表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌及其構(gòu) 建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌（Escherichiacoll)的某些血清型菌株所引起 的一種雞的傳染病。不同品種不同日齡的雞都可發(fā)生。由于感染途徑不同，臨床主要表現(xiàn) 為敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、腹膜炎、大腸桿菌肉芽腫和全眼球炎 等多種病型。1885年Escherch首先發(fā)現(xiàn)大腸桿菌，1894年Ligniers系統(tǒng)報(bào)導(dǎo)了本病并分 離出病原，在相當(dāng)長的一段時(shí)間，大腸桿菌一直被認(rèn)為是正常腸道菌群的組成部分，直到上 世紀(jì)中葉才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和畜禽有病原性。隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展， 病原性大腸桿菌在各國的流行日益嚴(yán)重。此病在瑞典、荷蘭、法國、匈牙利、保加利亞、美國、 前蘇聯(lián)及其它養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)的國家均有發(fā)生。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)集約化程度的不斷提高，該病 不斷地在我國蔓延和擴(kuò)散，全國大部分省、市、自治區(qū)皆有報(bào)導(dǎo)。
[0003] 大腸桿菌致病性菌株的致病因子（或稱毒力因子）主要由該病原體的三個(gè)特 征確定：侵襲力、感染性和致病性潛力；其致病力因素則主要有細(xì)菌菌毛、毒素、外膜蛋白 (Outermembraneprotein,Omp)、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等等。菌毛蛋白（或稱粘著素、定居因子）、 腸毒素、和外膜蛋白是大腸桿菌的主要毒力因子。研究表明，位于外膜外側(cè)的雞源大腸桿菌 外膜蛋白能客觀反映大腸桿菌分離株的遺傳相關(guān)性，且在大腸桿菌致病機(jī)理及免疫機(jī)理中 具有重要作用，致病株和非致病株毒力不同，可能是外膜蛋白的改變，由遺傳因素造成。〇mp 可以加快巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，激活淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，刺激機(jī)體體液免疫，加強(qiáng)細(xì)胞 免疫功能，從而抵抗同源菌和異源菌的攻擊，這提示了其在預(yù)防疾病方面具有很大潛力，是 一種重要的致病因子。
[0004] 在藥物治療方面，由于大量抗生素長期使用和濫用，致使耐藥菌株越來越多，耐藥 譜不斷擴(kuò)展、產(chǎn)生耐藥性的能力越來越強(qiáng)。使得藥物控制難度越來越大，可供選擇藥物的空 間也越來越小。這就給藥物防治雞大腸桿菌病帶來很大的困難。因此研制有效的疫苗來預(yù) 防雞大腸桿菌病，越來越受到重視并被廣泛的采用。由于雞致病性大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 血清型眾多，不同血清型菌株之間缺乏完全交叉保護(hù)，加之不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型又存在 很大的差異。因此，解決此問題的關(guān)鍵在于找出禽大腸桿菌共同的保護(hù)性抗原，以制備對(duì)不 同血清型菌株均有保護(hù)作用的疫苗，使用基因工程疫苗預(yù)防本病具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌，以提高免疫的效 果，降低防治雞大腸桿菌疫苗的生產(chǎn)成本。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供上述表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌的構(gòu)建方法。
[0007] 本發(fā)明還有一目的是提供上述表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌在制備雞大腸桿 菌病免疫疫苗中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供一種雞大腸桿菌外膜蛋白基因工程亞單位疫苗。
[0009] 為達(dá)到上述目的，采用的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌，其導(dǎo)入了雞大腸桿菌外膜蛋白操縱子基因 重組質(zhì)粒。其中，受體菌株為DH5a和BL21。
[0011] 上述表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0012] 1、雞大腸桿菌外膜蛋白結(jié)構(gòu)基因及各功能性基因的PCR擴(kuò)增；
[0013]2、能夠呈現(xiàn)表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0014] 其中，步驟1所述的雞大腸桿菌外膜蛋白操縱子基因的PCR擴(kuò)增包括如下步驟：
[0015]A、引物的設(shè)計(jì)與合成；
[0016]B、DNA片段的提??；
[0017]C、雞大腸桿菌外膜蛋白操縱子基因的擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化與表達(dá)。
[0018] 其中，步驟2所述的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：雞大腸桿菌外膜蛋白操 縱子基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接、質(zhì)粒構(gòu)建和操縱子基因表達(dá)質(zhì)粒的連接、構(gòu)建與鑒定、以 及表達(dá)的外膜蛋白的抗原制備。
[0019] 其中，步驟2中所使用的質(zhì)粒為pUCm-T和pET-28a。
[0020] 表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌,在制備雞大腸桿菌病免疫疫苗中的應(yīng)用。
[0021] 一種雞大腸桿菌外膜蛋白基因工程亞單位疫苗，它是通過如下方法制得：將表達(dá) 雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌的表達(dá)產(chǎn)物與吐溫-80按體積96:4混勻作為水相，白油與司 班-80按體積94:6加熱溶解作為油相，油相與水相按體積比3:1的比例乳化。
[0022] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0023] 本發(fā)明的表達(dá)雞大腸桿菌外膜蛋白重組菌，其表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量高，成本低，易于實(shí)現(xiàn) 疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0024] 圖1外膜蛋白C基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，其中，M泳道是核酸DNAMarker，L1為 外膜蛋白CPCR擴(kuò)增產(chǎn)物約llOObp。
[0025] 圖2為質(zhì)粒pUCm-C酶切電泳，其中，M泳道是核酸DNAMarker，L1為BamHI和 Hindlll雙酶切結(jié)果。
[0026] 圖3為pET-C酶切電泳，其中，M泳道是核酸DNAMarker，L1為BamHI和Hindlll 雙酶切結(jié)果。
[0027] 圖4為pET-C蛋白電泳，其中，泳道M為低分子量蛋白Marker，泳道LI、L2為 pET-C，泳道L3、L4為空質(zhì)粒pET-28a。
[0028] 圖5為pET-C表達(dá)蛋白在大腸桿菌中的分布蛋白電泳，其中，泳道M為低分子量蛋 白Marker，泳道L1為pET-C可溶性形式存在，泳道L2為pET-C包涵體形式存在。
[0029] 圖6為外膜蛋白C基因表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析，其中L1為空質(zhì)粒對(duì)照，L2 為pET_C表達(dá)蛋白，M為Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例中使用的材料如下：
[0031] 1、宿主菌：受體菌株DH5a和BL21。
[0032] 2、質(zhì)粒：pUCm-T和pET_28a。
[0033] 實(shí)施例1 :雞大腸桿菌外膜蛋白操縱子基因的PCR擴(kuò)增
[0034] 1、引物設(shè)計(jì)與合成
[0035] 根據(jù)GenBank公布的雞源外膜蛋白C基因全序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物P01，P02。P01， P02引物中分別含有BamHI和Hindlll酶切位點(diǎn)，引物序列如下：
[0036] P01:5'-CGCGGATCCAACATGAAAGTTAAAGTACTGTCCCTC-3'
[0037] BamHI
[0038] P02 :5,-CCCAAGCTTTTAGAACTGGTAAACCAGGCC-3,
[0039]Hindlll
[0040] 2、模版的制備
[0041] 將雞大腸桿菌單菌株用LB培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，提取基因組，作為模板。
[0042] 3、PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件
[0043]PCR反應(yīng)在 50iiL體系中進(jìn)行，lOXBuffer5.OilL，dNTP4.OilL，P012.OilL， P022. 0iiL，DNA模板 1iiL，Taq酶 0? 5iiL，雙蒸水 35. 5iiL。
[0044]混勻后按下列條件PCR擴(kuò)增：94°C5min，94°Clmin，45°Clmin，72°C2min，共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保存。見圖1外膜蛋白C基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，其 中，M泳道是核酸DNAMarker，L1為外膜蛋白CPCR擴(kuò)增產(chǎn)物約llOObp。
[0045] 4、PCR產(chǎn)物的鑒定及純化回收
[0046] (1)瓊脂糖凝膠電泳
[0047] 用lXTAE(40mmol/LTris-乙酸，lmmol/LEDTA)緩沖液配成所需濃度的瓊脂糖凝 膠溶液，微波爐加熱使瓊脂糖完全溶解之后，加DNA核酸染色劑，混勻后倒入根據(jù)需要選定 并封固好的電泳膠模中，凝膠厚度在3~5mm之間，插入寬度相當(dāng)?shù)氖嶙?，梳子距底板大約 0. 5~1mm。待凝膠完全凝固后（約30~45min)，小心拔出梳子，拆去封條，將凝膠放入裝 有1XTAE的電泳緩沖液的電泳槽中，使電泳緩沖液剛沒過膠面（約1mm)。然后取適量待電 泳的DNA樣品滴在Parafilm膜上與1/6體積的電泳上樣緩沖液6XLoadingbuffer混勻， 用微量加樣器將混合樣品加到加樣槽中，以5V/cm的電壓電泳