一種改造轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap2p促進(jìn)釀酒酵母利用支鏈氨基酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種改造轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap化促進(jìn)釀酒酵母利用支鏈氨基酸的方法，屬于 微生物遺傳和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap化是一種位于細(xì)胞膜上的支鏈氨基酸特異性透性酶，轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸 包括亮氨酸化eu)、異亮氨酸（lie)和鄉(xiāng)氨酸（Val)，對(duì)于Leu具有很高的親和力。泛素化 是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式之一，被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)將進(jìn)入泛素-蛋白酶體途徑， 并進(jìn)一步被液泡內(nèi)的蛋白酶所降解。Bap化受到泛素化調(diào)控，即Bap化的泛素化位點(diǎn)（賴 氨酸）被泛素所識(shí)別并標(biāo)記，并最終被蛋白酶所降解。因此，解除或減輕Bap化的泛素化修 飾，從而減少其降解，將有助于其在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定存在并發(fā)揮氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
[0003] 亮氨酸、異亮氨酸和鄉(xiāng)氨酸等支鏈氨基酸為釀酒酵母非偏好型氮源，當(dāng)培養(yǎng)基中 存在偏好型氮源（谷氨酷胺、天冬酷胺、谷氨酸等）時(shí)，釀酒酵母優(yōu)先利用偏好型氮源；只有 當(dāng)偏好型氮源耗盡時(shí)，才開始利用非偏好型氮源。釀酒酵母運(yùn)種優(yōu)先利用偏好型氮源的方 式會(huì)帶來(lái)許多不利的結(jié)果，如（1)不利于對(duì)氮源的充分利用，（2)有害代謝產(chǎn)物（如氨基甲 酸乙醋）的積累等。因此，減弱支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap化受到的泛素化調(diào)控，使其能夠在 細(xì)胞膜上發(fā)揮穩(wěn)定功能，有助于提高支鏈氨基酸的利用，從而有助于氮源的全面充分利用， 且不會(huì)造成氨基甲酸乙醋等有害產(chǎn)物的積累。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種改造轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap化促進(jìn)釀酒酵母利用支鏈氨 基酸的方法。 陽(yáng)0化]所述的改造轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap化，是消除Bap化的泛素化位點(diǎn)，從而解除Bap化所受到 的泛素化調(diào)控。 陽(yáng)006]所述的消除Bap化的泛素化位點(diǎn)，是將其第12和/或13和/或38和/或69位 賴氨酸突變?yōu)榫彼帷?陽(yáng)007]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap化的核巧酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的將賴氨酸突變?yōu)榫彼?，是不同的突變位點(diǎn) 的組合。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的將賴氨酸突變?yōu)榫彼?，是將?2、13、38和 69位賴氨酸全部突變?yōu)榫彼?，得到突變體Bap化
[0010] 所述的支鏈氨基酸指的是亮氨酸、異亮氨酸和鄉(xiāng)氨酸。
[0011] 本發(fā)明對(duì)釀酒酵母支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了遺傳改造，弱化了其受到的泛素化 調(diào)控，提高了其對(duì)支鏈氨基酸的利用。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1定點(diǎn)突變的組合方式
[0013] 圖2Bap化系列突變體支鏈氨基酸利用情況
【具體實(shí)施方式】
[0014] 材料與方法 陽(yáng)01引 下述實(shí)施例所用釀酒酵母菌株為S.cerevisiaeCEN.PK2-lD-Aubi4(MATa ura3-52 ;t巧 1-289 ;leu2-3, 112 ;his3A1 ;Aubi4: :LEU2 ;MAL2-8c;SUC2)單倍體模式菌 株，釀酒酵母CEN.PK2-1D-Δubi4 由釀酒酵母CEN.PK2-1D(MATαura3-52 ;t巧 1-289 ; leu2-3, 112 ;his3A1 ;ML2-8c;SUC2)敲除基因UBI4 改造而來(lái)，釀酒酵母CEN.PK2-1D購(gòu)自 抓R0SCARF(化anlrfud，Germany)，其他操作均為常規(guī)分子生物學(xué)操作。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] YNB液體培養(yǎng)基：1. 74g/LYeastNitrogenBasewithoutAminoAcidsand AmmoniumSulfate，20g/LD-glucose，5g/L(NH4)2S〇4。亮氨酸、尿喀晚雙缺陷型培養(yǎng)基 (DM-leu，ura) :YNB培養(yǎng)基中添加50μg/mL組氨酸、50μg/mL色氨酸。固體培養(yǎng)基為相 應(yīng)的液體培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂粉。
[0018] W釀酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Δubi4基因組DNA為模版，使用引物對(duì) BAP2-F/BAP2-R(表1)擴(kuò)增得到基因BAP2 (沈QIDNO. 1)。BAP2經(jīng)挑取單菌落及Sanger測(cè) 序驗(yàn)證正確后，通過限制性酶切位點(diǎn)Notl和Smal連接至載體P化Detecl6(SEQIDNO. 2)， 得到重組表達(dá)載體郵bDetecl6-BAP2。重組表達(dá)載體使用引物對(duì)郵bDeteclG-ver-F/ R(表1)進(jìn)行驗(yàn)證。挑選測(cè)序正確的重組質(zhì)粒利用醋酸裡轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeCEN. PK2-1D-Aubi4,涂布DM-leu，ura固體培養(yǎng)基。于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4d，挑選單菌落進(jìn)行 菌落PCR驗(yàn)證后接種相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)接W便于后續(xù)試驗(yàn)。
[0019] 釀酒酵母的醋酸裡轉(zhuǎn)化法：將S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Aubi4在YTO培養(yǎng)基中 30°C，200巧m培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)接至新鮮的40血YTO培養(yǎng)基中，并使終濃度為106cell·血1。 30°C，200巧m培養(yǎng)約化，待菌體生長(zhǎng)至濃度為1. 2-1. 5X107cell·血1(0〇6。。= 1. 2-1. 5)。 收集菌體于4000rpm4°C離屯、5min收集全部細(xì)胞，用1倍體積的預(yù)冷無(wú)菌水洗涂細(xì)胞。 4000巧m4°C離屯、5min收集細(xì)胞，用1/2體積的預(yù)冷無(wú)菌水洗涂細(xì)胞。4000巧m4°C離 屯、5min收集細(xì)胞，加入4mL轉(zhuǎn)化液并用移液槍將細(xì)胞和轉(zhuǎn)化液混合均勻，室溫解育30min。 4000巧m4°C離屯、5min收集細(xì)胞，用1血Imol·L1山梨醇懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1. 5血離屯、 管中。室溫1300化pm離屯、30s，棄上清，重復(fù)該步驟兩次。用100μLImol.Li山梨醇懸 浮細(xì)胞，使終濃度為l〇"cell·血1。取40μΙ制備的感受態(tài)細(xì)胞并加入5yL(l〇〇yg)質(zhì) ?；蚓€性DNA，混合后轉(zhuǎn)入冰上預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰上解育5min。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn) 儀中，參數(shù)設(shè)定為1. 5kV、25μΡ，電擊后立即加入ImLlmol·L1山梨醇。用移液槍混合均勻 后（輕輕吹吸，不要產(chǎn)生氣泡），將得到的電擊混合物轉(zhuǎn)移至1. 5mL離屯、管中，30°C靜置解育 比。取0. 2mL涂布相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板，置于30°C培養(yǎng)箱3-4d后觀察結(jié)果。
[0020] 表1P化Detecl6-BAP2表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證所用引物
[0021]
[0022] 泛素化位點(diǎn)的定點(diǎn)突變：采用定點(diǎn)突變的方法，將相應(yīng)的泛素化位點(diǎn)（賴氨 酸）突變?yōu)榫彼帷２捎每烨忻富痭l消化模板的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。首先，W重組質(zhì)粒 P化Detecl6-BAP2為模板，使用2XSuperP化MixDNA聚合酶擴(kuò)增完整的重組質(zhì)粒。PCR產(chǎn) 物經(jīng)柱回收后添加化nl于37°C，反應(yīng)比，由于菌體自身的質(zhì)粒模板會(huì)被甲基化修飾，而擴(kuò) 增的質(zhì)粒則不會(huì)被甲基化。通過化nl消化后就可W消除原始模板質(zhì)粒。將酶切反應(yīng)后的 混合液于PCR儀80°C，5min使酶失活后即可轉(zhuǎn)化E.coliJM109。轉(zhuǎn)化體系涂布含有適量氨 節(jié)青霉素的LB平板，于37°C培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證， 驗(yàn)證引物采用郵bDetecl6-ver-F/R。經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證正確的單克隆繼續(xù)用于下一輪突 變，直到完成四重突變，定點(diǎn)突變的位點(diǎn)順序如圖1。
[0023] 表2P化Detecl6系列表達(dá)載體定點(diǎn)突變所用引物
[0024]
[0025] 泛素化位點(diǎn)消除對(duì)支鏈氨基酸代謝的影響：分別將活化的CEN. PK2-lD-Aubi4[pUbDetecl6]、CEN.PK2-lD-Aubi4[pUbDetecl6-Bap2p]、CEN. PK2-1D-Δubi4 [pUbDetecl6-Bap化"2' "R]、cen.PK2-1D-Δubi4 [pUbDetecl6-Bap^Ki2' 口'3 SK]、CEN.PK2-1D-Aubi4[pUbDetec16-Bap^"2'n'ew]接種ynb液體培養(yǎng)基（不添加錠鹽）， 并在培養(yǎng)基中添加Leu、Ile、Val各lOmM。于30°C，200巧m培養(yǎng)周期4她，分別在化和4她 取樣檢測(cè)支鏈氨基酸代謝情況。
[0026] 從結(jié)果（圖?？蒦看出，相對(duì)于陰性對(duì)照CEN.PK2-lD-Aubi4[pUbDetecl6]，工 程菌株對(duì)3種支鏈氨基酸的利用率隨著泛素化位點(diǎn)突變數(shù)量的增加不斷增加，且四重突變 體CEN.PK2-lD-Aubi4[pUbDetecl6-Bap^Ki2'i3'38'69K]對(duì)支鏈氨基酸的利用率最高，分別達(dá) 到 30. 1 + 1.5% (Val)、41. 5±1.8 % (lie)和 30. 8 + 0. 8 % 化eu)，相對(duì)于對(duì)照組分別提高 了 88. 1%、48. 2%和47. 4%。該結(jié)果表明，Bap化泛素化位點(diǎn)的改造對(duì)于提高基因工程菌 株支鏈氨基酸的利用取得了顯著的效果。
[0027] 雖然本發(fā)明已W較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)釀酒酵母利用支鏈氨基酸的方法，其特征在于，是消除釀酒酵母轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Bap2p的泛素化位點(diǎn)，從而解除Bap2p所受到的泛素化調(diào)控。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的消除Bap2p的泛素化位點(diǎn)，是將其 第12和/或13和/或38和/或69位賴氨酸突變?yōu)榫彼帷?. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的消除Bap2p的泛素化位點(diǎn)，是 將第12、13、38和69位賴氨酸全部突變?yōu)榫彼帷?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的支鏈氨基酸指的是亮氨酸、異亮氨 酸和纈氨酸。5. -種利用組氨酸能力提高的釀酒酵母，其特征在于，所述釀酒酵母的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Bap2p的泛素化位點(diǎn)被消除，從而解除Bap2p所受到的泛素化調(diào)控。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的釀酒酵母，其特征在于，是將釀酒酵母的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap2p第 12和/或13和/或38和/或69位賴氨酸突變?yōu)榫彼帷?. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的釀酒酵母，其特征在于，是將釀酒酵母的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap2p第 12、13、38和69位賴氨酸全部突變?yōu)榫彼帷?. 權(quán)利要求5或6所述的釀酒酵母在黃酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改造轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bap2p促進(jìn)釀酒酵母利用支鏈氨基酸的方法，屬于微生物遺傳和分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明消除Bap2p的泛素化位點(diǎn)，從而解除Bap2p所受到的泛素化調(diào)控。弱化了釀酒酵母受到的泛素化調(diào)控，提高了其對(duì)支鏈氨基酸的利用。
【IPC分類】C12N1/19, C12G3/02, C12R1/865, C12N15/81
【公開號(hào)】CN105368867
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510847226
【發(fā)明人】周景文, 陳堅(jiān), 呂永坤, 堵國(guó)成, 李應(yīng)宇
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年11月27日