(177μg/ml)T4DNA連接酶 1.0μl無(wú)核酸酶水 5.0μl振蕩混勻反應(yīng)體系，4℃連接反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，65℃保溫10分鐘，滅活T4DNA連接酶。
1.4.7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE)將菌液涂布在含卡那霉素(0.1g/L)的LB平板上，倒扣平皿放置在37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
1.4.8篩選、擴(kuò)增培養(yǎng)陽(yáng)性克隆隨機(jī)挑取5個(gè)單菌落，分別接種于5只培養(yǎng)試管(含0.1g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基)中，37℃ 250rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。
1.5重組質(zhì)粒pET-28a(+)/Sp17的誘導(dǎo)表達(dá)挑取經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定的陽(yáng)性克隆，接種于含卡那霉素(0.1g/L)的LB培養(yǎng)基，37℃ 250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。次日，以1∶50稀釋轉(zhuǎn)種于含卡那霉素(0.1g/L)的LB培養(yǎng)基，37℃ 300rpm劇烈振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600≈0.6時(shí)，取出1ml菌液不加誘導(dǎo)劑作為陰性對(duì)照，在菌液中加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，終濃度為1mmol/L)，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3h小時(shí)。同時(shí)，用含空載質(zhì)粒pET-28a(+)的和不含質(zhì)粒的BL21菌作為空白對(duì)照。取1ml誘導(dǎo)菌液，7500rpm離5分鐘，棄上清，50μl 1×SDS凝膠上樣緩沖液充分重懸細(xì)菌沉淀，隔水煮沸5分鐘，12000rpm離心5分鐘，取10μl上清進(jìn)行SDS-PAGE(濃縮膠50g/，分離膠150g/L)檢測(cè)和分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果如圖3。
1.6鎳離子親和層析純化重組Sp17緩沖液A浸泡平衡2g Ni-NTA His-Bind樹(shù)脂1h，樹(shù)脂自然沉淀后棄上清，混勻裂解離心上清和平衡樹(shù)脂，4℃輕輕振蕩1h。轉(zhuǎn)移懸液至層析柱中，讓柱床中的液體自然流干，10個(gè)柱床體積的緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗滌樹(shù)脂。最后，用4ml咪唑洗脫緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白。在4℃冰箱中，PBS透析洗脫液48h，其間換液8次。裂解離心上清和純化產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE(濃縮膠50g/L，分離膠150g/L)，對(duì)比分析純化效果，見(jiàn)圖4。考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定重組蛋白的濃度。
實(shí)施例2 抗Sp17單克隆抗體的制備1.用Sp17蛋白免疫接種BALB/c小鼠初次免疫時(shí)，取純化的重組Sp17(1.7g/L)0.5ml與等量福氏完全佐劑混合，在研缽中充分研磨至完全乳化(即油包水狀態(tài))后，注射到小鼠腹腔內(nèi)(0.1ml/只)。間隔2周后進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫，改用福氏不完全佐劑充分乳化抗原，注射劑量和部位同前。間隔2周后進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫，直接使用抗原溶液，注射劑量和部位同前。間隔10天后測(cè)定免疫小鼠血清中的抗體效價(jià)。在細(xì)胞融合前3天，取一只抗體陽(yáng)性最強(qiáng)的小鼠進(jìn)行第4次加強(qiáng)免疫，注射劑量和部位同前。
2.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠血清中抗體的效價(jià)第3次加強(qiáng)免疫10天后，采集抗原免疫的和未免疫的小鼠血，作為ELISA的待測(cè)標(biāo)本和陰性對(duì)照，分離血清，4℃保存待測(cè)。用抗原包被液稀釋重組Sp17至終濃度為1μg/ml，包被聚苯乙烯板微孔(100μl/孔)，4℃包被過(guò)夜。次日，PBS-T洗板3次，按200μl/孔加入50g/L脫脂奶粉封閉，37℃孵育2小時(shí)h，PBS-T洗板3次。PBS稀釋待測(cè)血清和陰性對(duì)照血清(1∶1000)，以PBS為空白對(duì)照，按100μl/孔加入微孔，37℃孵育1小時(shí)h。PBS-T洗板3次，按100μl/孔加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀釋)，37℃孵育1小時(shí)。PBS-T洗板3次，每孔加入底物、顯色劑各1滴，37℃孵育10分鐘。加2滴1mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450nm用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀比色并記錄結(jié)果。
3.小鼠脾細(xì)胞的制備第4次加強(qiáng)免疫3天后，摘除免疫小鼠眼睛放血，留取血清作為ELISA的陽(yáng)性對(duì)照，4℃保存?zhèn)溆?。拉頸處死小鼠，75％酒精浸泡5分鐘。在小鼠腹部剪一小口，撕開(kāi)皮膚，剪開(kāi)腹膜，鑷取小鼠脾臟，剪下小鼠脾臟，除去脂肪和結(jié)締組織，用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基洗滌小鼠脾臟。將小鼠脾臟剪成4塊，在不銹鋼篩網(wǎng)(100目/cm2)上，用玻璃注射器針芯充分研磨小鼠脾臟，輕輕擠壓出脾細(xì)胞。將研磨液經(jīng)過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)(200目/cm2)過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm離心5分鐘。棄上清，RPMI 1640不完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，再用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并算出細(xì)胞濃度為2×1010個(gè)/L，置于孵育箱(37℃、5％CO2)中待用。
4.細(xì)胞融合充分混勻免疫脾細(xì)胞(108個(gè))和SP2/0細(xì)胞(107個(gè))懸液，1000rpm離心5分鐘。棄上清，盡可能除去殘留液體，手指輕彈離心管使細(xì)胞沉淀較為松動(dòng)。將離心管置于37℃水浴中，30秒內(nèi)加完1ml 50％ PEG 4000，邊加邊適度攪拌，加完后繼續(xù)攪拌15秒，靜置90秒。加入RPMI1640不完全培養(yǎng)液，加液速度由慢到快，具體方案連續(xù)每2分鐘內(nèi)分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml，終止融合作用。800rpm離心5分鐘，棄上清，用RPMI1640不完全培養(yǎng)液輕輕重懸、洗滌細(xì)胞1次。加入50ml HAT完全培養(yǎng)基，輕輕重懸細(xì)胞，按100μl/孔加入到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，置于細(xì)胞孵育箱(37℃、5％CO2)中培養(yǎng)。
5.抗體的檢測(cè)用重組Sp17作為包被抗原，取待測(cè)微孔中培養(yǎng)上清0.1ml用于測(cè)定，以免疫小鼠外周血清作為陽(yáng)性對(duì)照，以SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，用HRP-羊抗鼠(1∶3000稀釋)作為二抗。
6.雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)取100個(gè)細(xì)胞，加入10ml HT培養(yǎng)基并充分混勻，按0.1ml/孔加入到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中。10天后檢測(cè)抗體，篩選出抗體陽(yáng)性最強(qiáng)的2個(gè)單克隆細(xì)胞株，分別為3C12和3D6。然后，改用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含20％新生小牛血清)，多次進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，直到所有含細(xì)胞克隆的均為抗體陽(yáng)性為止。如此獲得3C12和3D6細(xì)胞株。
7.雜交瘤細(xì)胞系的建立將抗體陽(yáng)性的3C12和3D6單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞系，每隔一周進(jìn)行一次抗體檢測(cè)。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞系達(dá)到一定的數(shù)量時(shí)，凍存細(xì)胞，留取上清用于測(cè)定其單克隆抗體的效價(jià)。雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月后液氮凍存，復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌Sp17單克隆抗體。
8.腹水單克隆抗體的制備將液體石蠟(0.5ml/只)注射到小鼠腹腔中，14天后將抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞(0.5ml/只)注入小鼠腹腔中。當(dāng)小鼠腹部明顯膨大，用8號(hào)針頭抽取小鼠腹水，每隔4天同法抽取，直至小鼠死亡。3000rpm離心腹水10分鐘，棄上層油脂和不溶物以及下層各種細(xì)胞和不溶物，吸取淡黃色上清，加入等體積的甘油(含20g/L的Na2HPO4)，分裝后-20℃冰箱保存。
實(shí)施例3 抗Sp17單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定采用ELISA法。用Sp17蛋白(1mg/L)包被聚苯乙烯板微孔(100μl/孔)，4℃過(guò)夜。次日，PBS-T洗板3次，按200μl/孔加入50g/L脫脂奶粉封閉37℃ 2小時(shí)，PBS-T洗板3次。加入待測(cè)樣本(雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清，或系列稀釋的小鼠腹水單克隆抗體)，37℃孵育1小時(shí)。PBS-T洗板3次，加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀釋)，37℃孵育1小時(shí)。PBS-T洗板3次，每孔加入TMB-H2O2溶液，37℃孵育10分鐘。加2滴1mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450nm用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀比色。結(jié)果雜交瘤細(xì)胞株3C12和3D6的培養(yǎng)上清抗體效價(jià)分別為1∶64和1∶32；腹水的抗體效價(jià)分別為1∶105和1∶5×104。
實(shí)施例4 Western blot印跡試驗(yàn)將表達(dá)重組Sp17大腸桿菌總蛋白印跡到硝酸纖維素濾膜上。含50g/L脫脂奶粉的PBS-T封閉過(guò)夜，PBS-T漂洗3次，分別加入2種單克隆抗體(1∶1000稀釋)孵育1小時(shí)，PBS-T漂洗3次，加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶2000)孵育1小時(shí)，PBS-T漂洗3次。最后，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)后，僅在重組蛋白條帶位置上出現(xiàn)棕黃色條帶，其他菌體蛋白條帶未見(jiàn)顯色(見(jiàn)圖5)。
實(shí)施例5 單克隆抗體亞型的測(cè)定用IsoStrip小鼠單克隆抗體亞類(lèi)(型)測(cè)定試劑盒測(cè)試。留取雜交瘤細(xì)胞株3C12或3D6的培養(yǎng)上清，用PBS(pH 7.4)將其進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)瑢?50μl稀釋液滴加到測(cè)試試管中，稍加渦旋試管使藍(lán)色膠乳完全重懸，將抗體亞型測(cè)定試紙條的黑色一端插入到試管內(nèi)底部，待藍(lán)色的陽(yáng)性控制線條出現(xiàn)時(shí)，取出測(cè)試條，2分鐘后讀取結(jié)果。結(jié)果判斷在測(cè)試條上抗體亞型反應(yīng)區(qū)出現(xiàn)藍(lán)色直線條帶，即為陽(yáng)性結(jié)果，正確讀取對(duì)應(yīng)的亞型。結(jié)果雜交瘤細(xì)胞株3C12和3D6的抗體亞型分別為IgG1和IgM，輕鏈均為κ型。如圖6所示。
實(shí)施例6 免疫組化試驗(yàn)鑒定單克隆抗體與天然Sp17的特異性反應(yīng)a.解剖大鼠取睪丸，甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟，0.03％甲醇-H2O2孵育30分鐘，微波爐中煮沸1分鐘。10％羊血清封閉30分鐘，PBS-T洗3次，一抗為本發(fā)明單克隆抗體Sp17 mAb(1∶1000)，未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜，漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000)，37℃孵育1小時(shí)，漂洗3次，DAB底物溶液顯色10分鐘，蘇木素復(fù)染1分鐘，脫水，透明，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并照像，觀察單克隆抗體與組織中各類(lèi)細(xì)胞的反應(yīng)性(圖7)。
b.取前列腺癌患者去勢(shì)治療手術(shù)切除的正常老年睪丸作組織切片，同樣進(jìn)行免疫組化分析，觀察單克隆抗體與與組織中各類(lèi)細(xì)胞的反應(yīng)性(圖8)。
c.阻斷試驗(yàn)為了進(jìn)一步鑒定本發(fā)明單克隆抗體的特異性，進(jìn)行了阻斷試驗(yàn)，即向單克隆抗體溶液中加入純化的Sp17蛋白(100mg/L)，于37℃孵育30min后，再用該單克隆抗體溶液進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體與睪丸、精液標(biāo)本及卵巢癌組織的陽(yáng)性反應(yīng)均可被阻斷(圖9)，從而證明本發(fā)明單克隆抗體所結(jié)合的組織中的蛋白是Sp17蛋白。
d.留取行常規(guī)精液檢查的人精液標(biāo)本，液化后1000rpm離心5分鐘，PBS-T洗3次，將精子濃度調(diào)整到5×106/ml，涂片，自然干燥，酒精燈上過(guò)火3次固定。10％羊血清封閉30分鐘，洗3次，加抗Sp17單克隆抗體(1∶400)，未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，37℃孵育2小時(shí)，漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶300)，37℃孵育1小時(shí)，漂洗3次，DAB溶液顯色10分鐘，蘇木素復(fù)染，封片，在高倍鏡下觀察并拍攝照片(圖10)。
免疫組化和細(xì)胞免疫化學(xué)染色分析結(jié)果顯示，抗Sp17單克隆抗體能與人和大鼠睪丸中精母細(xì)胞、精細(xì)胞和成熟精子以及人精液中的精子細(xì)胞表達(dá)的Sp17發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，細(xì)胞染成黃褐色(見(jiàn)圖7、8、10)。
實(shí)施例7用本發(fā)明單克隆抗體進(jìn)行腫瘤的免疫組化分析用10％中性甲醛固定卵巢原發(fā)上皮性癌、子宮內(nèi)膜癌，4℃固定過(guò)夜。梯度酒精(25％、50％、75％和100％)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，修塊，做連續(xù)切片，鋪片。石蠟切片脫蠟至水，0.03％甲醇-H2O2孵育30分鐘，微波爐中煮沸1分鐘。10％羊血清封閉30分鐘，PBS-T洗3次，滴加本發(fā)明抗Sp17單克隆抗體(1∶1000稀釋)，以未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜。PBS-T漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀釋)，37℃孵育1小時(shí)。PBS-T漂洗3次，DAB顯色10分鐘，水洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染1分鐘，脫水，透明，DPX封片。用光學(xué)顯微鏡觀察并照像(見(jiàn)圖11、12)。結(jié)果表明本發(fā)明單克隆抗體可用于檢測(cè)卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌組織中Sp17的異常表達(dá)，效果良好。
實(shí)施例8用本發(fā)明單克隆抗體進(jìn)行腹水中轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的檢測(cè)將病人腹水細(xì)胞收集固定在載玻片上，10％羊血清封閉30分鐘，PBS-T洗3次，滴加本發(fā)明抗Sp17單克隆抗體(1∶1000稀釋)，以未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜。PBS-T漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀釋)，37℃孵育1小時(shí)小時(shí)。PBS-T漂洗3次，DAB顯色10分鐘，水洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染1分鐘，DPX封片。用光學(xué)顯微鏡觀察并照像(見(jiàn)圖13、14)，圖中細(xì)胞質(zhì)被染色為黃褐色者為癌細(xì)胞，表明本發(fā)明單克隆抗體可有效檢測(cè)腹水癌細(xì)胞中異常表達(dá)的Sp17蛋白。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院<120>一種精子蛋白單克隆抗體及其制備方法與用途<160>3<210>1<211>456<212>DNA<213>sp17天然序列<400>1atgtcgattc cattctccaa cacccactac cgaattccac aaggatttgg gaatcttctt 60gaagggctga cacgcgagat tctgagagag caaccggaca atataccagc ttttgcagca 120gcctattttg agagccttct agagaaaaga gagaaaacca actttgatcc agcagaatgg 180gggagtaagg tagaagaccg cttctataac aatcatgcat tcgaggagca agaaccacct 240gagaaaagtg atcctaaaca agaagagtct cagatatctg ggaaggagga agagacatca 300gtcaccatct tagactcttc tgaggaagat aaggaaaaag aagaggttgc tgctgtcaaa 360atccaagctg ccttccgggg acacatagcc agagaggagg caaagaaaat gaaaacaaat 420agtcttcaaa atgaggaaaa agaggaaaac aagtga 456<210>2<211>31<212>DNA<213>上游引物人工序列<400>2ccacgcacat atgtcgattc cattctccaa c 31
<210>3<211>30<212>DNA<213>下游引物人工序列<400>3cggggatcct cacttgtttt cctctttttc 30
權(quán)利要求
1.一種精子蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏號(hào)為CGMCC No.1434的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征。
3.分泌權(quán)利要求1所述單克隆抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無(wú)限增殖細(xì)胞系，為雜交瘤細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無(wú)限增殖細(xì)胞系，其中雜交瘤細(xì)胞系為保藏于CGMCC保藏號(hào)為CGMCC No.1434的雜交瘤細(xì)胞系。
6.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟a、克隆人或動(dòng)物的一種精子蛋白的基因；b、將克隆的人或動(dòng)物精子蛋白的基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體；c、將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)獲得該精子蛋白的高效表達(dá)產(chǎn)物，再經(jīng)親和層析，得到純化的該精子蛋白的重組蛋白；d、用純化的該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞系；e、從上述雜交瘤細(xì)胞系中篩選分泌該精子蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選出最穩(wěn)定、抗體活性最高的細(xì)胞株，它們所產(chǎn)生的抗體即為權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述克隆人或動(dòng)物精子蛋白的基因是用逆轉(zhuǎn)錄PCR法從人或動(dòng)物睪丸mRNA中擴(kuò)增出精子蛋白Sp17的cDNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述表達(dá)載體優(yōu)選pET-28a(+)。
9.一種用于診斷腫瘤的試劑組合物，該組合物含有作為活性成分的有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種精子蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途。該單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCC No.1434的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體；該制備方法通過(guò)克隆人或動(dòng)物精子蛋白的基因；將克隆的基因插入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析，得到純化的該精子蛋白的重組蛋白；用該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細(xì)胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤細(xì)胞系，從中篩選出分泌該精子蛋白抗體最穩(wěn)定、抗體活性最高的雜交瘤細(xì)胞株，它們所產(chǎn)生的抗體即為所需的單克隆抗體；該單克隆抗體可制備腫瘤診斷試劑。該單克隆抗體的具有高度特異性和強(qiáng)親和力，制備方法簡(jiǎn)單高效。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1781944SQ200510094178
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者李芳秋, 楊?lèi)?ài)龍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院