專利名稱：S100a4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白制備方法。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及S100A4基因優(yōu)化與高效 表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
S100A4蛋白是以非共價(jià)鍵結(jié)合二聚體存在于細(xì)胞內(nèi)，而以共價(jià)結(jié)合二聚體分泌 到細(xì)胞外。推測(cè)Ca2+結(jié)合后可導(dǎo)致S100A4蛋白構(gòu)型改變，在表面暴露出新的結(jié)合位點(diǎn)， 從而可與一系列靶標(biāo)結(jié)合。胞外基質(zhì)中的S100A4蛋白是一種單體和二聚體共存的狀態(tài)， 其比例受Ca2+結(jié)合程度的影響；胞內(nèi)S100A4蛋白的同源二聚體和異源二聚體形式也是同 時(shí)存在。因此，從S100A4蛋白可形成同源二聚體、異源二聚體、寡聚體的多種形式來(lái) 看，其結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的可變性，這可能也是它在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究采用全基因合成法合成S100A4基因。并根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用 Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的S100A4基因序列，全部選用偏好 密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物。為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入EcoR I和BamH I的酶切位點(diǎn)，同時(shí)在3’末端引入6XHis標(biāo)簽以利于進(jìn)一步純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備并優(yōu)化S100A4基因的方法。本發(fā)明優(yōu)化后的S100A4序列與原序列相比，37個(gè)堿基被替換，序列中所有的
E.coli低頻密碼子均被高頻密碼子所替換。本發(fā)明還公開(kāi)了一種編碼S100A4蛋白分子的基因，該基因具有序列表中序列2 所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了上述S100A4蛋白分子的基因制備方法。該方法包括如下步 驟(1)S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成(2)PCR合成優(yōu)化后S100A4序列并與表達(dá)載體pBV220連接，構(gòu)建 pBV220-S100A4 表達(dá)載體；(3)在大腸桿菌DH5 a中進(jìn)行高效表達(dá)；制備S100A4蛋白編碼基因可以按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，優(yōu)選PCR法。優(yōu)選 PCR重疊引物延伸法(黃培堂等譯，J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第三版，pl091-1113)。所述表達(dá)載體可以是常規(guī)的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，如商業(yè)PET系 列載體和國(guó)內(nèi)廣泛使用的PBV220載體，優(yōu)選PBV220載體。大腸桿菌可以是適合原核 系統(tǒng)表達(dá)的配套大腸桿菌，當(dāng)使用PET類載體，宿主菌優(yōu)選E.coli BL21(DE3)系列；當(dāng) 使用PBV220載體時(shí)宿主菌可選擇多種商業(yè)上提供的大腸桿菌，優(yōu)選E.coli DH5 a。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成S100A4序列的引物，PCR擴(kuò)增優(yōu)化 后的S100A4序列克隆至載體pEasy_T3上，構(gòu)建克隆載體pEasy_S100A4。測(cè)序后，將該序列克隆至表達(dá)載體PBV220并轉(zhuǎn)化至DH5ci。在熱激誘導(dǎo)下，在大腸桿菌DH5 a中 實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。


圖1為S100A4序列中被替換的堿基示意2為合成S100A4基因的PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳。圖3為測(cè)序結(jié)果與優(yōu)化后的S100A4序列的比較圖4為菌落PCR法鑒定重組陽(yáng)性pEasy_S100A4克隆圖5為克隆載體pEasy_S100A4的酶切鑒定圖6為菌落PCR法鑒定陽(yáng)性pBV_220S100A4克隆圖7為表達(dá)載體pBV220_S100A4的酶切鑒定
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明1.材料與方法1.1 材料1.1.1質(zhì)粒與菌株克隆載體pEasy_T3購(gòu)自北京全式金公司；表達(dá)載體pBV220、大腸桿菌E.coli DH5a由本實(shí)驗(yàn)保存。1.1.2酶及主要試劑膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、BamHI、EcoR I及T4DNA Ligase均購(gòu)自 Promega公司；TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自北京 TIANGEN公司，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自TaKaRa公司。1.2 方法1.2.1S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成①根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中 檢索到的S100A4基因序列(如下圖1所示)；②全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物(表1)。③為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入了 EcoRI和BamHI的酶切位點(diǎn)，同 時(shí)在3’末端引入6XHis標(biāo)簽以利于進(jìn)一步純化。表1S100A4的全合成引物Table 1.oligonucleotide primers with mutual overlaps
權(quán)利要求
1.一種S100A4蛋白基因序列，其特征在于優(yōu)化后的S100A4序列與原序列相比，37 個(gè)堿基被替換，序列中所有的E.coli低頻密碼子均被高頻密碼子所替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的S100A4蛋白分子，其特征在于具有序列表中序列1所示的堿基 序列。
3.編碼權(quán)利要求1的S100A4蛋白分子的基因，其特征在于具有序列表中序列2所示 的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的S100A4蛋白分子的基因優(yōu)化與高效表達(dá)，其特征在于包括 如下步驟(DS100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成(2濘€ _合成優(yōu)化后3100人4序列并與表達(dá)載體卩3￥-220連接；構(gòu)建pBV220_S100A4 表達(dá)載體；(3)在大腸桿菌DH5ci中進(jìn)行高效表達(dá)；
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于步驟(2)所述表達(dá)載體是PBV220。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于步驟(3)所述大腸桿菌是E.coliDH5 α。 附權(quán)利要求特征的詳細(xì)步驟S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)，其特征包括如下步驟 (DS100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成①根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索 到的S100A4基因序列；②全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物。③為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入了EcoRI和BamHI的酶切位點(diǎn)，同時(shí)在 3’末端引入6XHis標(biāo)簽以利于進(jìn)一步純化。(2)PCR合成優(yōu)化后S100A4序列 PCR法合成。(3)克隆載體pEasy_S100A4的構(gòu)建將優(yōu)化的S100A4基因序列TA克隆至pEasy_T3載體上構(gòu)建克隆載體pEasy_S 100A4， 轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α中，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切鑒定后送invitrogen公司測(cè)序。(4)表達(dá)載體pBV220-S100A4的構(gòu)建①以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，以pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)。②用BamHI、EcoR I雙酶切S100A4純化后的PCR產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與pBV_220質(zhì)粒 連接并轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coli DH5 α中，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。(5)在大腸桿菌DH5ci中進(jìn)行高效表達(dá)①將陽(yáng)性單克隆菌，接種于5mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，30°C，180r/m過(guò)夜培養(yǎng)。②次日將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1 50的比例重新轉(zhuǎn)接500mL的LB (含Amp)培養(yǎng)基 中。30°C條件下，180rpm振蕩培養(yǎng)至A6Q(M).8后，升溫至42°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4_4.5h后， 以5000rpm收集菌體，用后續(xù)純化用液體重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎菌體。超聲破碎條 件功率200W，超聲處理10s，間隔15s，循環(huán)90次。③破碎后 ，4°C 6000rpm離心15min，分別收集上清和沉淀。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)的方法。本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，通過(guò)設(shè)計(jì)并合成優(yōu)化S100A4序列的引物，以設(shè)計(jì)的引物互為模板，PCR擴(kuò)增優(yōu)化后獲得了能高效表達(dá)的優(yōu)化S100A4基因與表達(dá)載體連接，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102021171SQ200910070459
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者佘曉俊, 劉子泉, 劉洪濤, 崔博, 張娜, 徐傳香, 王天輝, 陳學(xué)偉, 馬強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所