專利名稱：重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種攜帶人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白 (Hephaestin)基因在生物體內(nèi)能夠自主表達(dá)的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒、 其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
早在1962年，Grewal等就在放射誘導(dǎo)的突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了一種新型的遺傳性小 細(xì)胞低色素性貧血。由于其與X染色體相關(guān)，這種小鼠被稱為sla(伴性貧血)小鼠。Vulpe 等(1999)通過基因譜研究，證實(shí)了 sla小鼠X染色體上缺陷基因的存在。此基因被命名為 Hephaestin (HP或H印h)。放射雜交圖譜和體細(xì)胞的PCR技術(shù)證實(shí)人類HP基因位于X染色 體上。Syed等(2002)通過cD2NA克隆和染色體X的序列分析報(bào)道了 HP基因具有一個(gè)開放 式可讀框架，大約lOOkb的基因編碼約1158個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。HP蛋白在羧基末端的 86個(gè)氨基酸包含了一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，說明它是一種膜蛋白。一、H印h的分布HP在體內(nèi)的分布與鐵的吸收相關(guān)。免疫雜交技術(shù)和Westen印跡法、Northern印 跡法顯示在成年小鼠體內(nèi)HP蛋白及mRNA在整段小腸及結(jié)腸內(nèi)高表達(dá)，在腎、肺、皮膚、肝、 胎盤及其他組織中也有表達(dá)。原位雜交技術(shù)顯示在HP基因高表達(dá)的小腸區(qū)，絨毛處信號(hào)極 強(qiáng)，而隱窩處幾乎沒有陽性信號(hào)。這與鐵在小腸絨毛處的吸收相一致。在腸上皮細(xì)胞中，HP 蛋白定位于基側(cè)膜，同時(shí)存在于細(xì)胞內(nèi)的核周區(qū)；在培養(yǎng)的大鼠小腸細(xì)胞系IEC26中，HP蛋 白主要分布于核周區(qū)，在細(xì)胞漿中也有少量存在。二、H印h的功能HP作為亞鐵氧化酶的直接證據(jù)來自于對(duì)酵母菌的研究。研究證明，F(xiàn)et3p (外膜上 的亞鐵氧化酶)與Ftrlp (鐵透性酶)聯(lián)合作用，參與三價(jià)鐵的吸收過程。Fet3基因缺陷的 酵母菌會(huì)出現(xiàn)鐵缺乏，且不能在低鐵培養(yǎng)基上生存，但外源性表達(dá)的HP即可部分糾正酵母 菌的缺鐵狀態(tài)。以上說明，HP可能與Fet3p相似，通過與一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)體共同作用來參與鐵 的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，HP只有一個(gè)跨膜區(qū)域，它不可能同時(shí)是一種跨膜的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)鐵的 轉(zhuǎn)運(yùn)過程，也要求其必須與某種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)同作用使鐵穿過細(xì)胞膜。目前認(rèn)為這種轉(zhuǎn)運(yùn)體 為Ferroportinl(FPl)，又稱Iregl、Mtpl。FP1在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)存在的肝、脾、胎盤等 組織表達(dá)，提示其與鐵的釋放相關(guān)。與HP相似，F(xiàn)P1基因在近端小腸內(nèi)高表達(dá)，且僅在成熟 的腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，免疫組化技術(shù)顯示FP1蛋白主要定位于細(xì)胞的基側(cè)膜，細(xì)胞內(nèi)也 有少量存在。FP1與HP共同分布于近端小腸，提示HP與FP1在腸上皮細(xì)胞中協(xié)同作用于鐵 的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。HP在細(xì)胞內(nèi)的分布，提示其可能在細(xì)胞內(nèi)參與鐵的氧化過程。如二價(jià)鐵離子 需要被氧化成三價(jià)，才能與鐵的主要儲(chǔ)存部位即鐵蛋白結(jié)合。此外，螯合三價(jià)鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白 在細(xì)胞內(nèi)的生理作用也可能需要HP的鐵氧化作用。由于HP基因在整段小腸和結(jié)腸中高表 達(dá)，而遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸并不是鐵吸收的主要部位，這就提示了 HP的其他功能或在遠(yuǎn)端腸道補(bǔ)吸收鐵的功能。三、H印h對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的調(diào)節(jié)HP作為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，其表達(dá)首先受機(jī)體鐵需求量的調(diào)節(jié)。鐵在體內(nèi)的濃度主 要受鐵儲(chǔ)存量和紅細(xì)胞生成速率的影響。腸上皮細(xì)胞鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)量與整體鐵需求量成正相 關(guān)。當(dāng)機(jī)體缺鐵、溶血和缺氧時(shí)都可刺激鐵的吸收。研究表明，整體鐵水平信號(hào)先作用于隱 窩上皮細(xì)胞，在其分化為成熟腸上皮細(xì)胞并移至絨毛頂端后，細(xì)胞對(duì)該信號(hào)做出應(yīng)答，使基 側(cè)緣鐵轉(zhuǎn)出蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，從而影響到成熟腸上皮細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度，最終決定了 刷狀緣DMT1等轉(zhuǎn)入蛋白上調(diào)或下調(diào)鐵的吸收。在鐵的吸收過程中，由于基側(cè)緣轉(zhuǎn)運(yùn)的鐵不 可能比刷狀緣吸收的鐵多，故目前認(rèn)為，基側(cè)緣鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)是鐵吸收過程的限速步驟。在小 腸，HP的最大調(diào)節(jié)限度是正常狀態(tài)下的2倍，F(xiàn)P1的調(diào)節(jié)范圍約3 5倍，而DMT1的調(diào)節(jié)能 力則要大得多。刷狀緣鐵轉(zhuǎn)運(yùn)成分對(duì)鐵濃度變化敏感而迅速的反應(yīng)，可以使基側(cè)緣轉(zhuǎn)運(yùn)分 子轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的速度恒定，從而保證機(jī)體對(duì)鐵的需求。所以整體鐵信號(hào)主要通過基側(cè)緣的轉(zhuǎn)運(yùn) 成分HP和FP1起調(diào)節(jié)作用。在缺鐵的病人及動(dòng)物模型中，十二指腸的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)成分如Dcytb、 DMTUFP1及HP的表達(dá)都增高，從而保證鐵的吸收。但是使用外源蛋白治療存在不穩(wěn)定、活性低、成本高以及免疫原性等缺點(diǎn)，而且難 以保證發(fā)揮藥理作用時(shí)蛋白質(zhì)二級(jí)以及高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的自然特性，所以理想的方法是能在 患者體內(nèi)自主表達(dá)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白，提升體內(nèi)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白的水平，調(diào)節(jié) 細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度，降低鐵對(duì)于細(xì)胞的毒性，達(dá)到治療神經(jīng)退行性疾病等鐵代謝相關(guān)疾病的 目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種在生物體內(nèi)能夠自主表達(dá) 膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白從而提升體內(nèi)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)水平的重組人 膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(匪000617. 2)腺病毒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒的制 備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒在制 備藥物方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(Ad-H印h)，其包含 有人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(hephaestin)基因與腺病毒載體。所述人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因插入所述腺病毒基因組中。所述人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因優(yōu)選為通道型人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因。更優(yōu)選地，所述人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因的表達(dá)讀碼框包含巨細(xì)胞病毒 (CMV)啟動(dòng)子、通道型人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)基因以及下游的polyA信號(hào)。所述腺病毒為缺陷型腺病毒。優(yōu)選為1型腺病毒。更優(yōu)選地為缺失了 E1區(qū)的缺陷型腺病毒。本發(fā)明還提供了上述重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒的制備方法，所述方法包括步驟一、將人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)基因與所述腺病毒的 Ad-track穿梭質(zhì)粒連接構(gòu)建Ad-track-h印haestin重組載體；步驟二、使所述Ad-track-h印haestin重組載體線性化；步驟三、腺病毒的骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；步驟四、Ad-track-h印haestin與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組；步驟五、使重組的病毒骨架質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。其中步驟物的轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)選為HEK293細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒在制備用于 治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述鐵代謝紊亂疾病為任何類型鐵過載引起的疾病。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備了以下技術(shù)效果本發(fā)明針對(duì)HEPH在體內(nèi)鐵代謝中的獨(dú)特地位，構(gòu)建HEPH重組腺病毒以基因替換 的模式，可以針對(duì)性的對(duì)體內(nèi)鐵水平代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，本發(fā)明的HEPH重組腺病毒，對(duì)于各種 鐵過載引起的等常見疾病上有著良好的預(yù)防以及治療效果。本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)基因引入 機(jī)體組織細(xì)胞，使病毒能在患者體內(nèi)自主表達(dá)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白，提升體內(nèi)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白輔助蛋白的水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度，降低鐵對(duì)于細(xì)胞的毒性，達(dá)到治療神經(jīng)退行性 疾病等鐵代謝相關(guān)疾病的目的。這種方法能夠克服外源蛋白質(zhì)不穩(wěn)定、活性低、成本高以及 免疫原性等缺點(diǎn)，并且能夠保持蛋白質(zhì)二級(jí)以及高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的自然特性，使得這一療法 成為大多數(shù)患者能夠接受并有能力支付的治療途徑。利用缺陷型腺病毒作為載體，還具有以下優(yōu)點(diǎn)腺病毒載體工藝流程簡(jiǎn)單，病毒滴 度高；1.腺病毒載體轉(zhuǎn)染率高，可操作性好；2.腺病毒載體宿主范圍廣，安全可靠，致病性低；3.腺病毒載體免疫反應(yīng)弱，外源基因表達(dá)穩(wěn)定持久；4.由CMV啟動(dòng)子控制膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)高效表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)血 清鐵水平；5.由于在真核細(xì)胞內(nèi)自主表達(dá)蛋白，其產(chǎn)物具有天然蛋白的構(gòu)象與活性，能完全 模擬天然表達(dá)情況。


圖1是重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因(h印haestin)生產(chǎn)工藝流程圖；圖2是Ad-H印h系統(tǒng)mRNA表達(dá)情況圖；圖2_1中Groupl為第一組樣本，Group2 是第二組樣本，Blank為空白對(duì)照，rAd-Ifeph為重組腺病毒處理樣本；圖2_2中為參照標(biāo)準(zhǔn) 旦-actin基因的表達(dá)量，Groupl為第一組樣本，Group2是第二組樣本；圖2_3中為空白對(duì) 照和Ad-Heph系統(tǒng)mRNA表達(dá)量相對(duì)參照標(biāo)準(zhǔn)0 -actin基因表達(dá)量的情況；圖3是以GFP為標(biāo)記，觀察Ad-Ifeph系統(tǒng)感染細(xì)胞情況圖；圖4是構(gòu)建高血清鐵動(dòng)物模型并利用Ad-Ifeph系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的組織鐵水平結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明針對(duì)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)體系(Ad-Heph)，提 升體內(nèi)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)的水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度，降低鐵對(duì)于細(xì) 胞的毒性，達(dá)到治療神經(jīng)退行性疾病等鐵代謝失衡相關(guān)疾病的目的。本發(fā)明優(yōu)選的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(Ad-H印h)，包含有通道 型人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒為1型腺病毒(Adeasy-1， Adl)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇了構(gòu)建膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白的重組腺病 毒，其載體系統(tǒng)為Adeasy-1。Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架質(zhì)粒，通過其穿梭質(zhì)粒 Ad-track-CMV將外源性基因與病毒骨架整合，從而包裝出具有廣泛感染性的重組腺病毒。 包裝成功的重組腺病毒在一般的細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，具有安全、高效、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)。Ad-Heph結(jié)構(gòu)重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(AcHfeph)載體缺失了 E1區(qū)，在普通細(xì)胞內(nèi)不能包裝為成熟病毒顆粒，為缺陷型病毒。人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白 (h印haestin)基因?yàn)槟康幕颉Ｎ覀儗⑷送ǖ佬湍よF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因插入病毒的基 因組中，以雙CMV為其啟動(dòng)子，綠色熒光蛋白(GFP)為其標(biāo)記物，下游polyA尾為其終止信 號(hào)區(qū)。本發(fā)明的目的基因人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因含有序列表中Seq IDNo. 1所示 的序列。重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(AcHfeph)生產(chǎn)工藝流程包括重組載 體構(gòu)建、載體線性化制備、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞、擴(kuò)大培養(yǎng)、分離純化、冷凍干燥以及包裝制劑。具體地，重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(AcHfeph)生產(chǎn)工藝流程包 括步驟一、將人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)基因與所述腺病毒的 Ad-track穿梭質(zhì)粒連接構(gòu)建Ad-track-h印haestin重組載體；步驟二、使所述Ad-track-h印haestin重組載體線性化；步驟三、腺病毒的骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；步驟四、Ad-track-h印haestin與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組；步驟五、使重組的病毒骨架質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。其中步驟五的轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)選為HEK293細(xì)胞。本發(fā)明的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒可用于制備藥物組合物，該藥 物組合物可用于治療鐵代謝紊亂疾病，包括任何類型鐵過載引起的疾病與任何類型缺鐵性 貧血?？捎糜谥苽渌幬锝M合物時(shí)，本發(fā)明的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒可 以制備成液體制劑，偏堿性，PH 8.0，凍干后為白色粉末，可跟水與任何比例混合，無味，可 作為針劑、噴劑。本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(hephaestin)基 因引入機(jī)體組織細(xì)胞，使病毒能在患者體內(nèi)自主表達(dá)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白。這種方法能 夠克服外源蛋白質(zhì)不穩(wěn)定、活性低、成本高以及免疫原性等缺點(diǎn)，并且能夠保持蛋白質(zhì)二級(jí)以及高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的自然特性，使得這一療法成為大多數(shù)患者能夠接受并有能力支付的治 療途徑。利用缺陷型腺病毒作為載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、腺病毒載體工藝流程簡(jiǎn)單，病毒滴度高；2、腺病毒載體轉(zhuǎn)染率高，可操作性好；3、腺病毒載體宿主范圍廣，安全可靠，致病性低；4、腺病毒載體免疫反應(yīng)弱，外源基因表達(dá)穩(wěn)定持久；5、由CMV啟動(dòng)子控制膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)高效表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)血 清鐵水平；6、由于在真核細(xì)胞內(nèi)自主表達(dá)蛋白，其產(chǎn)物具有天然蛋白的構(gòu)象與活性，能完全 模擬天然表達(dá)情況。下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。實(shí)施例1膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因插入重組pTrack-CMV為重組腺病毒的穿梭質(zhì)粒。我們將膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因兩端接 上Bgl II與Sal I酶切位點(diǎn)，并加上polyA尾作為終止信號(hào)區(qū)。酶切膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋 白基因與穿梭質(zhì)粒，并將兩者用T4連接酶進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)篩選后，得到正確克隆，送測(cè)序 公司測(cè)序鑒定。Ad-Heph結(jié)構(gòu)重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(AcHfeph)載體缺失了 E1區(qū)，在普通細(xì)胞內(nèi)不能包裝為成熟病毒顆粒，為缺陷型病毒。人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白 (h印haestin)基因?yàn)槟康幕?。我們將人通道型膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因插入病毒的基 因組中，以雙CMV為其啟動(dòng)子，綠色熒光蛋白(GFP)為其標(biāo)記物，下游polyA尾為其終止信 號(hào)區(qū)。重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒制備重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(AcHfeph)生產(chǎn)工藝流程包括重組載 體構(gòu)建、載體線性化制備、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞、擴(kuò)大培養(yǎng)、分離純化、冷凍干燥以及包裝制劑。 具體見以下詳述及其生產(chǎn)工藝流程圖(見圖1)。1、目的基因h印haestin的獲取以人基因組全cDNA的作為模板，Pfu高保真酶PCR擴(kuò)增。PCR熱擴(kuò)增條件為95°C 變性 5min，95°C 80s，58°C 100s, 72°C 120s, 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C保溫 5min。產(chǎn)物約 3400bp。其引物序列為上游引物(SeqID No. 2)5’ -CGCTCAGATCTTCTCAAAGTACTGTGGGCCATGAAGGCAGG-3’下游引物(SeqID No. 3)5’ -TCAATGTCGACAGATGTGTTCTGAAGATATTTTCAGGCTTC-3'PCR反應(yīng)體系如下無菌水38 u 110x PCR Buffer5 u 14x dNTP4 ill引物11 ill0083]引物 21 U 1
0084]模板0. 5u 1
0085]Pfu 聚合酶0. 5 ii 1
0086]_
0087]總體積50 ii
0088]2、Ad-track_h印haestin穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
0089]a.雙酶切PCR產(chǎn)物與Ad-track質(zhì)粒，37°C酶切過夜。酶切體系構(gòu)建如下
0090]PCR 產(chǎn)物20 u 1
0091]10x buffer10 u 1
0092]ddH2060 u 1
0093]Bgl-II5u 1
0094]Sal-I5U 1
0095]_
0096]總體積100 ill
0097]Ad-track 質(zhì)粒20 u 1
0098]lOx buffer10 u 1
0099]ddH2060 u 1
0100]Bgl-I5u 1
0101]Sal-I5u 1
0102]_
0103]總體積100 ill
0104]b.試劑盒法(QIAquick Gel extraction kit)凝膠回收酶切片段；
0105]c. 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，利用定量Marker初步估計(jì)核酸濃度；
0106]d. T4連接酶4°C過夜，連接凝膠回收PCR產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒，連接體系如下
0107]Ad-track質(zhì)粒酶切片斷 5 yl
0108]PCR產(chǎn)物酶切片斷7 ill
0109]10x buffer2 u 1
0110]ddH204. 5 ill
0111]T4 連接酶1.5 ill
0112]_
0113]總體積20 ill
0114]注先加入DNA片段與ddH20，45°C溫浴5min，且所有試劑加入前于0°C預(yù)冷。
0115]e.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，涂板37°C過夜16h ；
0116]f.次日每個(gè)平板挑取較小的克隆10個(gè)，小量法提取質(zhì)粒；
0117]g.雙酶切重組質(zhì)粒；
0118]h.酶切產(chǎn)物5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色；
0119]i.挑選切出相應(yīng)小片斷的克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒；
0120]j.保存菌種與質(zhì)粒，送樣品測(cè)序鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致。
0121]3、Pme_I線性化重組質(zhì)粒
利用Pme-I內(nèi)切酶線性化穿梭質(zhì)粒，凝膠回收線形化片斷。酶切系統(tǒng)構(gòu)建如下10x buffer5u 1100x BSA0.5 ill質(zhì)粒DNA25 illPme-I1 u 1ddH20185 ill總體積50 ill_4、Adeasy-l 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BJ5183，構(gòu)建 Ad_BJ5183 細(xì)菌株a.用冷卻的無菌吸頭，吸取BJ5183感受態(tài)細(xì)胞200 u 1至無菌離心管中；b.按照比例稀釋Adeasy-1質(zhì)粒；c.每組取10 U 1加入感受態(tài)細(xì)胞中；d.混勻內(nèi)容物，冰浴30min ；e.將管置42°C循環(huán)水浴中，恰恰放置90s，不要搖動(dòng)；f.迅速轉(zhuǎn)至冰浴中，冷卻2min ；g.每管加800 u 1無抗生素LB培養(yǎng)基；37°C緩慢(45rpm)振蕩45min ；h.取200 yl至含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，均勻涂布菌液；i.倒置平板，37°C，16h。j.次日觀察結(jié)果，看生長菌落多寡是否與濃度梯度一致。編碼混亂5、Ad-track_h印haestin 穿梭質(zhì)粒與 Adeasy-1 同源重組a.將目的基因插入穿梭載體的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化E.Coli-DH5a，鋪卡那霉素抗性 LB平板，挑取克隆，接種于5ml卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37°C震搖過夜，次晨提取質(zhì) 粒，PCR或酶切鑒定。b.提取的穿梭質(zhì)粒經(jīng)Pme-I酶切過夜，充分線性化(不完全消化往往產(chǎn)生較高的 背景，從而降低重組率，將線性化質(zhì)粒去磷酸化有助于降低背景信號(hào))，凝膠純化。c.將回收的線性化載體轉(zhuǎn)入Ad_BJ5183感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，鋪卡那霉素抗性LB平板， 置于37°C孵箱內(nèi)培養(yǎng)14-16小時(shí)。d.挑取較小的克隆15-20個(gè)，接種于卡那抗性液體LB培養(yǎng)基5ml中，37°C震 搖過夜。次晨收菌，立即提取質(zhì)粒，酶切鑒定，選擇成功重組的克隆，大量擴(kuò)增，命名為 Ad—hephaestin。6、病毒骨架Pac-I線性化利用Pac-I內(nèi)切酶線性化上述病毒骨架質(zhì)粒，37°C酶切過夜，以便在293A細(xì)胞中 包裝病毒。酶切體系構(gòu)建如下10x buffer5u 1lOOxBSA0.5 illPac-I1 u 1Ad-hephaestin DNA40 u 1
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ddH203. 5 ill_總體積50 ill7、病毒骨架鑒定與純化滅菌取10iU線形化病毒骨架雙酶切鑒定，體系同前所述。鑒定后純化酶切產(chǎn)物a.收集多管酶切產(chǎn)物，等體積酚_氯仿抽提2次；b.等體積氯仿單獨(dú)抽提1次；c.加入1/10體積3M NaAC(PH5. 2)以及2. 5倍體積冰的無水乙醇，至于-80°C 1 小時(shí)；d. 4°C, 16000r/min，離心 lOmin ；e.冰冷的75%乙醇洗滌沉淀，4°C放置過夜；f. 4°C，12000r/min，離心5min，移至超凈臺(tái)上操作；g.棄上清，無菌環(huán)境下干燥15min ；h. 50 ill 無菌 ddH20 溶解沉淀；i.取2 ill電泳，測(cè)定核酸濃度。8、病毒包裝a.將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK292細(xì)胞；b.放置15天左右，每隔3天換液一次。待細(xì)胞出現(xiàn)彗星狀熒光收毒；c.大量擴(kuò)增病毒，約培養(yǎng)100個(gè)9cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞量后，進(jìn)行超速梯度離心純化；d.透析后測(cè)定滴度，分裝后保存于-80度。Ad-Heph系統(tǒng)感染以及表達(dá)實(shí)驗(yàn)1、接種C6細(xì)胞1.5X107個(gè)細(xì)胞于9cm培養(yǎng)皿(Corning)中，37°C，5% C02培養(yǎng)過 夜；2、感染前換5ml無血清培養(yǎng)基；3、每個(gè)培養(yǎng)皿加0. 5ul實(shí)施例2中制備得到的純化病毒；4、培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞；5,westen-blot定量檢測(cè)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白表達(dá)情況；6、統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果如圖2(圖2-1為空白對(duì)照Blank和兩組樣品的rAd_H印h系統(tǒng)mRNA的表達(dá) 量的情況；圖2-2中為參照標(biāo)準(zhǔn)日-actin基因的表達(dá)量的情況；圖2-3中為空白對(duì)照和 Ad-Heph系統(tǒng)mRNA表達(dá)量相對(duì)參照標(biāo)準(zhǔn)0 -actin基因表達(dá)量的情況)、圖3所示，24小時(shí) 左右膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白mRNA水平表達(dá)已經(jīng)達(dá)到空白對(duì)照組的40倍，并且持續(xù)表達(dá)。Ad-Heph體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(組織鐵測(cè)定)1.選擇3月齡SD大鼠雄雌各10只，按性別隨機(jī)分為兩組；2.兩組實(shí)驗(yàn)鼠均以高鐵飼料(購自SIGMA)喂養(yǎng)3個(gè)月，構(gòu)建高血清鐵大鼠模型， 并測(cè)定血清鐵濃度；3.實(shí)驗(yàn)組注射Ad-H印h病毒稀釋液，每次劑量為約1X1012個(gè)病毒顆粒，每3天注 射一次，3次為一療程；對(duì)照組注射PBS等滲鹽水；
4. 一療程結(jié)束后，分別于3、6、9、12、15、18天抽取血清，按常規(guī)方法利用生化儀器 測(cè)定血清鐵濃度。5.最后處死大鼠，分別取心臟、大腦組織標(biāo)本，凍干后利用測(cè)鐵試劑盒測(cè)定組織鐵含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從第6天開始，組織鐵測(cè)定顯示實(shí)驗(yàn)組的組織含鐵量顯著降低。結(jié)果如 圖4示。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒，其特征在于包含有人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因與腺病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒，其特征在 于所述人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因插入所述腺病毒基因組中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病 毒，其特征在于所述人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因?yàn)橥ǖ佬腿四よF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基 因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒，其特征在 于所述人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因的表達(dá)讀碼框包含巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子、人膜鐵 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因以及下游的polyA信號(hào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病 毒，其特征在于所述腺病毒為缺陷型腺病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒，其特征在 于所述腺病毒為1型腺病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒，其特征在 于所述腺病毒為缺失了 E1區(qū)的缺陷型腺病毒。
8.—種權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒的 制備方法，所述方法包括如下步驟步驟一.將人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(h印haestin)基因與所述腺病毒的Ad-track穿 梭質(zhì)粒連接構(gòu)建Ad-track-h印haestin重組載體；步驟二 .使所述Ad-track-h印haestin重組載體線性化；步驟三.腺病毒的骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；步驟四.Ad-track-h印haestin與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組；步驟五.使重組的病毒骨架質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒的制備方法，所述 方法步驟五中轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)選為HEK293細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1 7中任意一項(xiàng)所述的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒在制 備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述鐵代謝紊亂疾病為鐵過載引起的 疾病。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述鐵代謝紊亂疾病為缺鐵性貧血。
13.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 輔助蛋白基因腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒(Ad-Heph)，包含有人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(hephaestin)基因與腺病毒載體。本發(fā)明還提供了上述重組人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白基因腺病毒的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將人膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白(hephaestin)基因引入機(jī)體組織細(xì)胞，使病毒能在患者體內(nèi)穩(wěn)定、安全、高活性地自主表達(dá)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白，提升體內(nèi)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助蛋白的水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101875918SQ20091010700
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者柯亞, 葛嘯虎, 錢忠明 申請(qǐng)人:香港理工大學(xué)深圳研究院