專利名稱：抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達的siRNA重組慢病毒及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學、生物醫(yī)藥及基因工程技術領域，具體涉及利用慢病毒 (Retrovirus)介導的RNA干擾技術，構建針對人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)的慢病 毒干擾體系(Retro-Heph)，及在制備鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。
背景技術：
RNAi指的是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生 降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象。2001年，Tuschl等將短的siRNA導入到哺乳動物細胞中并由此解決了在哺乳細胞 內導入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應，由此拓展了 RNAi在基因治療上應用前景。RNAi 機制普遍存在于生物中，因此被認為是進化上相對保守的基因表達調控機制。一種假說 為，RNAi機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。目前發(fā)現(xiàn)，RNAi機 制中的相關一些因子如內源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調 控，其范圍已經超越了 PTGS (post transcriptional gene silencing)，如 RNAi 機制同樣 參與了轉錄水平上的基因表達調控過程中。由外界導入的長的雙鏈RNA首先被稱作Dicer 并具有RNaselll活性的RNA酶切割成21 23堿基對的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作 small interferingRNAkiRNA)，其特征是3'端相對于互補鏈突出兩個堿基。完成上述過 程后，siRNA上結合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA_induced silencingcomplex)的 RNA-蛋白復合物。在RISC復合物中，siRNA依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉換為單鏈，進 而RISC被活化。活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(guide strand)，序列特異性地結 合在標靶mRNA上并切斷標靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究的重要工具。 大多數(shù)藥物屬于靶標基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這功能 丟失(L0F)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(G0F)方法更具優(yōu)勢。因此，RNAi在今天的制藥 產業(yè)中是藥物靶標確認的一個重要工具。同時，那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA 本身還可以被進一步開發(fā)成為RNAi藥物。在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被 用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。然而RNA干擾片段表達持續(xù)以及表達效率等重要問題阻礙了 RNA干擾技術運用 于臨床治療，要將RNA干擾用于基因治療，必須解決其靶向性、安全性以及表達持續(xù)性的問 題。shRNA 即短發(fā)夾 RNA (short hairpin RNA)。在 RNAi 感染過程中，產生 dsRNA 的一 個有效方法就是在體內表達一個短發(fā)夾RNA，這種shRNA包含兩個短反向重復序列(其中一 個與目的基因互補)，中間由一個loop序列分隔，組成發(fā)夾結構。在體內shRNA可以被加工 成siRNA，從而降解目的基因抑制其表達。膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)介紹
早在1962年，Grewal等就在放射誘導的突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了一種新型的遺傳性小 細胞低色素性貧血。由于其與X染色體相關，這種小鼠被稱為sla(伴性貧血)小鼠。Vulpe 等(1999)通過基因譜研究，證實了 sla小鼠X染色體上缺陷基因的存在。此基因被命名為 Hephaestin (HP或Heph)，取自希臘神話中的金屬工藝之神H印haestus。Heph 的分布HP在體內的分布與鐵的吸收相關。免疫雜交技術和Westen印跡法、Northern印 跡法顯示在成年小鼠體內HP蛋白及mRNA在整段小腸及結腸內高表達，在腎、肺、皮膚、肝、 胎盤及其他組織中也有表達。原位雜交技術顯示在HP基因高表達的小腸區(qū)，絨毛處信號極 強，而隱窩處幾乎沒有陽性信號。這與鐵在小腸絨毛處的吸收相一致。但HP在結腸高表達， 而后者在鐵吸收過程中的作用甚微。在腸上皮細胞中，HP蛋白定位于基側膜，同時存在于 細胞內的核周區(qū)；在培養(yǎng)的大鼠小腸細胞系IEC26中，HP蛋白主要分布于核周區(qū)，在細胞漿 中也有少量存在。H印h的功能HP作為亞鐵氧化酶的直接證據(jù)來自于對酵母菌的研究。研究證明，F(xiàn)et3p (外膜上 的亞鐵氧化酶)與Ftrlp (鐵透性酶)聯(lián)合作用，參與三價鐵的吸收過程。Fet3基因缺陷的 酵母菌會出現(xiàn)鐵缺乏，且不能在低鐵培養(yǎng)基上生存，但外源性表達的HP即可部分糾正酵母 菌的缺鐵狀態(tài)。以上說明，HP可能與Fet3p相似，通過與一種膜轉運體共同作用來參與鐵 的跨膜轉運。此外，HP只有一個跨膜區(qū)域，它不可能同時是一種跨膜的鐵轉運體介導鐵的 轉運過程，也要求其必須與某種鐵轉運體協(xié)同作用使鐵穿過細胞膜。目前認為這種轉運體 為Ferroportinl (FP1)，又稱Iregl、Mtpl。FP1在網狀內皮細胞系統(tǒng)存在的肝、脾、胎盤等 組織表達，提示其與鐵的釋放相關。與HP相似，F(xiàn)P1基因在近端小腸內高表達，且僅在成熟 的腸上皮細胞中高表達，免疫組化技術顯示FP1蛋白主要定位于細胞的基側膜，細胞內也 有少量存在。FP1與HP共同分布于近端小腸，提示HP與FP1在腸上皮細胞中協(xié)同作用于鐵 的跨膜轉運。HP在細胞內的分布，提示其可能在細胞內參與鐵的氧化過程。如二價鐵離子 需要被氧化成三價，才能與鐵的主要儲存部位即鐵蛋白結合。此外，螯合三價鐵的轉鐵蛋白 在細胞內的生理作用也可能需要HP的鐵氧化作用。由于HP基因在整段小腸和結腸中高表 達，而遠端小腸和結腸并不是鐵吸收的主要部位，這就提示了 HP的其他功能或在遠端腸道 補吸收鐵的功能。H印h對細胞內鐵濃度的調節(jié)HP作為鐵轉運相關蛋白，其表達首先受機體鐵需求量的調節(jié)。鐵在體內的濃度主 要受鐵儲存量和紅細胞生成速率的影響。腸上皮細胞鐵的轉運量與整體鐵需求量成正相 關。當機體缺鐵、溶血和缺氧時都可刺激鐵的吸收。研究表明，整體鐵水平信號先作用于隱 窩上皮細胞，在其分化為成熟腸上皮細胞并移至絨毛頂端后，細胞對該信號做出應答，使基 側緣鐵轉出蛋白表達水平發(fā)生變化，從而影響到成熟腸上皮細胞內鐵的濃度，最終決定了 刷狀緣DMT1等轉入蛋白上調或下調鐵的吸收。在鐵的吸收過程中，由于基側緣轉運的鐵不 可能比刷狀緣吸收的鐵多，故目前認為，基側緣鐵的轉運是鐵吸收過程的限速步驟。在小 腸，HP的最大調節(jié)限度是正常狀態(tài)下的2倍，F(xiàn)P1的調節(jié)范圍約3 5倍，而DMT1的調節(jié)能 力則要大得多。刷狀緣鐵轉運成分對鐵濃度變化敏感而迅速的反應，可以使基側緣轉運分 子轉運鐵的速度恒定，從而保證機體對鐵的需求。所以整體鐵信號主要通過基側緣的轉運成分HP和FP1起調節(jié)作用。在缺鐵的病人及動物模型中，十二指腸的鐵轉運成分如Dcytb、 DMTUFP1及HP的表達都增高，從而保證鐵的吸收。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術的上述問題即RNA干擾片段表達持續(xù)以及表達 效率等重要問題，提供一種能夠有效抑制體內人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達、從而調 節(jié)體內鐵水平的小干擾性RNA(siRNA)。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼含有上述小干擾性RNA的shRNA(短發(fā)夾RNA)的 DNA。本發(fā)明的再一目的在于提供具有優(yōu)良的靶向性、安全性以及持續(xù)表達上述shRNA 并進而抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達的重組慢病毒。本發(fā)明的再一目的在于提供上述小干擾性RNA、DNA以及重組慢病毒在制備藥物 方面的應用。用途和藥物為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達的小干擾性 RNA(siRNA)，所述小干擾性RNA與人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因mRNA反向互補，其長度為 19-27bp。 優(yōu)選地，所述小干擾性RNA含有以下序列Seq ID No. 1 :5，-AGGGGTGGATAAAGAATTC-3，本發(fā)明進一步公開了一種編碼含有上述小干擾性RNA的正義鏈及反義鏈的shRNA 的 DNA。優(yōu)選地，所述DNA還含有啟動子及PolyA終止信息序列，啟動子優(yōu)選為HI啟動子。本發(fā)明還公開了一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達的重組慢病 毒，所述重組慢病毒含有上述DNA以及慢病毒載體。優(yōu)選地，所述慢病毒載體為自身失活慢病毒載體(SIN)。本發(fā)明進一步公開了上述小干擾性RNA、上述DNA以及上述重組慢病毒在制備用 于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。所述鐵代謝紊亂疾病如老年性癡呆、帕金森綜合癥、神經退行性疾病等。由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果本發(fā)明的小干擾性RNA、編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠有效抑制體內人膜 鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達、抑制鐵的吸收與代謝，并降低體內的血清鐵水平，從而達到 治療鐵代謝相關疾病的目的。 特別地，本發(fā)明的重組慢病毒通過選擇第三代慢病毒載體——自身滅活慢病毒載 體(SIN)，大大的提高了載體的安全性以及靶向性。慢病毒載體可以選擇性插入染色體中， 不會出現(xiàn)插入失活的情況。慢病毒攜帶shRNA進入靶細胞，可以整合入細胞的基因組，持續(xù) 長期的表達相關shRNA，而不會引起對細胞的毒害作用。本發(fā)明的慢病毒干擾體系具有優(yōu)良 的靶向性、安全性以及表達持續(xù)性，降低血清鐵的濃度，并且對正常細胞無任何毒副作用。 通過多次實驗，均證明本發(fā)明的慢病毒干擾體系能有效的調節(jié)鐵在體內的代謝與吸收。
本發(fā)明設計的shRNA經過體內及體外實驗證明，能有效的抑制HEPH表達量的95%以上，有效的調節(jié)血清鐵的水平。


圖1是Retro-HEPHi系統(tǒng)構建流程圖；圖2是Retro-HEPHi系統(tǒng)感染體細胞后，HEPH蛋白的表達情況圖；圖3是通過高鐵飼料飼養(yǎng)SD大鼠，構建高血清鐵動物模型，然后利用 Retrovirus-HEPHi系統(tǒng)進行體內實驗，降低血清鐵水平結果圖。
具體實施例方式本發(fā)明利用鐵代謝相關疾病的發(fā)病機理，有針對性的調節(jié)HEPH的表達，設計特定 的小干擾性RNA以及編碼shRNA的DNA，從而降低血清鐵對細胞的損害。本發(fā)明的小干擾 性RNA以及shRNA所編碼的DNA，能特異性的識別序列AGGGGTGGATAAAGAATTC，該序列位于 HEPH(AJ296162)第 2379-2397 堿基處。要將RNA干擾技術運用于臨床治療，就需要解決RNA干擾片段表達持續(xù)以及表達 效率等重要問題。我們利用失活慢病毒載體攜帶RNA干擾片段的DNA模板，其在體內轉錄 成shRNA，完美的解決了 RNA干擾基因治療的靶向性、安全性以及表達持續(xù)性的問題。本發(fā)明通過合成干擾片段，將片段連接至慢病毒載體當中。轉染重組體入Phoenix 細胞，獲取病毒上清，體外以及體內實驗證明能夠有效抑制HEPH。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，構建了人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)的慢 病毒干擾體系(Retro-HEPHi)，并取得了良好的抑制效果。下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例1根據(jù)人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)序列(匪000617. 2)，設計模板鏈與編 碼鏈。分別與5’端加上Bglll與Xhol酶切位點，送Invitrogen公司合成序列。經過篩選， 獲得干擾效果最為顯著的本發(fā)明的HEPH干擾片斷序列如下優(yōu)選的實施例模板鏈(SeqID No. 2)5’ -GATCCCCAGGGGTGGATAAAGAATTCTTCAAGAGAGAATTCTTTATCCACCCCTTTTTTTA-3’編碼鏈(SeqID No. 3)5’ -AGCTTAAAAA AGGGGTGGATAAAGAATTC TCTCTTGAAATTCTTTATCCACCCCT GGGG-3，Retro-HEPHi 系統(tǒng)構建將合成的HEPH干擾片段(Seq ID No. 2及Seq ID No. 3)進行退火。具體步驟如下1.建立退火系統(tǒng)5ul 10x 退火 buffer2nmole 模板鏈 Seq ID No. 32hmole 編碼鏈 Seq ID No. 4用三蒸水補足至50ul。2.放入 PCR 儀，95 °C 5 分鐘，75 °C 5 分鐘，55 °C 5 分鐘，42 °C 5 分鐘，37 °C 15 分鐘，
之后逐步遞減溫度至室溫。
3.制12% lx TAE聚丙烯酰胺膠，取10ul上述退火產物跑膠200Vlh。銀染觀察退 火條帶。置于-80°C保存退火產物。酶切(Xbal與Xhol)慢病毒載體，膠純化回收后，用T4連接酶與退火產物室溫 連接24小時，經轉化篩選之后，獲得正確克隆。送Irwitrogen公司測序鑒定，命名為 Retro-HEPHi系統(tǒng)。具體操作步驟如下1.構建質粒酶切體系Bgl II10UXho I10UlOx Buffer5ulBSA0. 5ulRetro 質粒lOul用水補足50ul，37°C，2h。3.利用試劑盒(invitrogen)膠純化上述酶切產物。4.構建連接系統(tǒng)10x Buffer2ulT4 連接酶lulRetro 酶切產物 lul退火產物5ul用水補足20ul，16°C，16h。4.取5ul連接產物轉化感受態(tài)細胞，涂板后，氨芐青霉素篩選。5.挑取陽性克隆，小量擴增質粒。6.用EcoR I與Xho I酶切鑒定質粒，選擇陽性結果質粒，測序保存。重組慢病毒Retro-HEPHi的生產流程1、接種 Phoenix 細胞 1. 5X107 個細胞于 9cm 培養(yǎng)皿(Corning)中，37°C，5% C02 培 養(yǎng)過夜；2、轉染前20分鐘換新鮮培養(yǎng)基；3、取20ul上述Retro-HEPHi與DMEM培養(yǎng)基500ul混勻，標記為A管，另取20ul 脂質體與500ul DMEM培養(yǎng)基混勻，標記為B管。將A管與B管混勻，室溫放置30min，將混 合物輕輕加入第1步中的9cm培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；5、24小時后加7. 5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；6、收集細胞上清并用0.45um濾器過濾，細胞可以擴大培養(yǎng)，持續(xù)收取病毒上清。7、測定病毒上清滴度，用PH8. OTris-HCl調整細胞滴度至1000VP/ml。8、包裝入2ml西林瓶中(每瓶含1ml)，保存于_80°C。9、對病毒進行熱源檢測、微生物檢測，確保無熱源，無細菌、真菌、野生病毒污染。Retro-HEPHi系統(tǒng)構建流程如圖1所示。重組慢病毒Retro-HEPHi體外實驗復蘇神經元細胞株P12，接種于6孔板，每孔1X106個。取Retro-HEPHi慢病毒液， 按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12細胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混 勻，以充分感染細胞株，分別處理0h、6h、12h、24h、48h，收集細胞，利用real-time PCR技術
7進行定量測定HEPH mRNA表達情況，以Oh為對照組，可見HEPH的表達在12h之后受到明顯 的抑制。如圖2。重組慢病毒Retro-HEPHi體外鐵釋放實驗復蘇神經元細胞株P12，接種于6孔板，每孔1X106個。將細胞分成兩組，一組加 PBS，一組加PLT-HEPHi慢病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加 入P12細胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻，以充分感染細胞株。按照0h、12h、24h、48h的時間點 進行Fe55同位素釋放實驗，發(fā)現(xiàn)在24小時后，鐵的釋放開始受到抑制，48小時后出現(xiàn)明顯 抑制。如圖3.以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。能夠與HEPH的mRNA反向互補的所有其他19-27個堿基序列的小干擾性RNA、編 碼此類小干擾性RNA的相應shRNA的DNA模板、以及含有這些DNA模板的重組慢病毒也同 樣可以實施到本發(fā)明中。
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權利要求
一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達的小干擾性RNA，其特征在于所述小干擾性RNA與人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因mRNA反向互補，其長度為19-27bp。
2.根據(jù)權利要求1所述一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達的小干擾性RNA， 其特征在于所述小干擾性RNA含有以下序列Seq ID No. 1 :5’ -AGGGGTGGATAAAGAATTC-3，。
3.一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述shRNA是含有權利要求1或2所述的小干 擾性RNA的正義鏈或反義鏈的shRNA。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述DNA含有序列表中 Seq ID No. 3和/或Seq ID No. 4所示的序列。
5.根據(jù)權利要求3所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述DNA還含有HI啟 動子及PolyA終止信息序列。
6.一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達的重組慢病毒，其特征在于所述重組 慢病毒含有權利要求3 5中任意一項所述的DNA以及慢病毒載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達的重組慢病毒， 其特征在于所述慢病毒載體為自身失活慢病毒載體(SIN)。
8.權利要求1或2中任意一項所述的小干擾性RNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的 藥物中的應用。
9.權利要求3至5中任意一項所述的DNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。
10.權利要求6或7中任意一項所述的重組慢病毒在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的 藥物中的應用。
11.一種藥物組合物，包括具有權利要求1或2中任一項所述的編碼shRNA的DNA。
12.—種藥物組合物，包括具有權利要求3至5中任一項所述的編碼shRNA的DNA。
13.一種藥物組合物，包括具有權利要求6或7中任一項所述的一種抑制人膜鐵轉運蛋 白輔助蛋白基因表達的重組慢病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)表達的小干擾性RNA，所述小干擾性RNA與人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因mRNA反向互補，長度為19-27bp。本發(fā)明進一步公開了編碼所述小干擾性RNA的相應shRNA的DNA序列以及能表達所述shRNA的重組慢病毒。本發(fā)明的小干擾性RNA、編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠有效抑制體內人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白表達、抑制鐵的釋放與代謝，調節(jié)體內的血清鐵水平，從而達到治療鐵代謝相關疾病的目的。
文檔編號C12N7/01GK101875931SQ20091010700
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權日2009年4月28日
發(fā)明者柯亞, 葛嘯虎, 錢忠明 申請人:香港理工大學深圳研究院