專利名稱：鞣酸酶、編碼其的基因及其制造法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及曲霉菌(Aspergillus)屬微生物產(chǎn)生的新型鞣酸酶。具體涉及曲霉菌 (Aspergillus)屬產(chǎn)生的耐熱性優(yōu)異的鞣酸酶、編碼其的基因、其制造方法及其用途等。
背景技術(shù)：
鞣酸酶(鞣酸?；饷?、EC3. 1. 1. 20)是水解鞣酸類的縮酚酸鍵的酶。在食品工業(yè)中，可用于防止茶類飲料的冷后渾(Cream down)、防止果汁飲料的沉淀、啤酒的澄清化寸。到目前為止，報道了許多由于細(xì)菌、酵母和絲狀真菌導(dǎo)致的鞣酸酶的產(chǎn)生(非專利文獻(xiàn)1)。絲狀真菌中關(guān)于曲霉菌(Aspergillus)屬和青霉菌(Penicillium)屬的報道較多。對于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)來源的鞣酸酶，已經(jīng)清楚了其酶化學(xué)的性質(zhì)、氨基酸序列和編碼其的基因(參照專利文獻(xiàn)1、2、非專利文獻(xiàn)2)。專利文獻(xiàn)1中記載的鞣酸酶的最適pH范圍在5. 0 5. 5附近的弱酸性、最適溫度范圍在40°C附近，在超過60°C的高溫下10分鐘之內(nèi)就失活。因此，在工業(yè)利用時，就形成了在特別限定的條件下的反應(yīng)。專利文獻(xiàn)2中記載的鞣酸酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)異，檸檬酸緩沖液(pH5. 5)中，65°C 10分處理后的殘留活性在80%以上、最適溫度范圍為60 80°C，克服了專利文獻(xiàn)1中記載的鞣酸酶的缺點(diǎn)，但只報道了在重組體中的生產(chǎn)，未確認(rèn)非重組體中的生產(chǎn)。因此，在食品產(chǎn)業(yè)中利用時，按照“利用基因重組微生物制造的添加物的安全性評價基準(zhǔn)”(非專利文獻(xiàn)3)的安全性確認(rèn)是必需的。此外，在日本，對基因重組食品的排斥性也根深蒂固。因此，還不能說可在食品產(chǎn)業(yè)中直接利用。另一方面，也有關(guān)于最適溫度在60°C以上的熱穩(wěn)定性優(yōu)異的鞣酸酶的報道(參照非專利文獻(xiàn)4、幻。但是，只是確認(rèn)了存在這些鞣酸酶，但其氨基酸序列和編碼其的基因、酶科學(xué)性質(zhì)等還沒弄清楚，無法實(shí)現(xiàn)實(shí)用化。專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 特開平8-80196
專利文獻(xiàn)2 特開 2003-250588非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Appl. Microbiol. Biotechnol.，Vol. 76，p. 47-59，2007非專利文獻(xiàn)2 :Gene, Vol. 175，p. 215-221，1996非專利文獻(xiàn)3 食品安全委員會“利用基因重組微生物制造的添加物的安全性評價基準(zhǔn)”平成16年3月25日決定非專利文獻(xiàn)4 =Microbiology, Vol. 149，ρ· 2941-2946，2003非專利文獻(xiàn) 5 :Process Biochemistry, Vol. 40 (5), April 2005，ρ· 1553—1557， 2005
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來源于自然界中存在的微生物的、耐熱性優(yōu)異的鞣酸酶。 而且，目的還在于提供該鞣酸酶的基因、制造方法、用途等。本發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了積極的研究。其結(jié)果是，在黑曲霉(Aspergillus niger)的3個菌株和泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)的2個菌株總共5個菌株中確認(rèn)產(chǎn)生了耐熱性高的鞣酸酶。進(jìn)而繼續(xù)進(jìn)行研究，成功分離了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033 (IF0-4033)產(chǎn)生的鞣酸酶，確定了其酶化學(xué)性質(zhì)。此外，還成功鑒定了該鞣酸酶的氨基酸序列和編碼該鞣酸酶的基因的堿基序列。將酶化學(xué)的性質(zhì)和氨基酸序列與已經(jīng)報道的鞣酸酶進(jìn)行了比較，結(jié)果確認(rèn)了成功獲得并鑒定的鞣酸酶是新型酶。本發(fā)明基于上述成果而完成，內(nèi)容如下。[1] 一種鞣酸酶，來源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉 (Aspergillus niger)，對于65°C的熱處理(pH5. 0、30分鐘)具有耐性。[2] 一種鞣酸酶，具有下述酶化學(xué)性質(zhì)(1)作用作用于縮酚酸鍵而進(jìn)行水解；(2)分子量約23萬Da (通過凝膠過濾測定)；(3)溫度穩(wěn)定性直到65°C都穩(wěn)定(ρΗ5· 0、30分鐘)。[3]根據(jù)[2]所述的鞣酸酶，還具有下述酶化學(xué)性質(zhì)(4)最適溫度約70°C ；(5)最適 pH:約 5. 5;(6) pH穩(wěn)定性在pH3 8的范圍穩(wěn)定(30°C >30分鐘)(7)底物特異性良好地作用于鞣酸，作用于沒食子酸酯。[4]根據(jù)[2]或[3]所述的鞣酸酶，來源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。[5] 一種鞣酸酶，具有序列號5所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列等價的氨基酸序列。[6]根據(jù)[5]所述的鞣酸酶，所述等價的氨基酸序列是與序列號5所示的氨基酸序列90 %以上相同的氨基酸序列。[7] 一種酶劑，以[1] [6]中任一項所述的鞣酸酶為有效成分。[8] 一種鞣酸酶基因，由選自以下㈧ (C)中的任一項的DNA構(gòu)成(A)編碼序列號5所示的氨基酸序列的DNA ；(B)由序列號4所示的堿基序列構(gòu)成的DNA ；(C)具有與序列號4所示的堿基序列等價的堿基序列，且編碼具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。[9] 一種重組載體，含有[8]所述的鞣酸酶基因。[10] 一種轉(zhuǎn)化體，導(dǎo)入有[8]所述的鞣酸酶基因。[11] 一種鞣酸酶的制造方法，其特征在于，包含以下的步驟(1)和0)，或包含以下的步驟⑴和(ii)(1)培養(yǎng)選自泡盛曲霄(Aspergillus awamori)禾口黑曲霄(Aspergillus niger) 中的微生物的步驟，(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和/或菌體回收鞣酸酶的步驟；(i)在產(chǎn)生前述基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)[10]所述的轉(zhuǎn)化體的步驟，
(ii)回收產(chǎn)生的前述蛋白質(zhì)的步驟。[12]根據(jù)[11]所述的鞣酸酶的制造方法，所述微生物是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IF0-4033)。[13] 一種水解法，其特征在于，使[1] W]中任一項所述的鞣酸酶、[7]所述的酶劑、或用[11]或[1 所述的制造方法獲得的鞣酸酶作用于鞣酸或含有鞣酸的組合物。


[圖1]是表示泡盛曲霉(Aspergillusawamori)來源的鞣酸酶的最適溫度的圖。[圖2]是表示泡盛曲霉(Aspergillusawamori)來源的鞣酸酶的最適pH的圖。
檸檬酸緩沖液 ρΗ3. 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0?！趿姿峋彌_液 ρΗ6. 0、6· 5、7· 0、7· 5、 8. 0。[圖3]是表示泡盛曲霉(Aspergillusawamori)來源的鞣酸酶的溫度穩(wěn)定性的圖。[圖4]是表示泡盛曲霉(Aspergillusawamori)來源的鞣酸酶的pH穩(wěn)定性的圖。
檸檬酸緩沖液 ρΗ3. 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5。□磷酸緩沖液 ρΗ6. 0、6· 5、7· 0、 7. 5、8· O0[圖5]表達(dá)質(zhì)粒pTALC-TAN的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式(用語)本發(fā)明中所謂“編碼蛋白質(zhì)的DNA”，是指使其表達(dá)時可以獲得該蛋白質(zhì)的DNA， 即，具有與該蛋白質(zhì)的氨基酸序列對應(yīng)的堿基序列的DNA。因此，也考慮了密碼子的簡并性。本說明書中的用語“分離的”可以與“純化的”交換使用。與本發(fā)明的酶(鞣酸酶) 相關(guān)使用時的所謂“分離的”，是指本發(fā)明的酶是來源于天然材料時，該天然材料中實(shí)質(zhì)上不含該酶以外的成分(尤其是實(shí)質(zhì)上不含雜質(zhì)蛋白質(zhì))的狀態(tài)。具體而言，例如，本發(fā)明的分離的酶中，雜質(zhì)蛋白質(zhì)的含量按重量換算不到整體的約20%，優(yōu)選不到約10%，更優(yōu)選不到約5%，更為優(yōu)選不到約1%。另一方面，本發(fā)明的酶按照基因工程方法制備時的用語 “分離的”是指實(shí)質(zhì)上不含使用的宿主細(xì)胞來源的其它成分和培養(yǎng)液等。具體而言，例如，本發(fā)明的分離的酶中，雜質(zhì)蛋白質(zhì)的含量按重量換算不到整體的約20%，優(yōu)選不到約10%， 更優(yōu)選不到約5%，更為優(yōu)選不到約1%。而且，只要不明確表明與其有不同的含義，本說明書中僅記載“鞣酸酶”時是指“分離狀態(tài)的鞣酸酶”。代替鞣酸酶而使用的用語“本酶”也是一樣。關(guān)于DNA使用時的“分離的”，是指原本天然存在的DNA的情況，典型的是，從天然狀態(tài)下共存的其它核酸分離的狀態(tài)。但是，還可以含有天然狀態(tài)下鄰接的核酸序列(例如啟動子區(qū)域的序列或終止子序列等)等一部分其它核酸成分。例如，基因組DNA情況的“分離的”狀態(tài)下，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有天然狀態(tài)下共存的其它DNA成分。另一方面，cDNA分子等通過基因工程方法制備的DNA情況中的“分離的”狀態(tài)下，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含細(xì)胞成分和培養(yǎng)液等。同樣，通過化學(xué)合成制備DNA時的“分離的”狀態(tài)下，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含dNTP等前體 (原材料)和合成過程中使用的化學(xué)物質(zhì)等。而且，只要不明確表明與其有不同的含義，本說明書中僅記載“DNA”時是指“分離狀態(tài)的DNA”。(鞣酸酶及其生產(chǎn)菌)本發(fā)明的第1方面是提供鞣酸酶(以下，也稱為“本酶”)及其生產(chǎn)菌。如后述的實(shí)施例所示，本發(fā)明人進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和黑曲霉(Aspergillus niger)產(chǎn)生對65°C的熱處理有耐性的耐熱性鞣酸酶。而且，進(jìn)行了進(jìn)一步研究，成功實(shí)現(xiàn)了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)來源的鞣酸酶的分離和純化，并且，如下所示，成功確定了其酶化學(xué)性質(zhì)。(1)作用本酶是鞣酸酶，作用于縮酚酸鍵而進(jìn)行水解。(2)分子量本酶通過凝膠過濾，顯示出約23萬Da的分子量。SDS-PAGE中顯示9 10萬Da 的分子量。本酶具有糖鏈，用內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)處理顯示出分子量的顯著減少。(3)溫度穩(wěn)定性本酶即使在50mM檸檬酸緩沖液(pH5. 0)中、65°C的條件下進(jìn)行30分鐘處理，也可維持90%以上的活性。⑷最適溫度本酶的最適溫度為約70°C。本酶在約60°C 約70°C下顯示高活性。最適溫度是用后述的鞣酸酶活性測定方法(50mM檸檬酸緩沖液(pH5.0)中)進(jìn)行的測定計算的值。(5)最適 pH本酶的最適pH為約5. 5。本酶在pH約5.0 約6.0下呈現(xiàn)高活性。最適pH，例如，對于pH3 6的pH域，是基于在檸檬酸緩沖液中測定的結(jié)果而判斷的，對于pH 6 8， 是基于在磷酸緩沖液中測定的結(jié)果而判斷的。(6)pH 穩(wěn)定性本酶在pH 3 8這樣寬的pH域內(nèi)顯示穩(wěn)定的活性。即，如果提供給處理的酶溶液的PH如果在此范圍內(nèi)，在30°C、30分鐘的處理后，呈現(xiàn)最大活性的80%以上的活性。pH 穩(wěn)定性，例如，對于pH 3 6的pH域，是基于在檸檬酸緩沖液中測定的結(jié)果而判斷的，對于 PH 6 8，是基于在磷酸緩沖液中測定的結(jié)果而判斷的。(7)底物特異性本酶良好地作用于鞣酸。也作用于沒食子酸酯(沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯等)。而且，本酶的反應(yīng)性和底物特異性可以用后述的實(shí)施例所示的方法(鞣酸酶活性測定方法和底物特異性測定方法的欄)測定和評價。本酶優(yōu)選是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)來源的鞣酸酶。這里的所謂“泡盛曲霉(Aspergillus awamori)來源的鞣酸酶”是指，利用分類為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的微生物(可以是野生株，也可以是變異株)生產(chǎn)的鞣酸酶、或泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)(可以是野生株，也可以是變異株)的鞣酸酶基因，通過基因工程方法獲得的鞣酸酶。因此，由導(dǎo)入了從泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中獲得的鞣酸酶基因(或改變了該基因的基因)的宿主微生物生產(chǎn)的重組體，也相當(dāng)于“泡盛曲霉 (Aspergillus awamori) : !白勺·@ΙΒ|”。為了說明的方便，將本酶所來源的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)稱為本酶的
6生產(chǎn)菌。如上所述，已經(jīng)弄清楚了成功獲得的本酶的性狀的詳細(xì)情況。其結(jié)果判明了本酶的耐熱性優(yōu)異，PH穩(wěn)定性優(yōu)異。因此，本酶特別適于食品加工。本發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步研究的結(jié)果是，確定了泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 產(chǎn)生的鞣酸酶的氨基酸序列(序列號幻。因此，本發(fā)明的一個方式，具備由具有序列號5的氨基酸序列的蛋白質(zhì)構(gòu)成這樣的特征。這里，一般來說，存在對某個蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分進(jìn)行改變時，改變后的蛋白質(zhì)與改變前的蛋白質(zhì)具有同等功能的情況。即，有時氨基酸序列的改變對蛋白質(zhì)的功能沒有實(shí)質(zhì)影響，蛋白質(zhì)的功能在改變前后得以維持。因此，本發(fā)明，作為其它方式，提供了由與序列號5所示的氨基酸序列等價的氨基酸序列構(gòu)成，且具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)(以下，也稱為“等價蛋白質(zhì)”)。這里所謂的“等價的氨基酸序列” 是指，與序列號5所示的氨基酸序列一部分有差異，但這種差異對蛋白質(zhì)的功能(這里是鞣酸酶活性)沒有實(shí)質(zhì)影響的氨基酸序列。所謂“具有鞣酸酶活性”是指，作用于以鞣酸為代表的沒食子酸酯、二沒食子酸、五倍子鞣質(zhì)(feillotarmin)、鞣花單寧(Ellagitarmin)等具有縮酚酸鍵的分子進(jìn)行水解的活性，但其活性的程度只要能夠發(fā)揮作為鞣酸酶的功能就沒有特別限定。但是，優(yōu)選與由序列號5所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)程度相同或比其更尚ο所謂“氨基酸序列的一部分有差異”，典型的是指，通過構(gòu)成氨基酸序列的1個 數(shù)個氨基酸缺失、取代、或1 數(shù)個氨基酸添加、插入、或它們的組合，氨基酸序列產(chǎn)生變異 (變化)。這里的氨基酸序列的差異只要保持鞣酸酶活性，就是可以允許的(活性也可以有少許變化)。只要滿足該條件，氨基酸序列差異的位置就沒有特別限定，還可以在多個位置產(chǎn)生差異。其中，所謂“多個”是指例如相當(dāng)于小于全部氨基酸約30%的數(shù)目，優(yōu)選相當(dāng)于小于約20%的數(shù)目，更優(yōu)選相當(dāng)于小于約10%的數(shù)目，進(jìn)一步優(yōu)選相當(dāng)于小于約5%的數(shù)目，最優(yōu)選相當(dāng)于小于約的數(shù)目。即等價蛋白質(zhì)與序列號5的氨基酸序列具有例如約 70%以上、優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選約90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選約95%以上、最優(yōu)選約99%以上的同一性。優(yōu)選，通過在不是鞣酸酶活性所必需的氨基酸殘基上發(fā)生保守的氨基酸取代來獲得等價蛋白質(zhì)。這里所謂的“保守的氨基酸取代”，是指將某氨基酸殘基取代成具有同樣性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈被分類為堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、 組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)這樣的幾個家族。保守的氨基酸取代優(yōu)選是在同一家族內(nèi)的氨基酸殘基之間的取代?！暗葍r蛋白質(zhì)”還可以有額外的性質(zhì)。作為這種性質(zhì)，可以列舉，例如，穩(wěn)定性比由序列號5所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)更好這樣的性質(zhì)、僅在低溫和/或高溫下發(fā)揮不同的功能這樣的性質(zhì)、最適PH不同這樣的性質(zhì)等?？墒?，兩個氨基酸序列或二個核酸(以下，使用“兩個序列”作為包括它們的用語) 的同一性(％ )例如可以按照以下方法確定。首先，以能夠進(jìn)行最佳比較的方式排列兩個序列(例如，可以通過在第一序列中導(dǎo)入空位使得與第二序列的比對最優(yōu)化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸殘基或核苷酸)與第二序列中的相應(yīng)位置的分子相同時，即稱該位置的分子是相同的。兩個序列的同一性是在這兩個序列中共通的相同位置的數(shù)目的函數(shù) (艮P、同一性(％ )=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)X100)，優(yōu)選也將比對的最優(yōu)化所需要的空位數(shù)目和大小考慮在內(nèi)。兩個序列的比較和同一性的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。作為可以用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的具體例子，有在 Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-68 中記載的、在 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-77 中改變的算法，但并不限于此。這樣的算法被整合到Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10中記載的NBLAST程序和XBLAST程序O. 0版本)中。為了得到與本發(fā)明的核酸分子等價的核苷酸序列，可以例如用NBLAST程序、設(shè)score = lOO.wordlength = 12進(jìn)行BLAST 核苷酸檢索。為了獲得與本發(fā)明的多肽分子等價的氨基酸序列，可以例如用XBLAST程序、 設(shè)score = 50、wordlength = 3進(jìn)行BLAST多肽檢索。為了得到用于比較的空位比對，可以利用 Altschul 等人(1997) Amino Acids Research 25(17) :3389-3402 中記載的 Gapped BLAST。利用BLAST和Gapped BLAST時，可以使用對應(yīng)的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。詳細(xì)而言，請參照http://www. ncbi. nlm. nih. gov。作為能夠用于序列比較的其他數(shù)學(xué)算法的例子，有Myers和Miller (1988)Comput Appl Biosci. 4 :11-17中記載的算法。這樣的算法被整合到例如可以在GENESTREAM網(wǎng)站服務(wù)器(IGH Montpellier、法國)或 ISREC服務(wù)器中利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比較中使用ALIGN程序時，例如，可以使用PAM120殘基質(zhì)量表，設(shè)空位長度罰分=12、空位罰分=4?？梢允褂肎CG軟件包的GAP程序、使用Blossom 62Matrix或PAM250Matrix，設(shè)空位權(quán)重=12、10、8、6、或4、空位長度權(quán)重=2、3、或4來確定兩個氨基酸序列的同一性。此外，可以使用GCG軟件包(可以利用http://WWW. gcg. com)的GAP程序，設(shè)空位權(quán)重=50、 空位長度權(quán)重=3來確定兩個核酸序列的相同度。本酶也可以是更大的蛋白質(zhì)(例如融合蛋白質(zhì))的一部分。作為在融合蛋白質(zhì)中添加的序列，可以列舉例如，多重組氨酸殘基這種有助于純化的序列、確保重組生產(chǎn)時的穩(wěn)定性的添加序列等。具有上述氨基酸序列的本酶可以通過基因工學(xué)方法容易地制備。例如，可以通過用編碼本酶的DNA轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如大腸桿菌)，回收轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)來制備?；厥盏牡鞍踪|(zhì)根據(jù)目的適當(dāng)純化。如果獲得了作為這樣的重組蛋白質(zhì)的本酶，可以進(jìn)行各種修飾。例如，如果編碼本酶的DNA與其它適當(dāng)?shù)腄NA插入到相同的載體中，用該載體進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，可以獲得由連接了任意肽或蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)構(gòu)成的本酶。此外，還可以實(shí)施產(chǎn)生糖鏈和/或脂質(zhì)的添加或N末端或C末端的加工的這樣的修飾。通過以上這樣的修飾，可以進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的提取，簡化純化、或添加生物學(xué)功能等。(編碼鞣酸酶的DNA)本發(fā)明的第2方面提供了編碼本酶的基因、即新的鞣酸酶基因。在一個方式中，本發(fā)明的基因由編碼序列號5的氨基酸序列的DNA構(gòu)成。該方式的具體例子是由序列號4所示的堿基序列構(gòu)成的DNA?？墒牵话銇碚f，對編碼某蛋白質(zhì)的DNA的一部分實(shí)施改變時，改變后的DNA所編碼的蛋白質(zhì)有時與改變前的DNA編碼的蛋白質(zhì)具有同等的功能。即，有時DNA序列的改變對編碼的蛋白質(zhì)的功能沒有實(shí)質(zhì)性影響，編碼的蛋白質(zhì)的功能在改變前后得到維持。因此， 本發(fā)明，作為其它方式，提供了具有與序列號4所示的堿基序列等價的堿基序列，且編碼具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(以下，也稱為“等價DNA”)。這里的所謂“等價的堿基序列” 是指與序列號4所示的核酸有部分差異，但其編碼的蛋白質(zhì)的功能(這里指鞣酸酶活性) 實(shí)質(zhì)不受這種差異影響的堿基序列。等價DNA的具體例子，是與序列號4所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交的DNA。這里所謂的“嚴(yán)緊條件”是指形成所謂的特異性雜交，不形成非特異性雜交的條件。這樣的嚴(yán)緊條件可以參照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的例如分子克隆(第3版， 7^7 ! , ) Current protocols in molecular biology ( ^ Frederick M-Ausubel等人編輯，1987)進(jìn)行設(shè)定。作為嚴(yán)緊條件，可以列舉例如使用雜交液(50%甲酰胺、10XSSC(0. 15M NaCl，15mM 檸檬酸鈉，ρΗ 7. 0)、5XDenhardt 溶液、SDS、10%硫酸葡聚糖、10μ g/ml的變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))在約42°C 約50°C下溫育，然后使用0. 1XSSC、0. 1% SDS在約65°C 約70°C下進(jìn)行清洗的條件。作為更優(yōu)選的嚴(yán)緊條件，可以列舉例如使用50%甲酰胺、5XSSC(0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7.0)、 1 X Denhardt溶液、1 % SDS、10 %硫酸葡聚糖、10 μ g/ml變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液 (pH7. 5))作為雜交液的條件。作為等價DNA的其它的具體例子，可以列舉以序列號4所示的堿基序列為基礎(chǔ)的含有1個或多個堿基的取代、缺失、插入、添加、或倒位的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的取代或缺失等也可以在多個部位發(fā)生。這里的所謂“多個”是指根據(jù)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)的立體構(gòu)造中的氨基酸殘基的位置、種類的不同而不同，例如是2 40個堿基、優(yōu)選2 20個堿基、更優(yōu)選2 10個堿基。以上這樣的等價DNA可以利用通過例如限制性酶處理、采用核酸外切酶或DNA連接酶等進(jìn)行的處理、定點(diǎn)突變導(dǎo)入法(分子克隆，第3版，第13章，冷泉港實(shí)驗室出版，紐約)或隨機(jī)突變導(dǎo)入法(分子克隆，第3版，第13章，冷泉港實(shí)驗室出版，紐約)進(jìn)行的變異的導(dǎo)入等，通過改變具有序列號 4所示的堿基序列的DNA以便其含有堿基的取代、缺失、插入、付加、和/或倒位而獲得。而且，通過紫外線照射等其他方法也可以得到等價DNA。作為等價DNA的另外的例子，可以列舉確認(rèn)了由SNP(單核苷酸多態(tài))作為代表的多態(tài)引起的上述這樣的堿基差異的DNA。本發(fā)明的基因可以參考本說明書或附帶的序列表公開的序列信息，使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程法、分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法等，制備成分離的狀態(tài)。具體的是，可以從適當(dāng)?shù)呐菔⑶?Aspergillus awamori)的基因組DNA文庫或cDNA文庫、或泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)的菌體內(nèi)提取液中，適當(dāng)利用可以與本發(fā)明的基因特異性雜交的寡核苷酸探針、引物來制備。寡核苷酸探針、引物可以使用市售的自動化DNA合成裝置等容易地合成。而且，用于制備本發(fā)明基因而使用的文庫的制作方法可以參照例如分子克隆，第 3版，冷泉港實(shí)驗室出版，紐約。例如，如果是具有序列號4所示的堿基序列的基因，可以利用以該堿基序列或其互補(bǔ)序列的整體或其一部分作為探針的雜交法進(jìn)行分離。此外，可以利用使用被設(shè)計成與該堿基序列的一部分特異性雜交的合成寡核苷酸引物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR)，進(jìn)行擴(kuò)增和分離。此外，還可以基于序列號5所示的氨基酸序列或序列號4所示的堿基序列的信息，通過化學(xué)合成，得到目的基因(參考文獻(xiàn)Gene，60 (1)，115-127 (1987))。
以下，公開本發(fā)明的基因的獲得方法的具體例子。首先，從泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中分離并純化本酶(鞣酸酶)，獲得與該部分氨基酸序列相關(guān)的信息。作為部分氨基酸序列測定方法，例如，將純化的鞣酸酶，直接按照常規(guī)方法提供給通過Edman分解法 (Journal of Biological Chemistry、第 256 卷、第 7990 7997 頁(1981)〕進(jìn)行的氨基酸序列分析〔Protein-sequencer 476A、Applied Biosystems公司制等〕。使蛋白質(zhì)水解酶作用進(jìn)行限制性水解，分離純化所獲得的肽片段，對獲得的純化肽片段進(jìn)行氨基酸序列分析是有效的?；谶@樣獲得的部分氨基酸序列的信息，克隆鞣酸酶基因。例如，可以利用雜交法或PCR，進(jìn)行克隆。在利用雜交法時，還可以使用例如，分子克隆(第3版，冷泉港實(shí)驗室出版，紐約)中記載的方法。在利用PCR法時，可以使用以下的方法。首先，以產(chǎn)生鞣酸酶的微生物的基因組DNA作為模板，使用基于部分氨基酸序列的信息設(shè)計的合成寡核苷酸引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得目的基因片段。PCR法按照PCRTechnology [PCR Technology, Erlich HA編輯、 Mocktonpress公司、1989年發(fā)行]中記載的方法進(jìn)行。進(jìn)而，就該擴(kuò)增DNA片段而言，如果用通常使用的方法、例如、雙脫氧鏈終止法測定其堿基序列，測定的序列中除了合成寡核苷酸引物的序列以外，還發(fā)現(xiàn)有與鞣酸酶的部分氨基酸序列對應(yīng)的序列，可以獲得目的鞣酸酶基因的一部分。通過以獲得的基因片段作為探針，再進(jìn)行雜交法等，可以克隆編碼全長鞣酸酶的基因。在后述的實(shí)施例中，利用PCR法測定編碼泡盛曲霉(Aspergillus awamori)產(chǎn)生的鞣酸酶的基因的序列。編碼泡盛曲霉(Aspergillus awamori)來源的鞣酸酶的基因的全堿基序列示于序列號4。此外，測定了該堿基序列編碼的氨基酸序列(序列號5)。而且，序列號5所示的氨基酸序列所對應(yīng)的堿基序列除了序列號4所記載的之外，還存在多個。通過使用已經(jīng)清楚了全堿基序列的鞣酸酶基因(序列號4)的整體或其一部分作為雜交用探針，可以從其它產(chǎn)生鞣酸酶的微生物的基因組DNA文庫或cDNA文庫中選擇出與序列號4的鞣酸酶基因具有高同源性的DNA。同樣，還可以設(shè)計PCR用的引物。通過使用該引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，還可以檢測出與上述鞣酸酶基因同源性高的基因片段，進(jìn)而獲得其完整基因。通過制造獲得的基因的蛋白質(zhì)，測定其鞣酸酶活性，可以確認(rèn)是否是編碼具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)的基因。此外，還可以通過將獲得的基因的堿基序列(或其編碼的氨基酸序列)與上述鞣酸酶基因的堿基序列(或其編碼的氨基酸序列)進(jìn)行比較，研究基因結(jié)構(gòu)和同源性，判斷是否編碼具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)。由于弄清楚了一級結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)，因此通過隨機(jī)變異或定點(diǎn)突變的導(dǎo)入可以獲得改良型鞣酸酶(實(shí)施了1個或多個氨基酸殘基的缺失、添加、插入或取代中的至少一個的基因)。因此，可以獲得編碼具有鞣酸酶活性，而最適溫度、穩(wěn)定溫度、最適PH、穩(wěn)定pH、底物特異性等性質(zhì)不同的鞣酸酶的基因。此外，可以基因工程的方式制造改良型鞣酸酶。這里，導(dǎo)入變異時的計劃，例如，參考基因序列上的特征序列進(jìn)行。特征序列的參考，可以通過例如，該蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測、考慮與已知的蛋白質(zhì)的同源性來進(jìn)行。如要要例示導(dǎo)入隨機(jī)變異的方法，作為化學(xué)處理DNA的方法，是使亞硫酸氫鈉作用，發(fā)生胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的轉(zhuǎn)換型突變的方法〔Proceedings of thenational academy of Sciences of the USA、第 79 卷、第 1408 1412 頁(1982)〕、作為生物化學(xué)方法，是在〔α-S〕dNTP存在下，在合成雙鏈的過程中發(fā)生堿基取代的方法〔Gene、第 64卷、第313 319頁(1988)〕、作為使用PCR的方法，是在反應(yīng)系中加入錳進(jìn)行PCR，減少核苷酸整合的正確性的方法(Analytical Biochemistry、第2 卷、第347 353頁(1995)〕等。如要例示導(dǎo)入定點(diǎn)突變的方法，利用琥珀型突變的方法〔gapped duplex法、 Nucleic Acids Research、第 12 卷、第 M 號、第 9441 9456 頁(1984)〕、利用限制性酶的識別部位的方法(Analytical Biochemistry、第 200 卷、第 81 88 頁(1992)、Gene、第 102卷、第67 70頁(1991)〕、利用dut (dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖基化酶)變異的方法(Kunkel 法、Proceedings of the national academy of Sciences of the USA、第 82卷、第488 492頁(1985)〕、利用使用DNA聚合酶和DNA連接酶的琥珀型突變的方法〔 Oligonucleotide-directed Dual Amber :0DA 法、Gene、第 152 卷、第 271 275 頁(1995)、 特開平7489262號公報〕、利用使DNA的修復(fù)系統(tǒng)被誘導(dǎo)的宿主的方法(特開平8-70874 號公報)、利用催化DNA鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)的方法(特開平8-140685號公報)、通過使用了添加了限制性酶的識別部位的2種變異引入用引物的PCR進(jìn)行的方法(USP5，512，463)、 通過使用具有失活耐藥性基因的雙鏈DNA載體和2種引物的PCR進(jìn)行的方法〔Gene、第103 卷、第73 77頁(1991)〕、通過利用琥珀型突變的PCR進(jìn)行的方法〔國際公開W098/02535 號公報〕等。通過使用市售的試劑盒，也可以容易地導(dǎo)入定點(diǎn)突變。作為市售的試劑盒， 可以使用例如，使用gapped duplex法的Mutan (注冊商標(biāo))_G (TakaraBio公司)、使用Kunkel法的Mutan (注冊商標(biāo))_K (TakaraBio公司)、使用ODA法的Mutan (注冊商標(biāo))-ExpressKm (TakaraBio公司)、使用變異引入用引物和激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)來源的 DNA 聚合酶的 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔 STRATAGENE公司〕等，而且，作為利用PCR法的試劑盒，可以使用TaKafei LAPCR in vitro Mutagenesis Kit (TakaraBio 公司)、Mutan (注冊商標(biāo))-Super Express Km(TakaraBio 公司)等。這樣，通過本發(fā)明提供鞣酸酶的一級結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)，就可以便宜地高純度地以基因工程方式制造具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)。(重組載體)本發(fā)明的另一個方面涉及含有本發(fā)明基因的重組載體。本說明書中用語“載體” 是指可以將插入其中的核酸分子輸送到細(xì)胞等靶內(nèi)的核酸性分子，其種類和形態(tài)沒有特別限定。因此，本發(fā)明的載體可以形成質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、病毒載體(腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體等)的形態(tài)。根據(jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達(dá))，并考慮宿主細(xì)胞種類，選擇適當(dāng)?shù)妮d體。如果要列舉載體的具體例子，有以大腸桿菌作為宿主的載體(M13噬菌體或其變異體、λ噬菌體或其變異體、PBR322或其變異體(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母作為宿主的載體 (pYepSecUpMFa,pYES2等、以昆蟲細(xì)胞作為宿主的載體(pAc、pVL等)、以哺乳類細(xì)胞作為宿主的載體(pCDM8、pMT2PC等)等。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選是表達(dá)載體。所謂“表達(dá)載體”是指可以將插入于其中的核酸導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)、且在該細(xì)胞內(nèi)能夠使之表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常含有所插入的核酸表達(dá)所必需的啟動子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。還可以使用含有選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。在使用所述表達(dá)載體時，可以利用選擇標(biāo)記確認(rèn)表達(dá)載體是否導(dǎo)入 (及其程度)。本發(fā)明的基因向載體插入、選擇標(biāo)記基因的插入(必要時)、啟動子的插入(必要時)等，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(例如，可參照分子克隆，第3版，1.84，冷泉港實(shí)驗室出版，紐約，使用限制性酶和DNA連接酶的公知方法)進(jìn)行。(轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明還涉及導(dǎo)入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，本發(fā)明的基因作為外源性分子存在。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)先通過使用上述本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化來制備。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化可以通過磷酸鈣共沈降法、電穿孔(Potter, H. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. 81,7161-7165(1984))、脂質(zhì)法(Feigner, P. L. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84，7413-7417 (1984))、顯微注射(Graessmann, Μ· & Graessmann，Α.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 73，366-370 (1976))、Hanahan 的方法(Hanahan，D.，J. Mol. Biol. 166， 557-580(1983))、醋酸鋰法(Schiestl，R. H. et al. , Curr. Genet. 16，339-346 (1989))、原生質(zhì)體-聚乙二醇法(Yelton,M. Μ. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. 81,1470-1474(1984))等實(shí)施。作為宿主細(xì)胞，可以使用微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞等。作為微生物，可以列舉大腸桿菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、乳球菌(Lactococcus) 屬等的細(xì)菌、酵母菌(Saccharomyces)屬、畢赤酵母(Pichia)屬、克魯維酵母菌 (Kluyveromyces)屬等酵母、曲霉菌(Aspergillus)屬、青霉菌(Penicillium)屬、木霉菌 (Trichoderma)屬等絲狀真菌。作為動物細(xì)胞，可以列舉桿狀病毒的系統(tǒng)。(鞣酸酶的制造方法)本發(fā)明的另一個方面提供鞣酸酶的制造方法。本發(fā)明的制造方法的一個方式中， 進(jìn)行培養(yǎng)選自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的微生物的步驟(步驟(1))和從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和/或菌體中回收鞣酸酶的步驟(步驟(2))。 如后述的實(shí)施例所示，根據(jù)本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(表3的 No. 1725、NBRC-4033)、黑曲霉(Aspergillus niger)(表 3 的 No. 1332、No. 1349、No. 1363) 是產(chǎn)生耐熱性優(yōu)異的鞣酸酶的菌株。本發(fā)明的制造方法，優(yōu)先使用這些微生物中的任一種實(shí)施步驟(1)。更優(yōu)選的是，使用高生產(chǎn)耐熱性優(yōu)異的鞣酸酶的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) NBRC-4033 (IF0-4033)實(shí)施步驟(1)。培養(yǎng)法和培養(yǎng)條件只要是產(chǎn)生目的酶的，就沒有特別限定。即，作為生產(chǎn)本酶的條件，可以適當(dāng)設(shè)定適于使用的微生物的培養(yǎng)的方法和培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)法，可以是液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)中的任意一種，但優(yōu)選利用液體培養(yǎng)。以液體培養(yǎng)為例來說明其培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)基，只要是使用的微生物可以生長的培養(yǎng)基，就可以是任意一種。例如， 可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有機(jī)酸等碳源，以及硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、醋酸銨、或蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、麩子、肉提取物等氮源，以及鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機(jī)鹽的培養(yǎng)基。為了促進(jìn)使用的微生物的生長，還可以在培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸等。而且，為了誘導(dǎo)鞣酸酶的生產(chǎn)，還可以在培養(yǎng)基中添加鞣酸。培養(yǎng)基的PH調(diào)整到例如，約3 10，優(yōu)選約5 6左右，培養(yǎng)溫度通常在約10 50°C，優(yōu)先在約27 33°C左右，在1 7天，優(yōu)選3 4天左右的需氧條件下培養(yǎng)。作為培養(yǎng)法，可以利用例如振蕩培養(yǎng)法、用罐式發(fā)酵罐進(jìn)行的需氧的深部培養(yǎng)法。在以上條件下培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液或菌體中回收鞣酸酶(步驟O))。在從培養(yǎng)液中回收時，通過例如對培養(yǎng)上清進(jìn)行過濾、離心處理等除去不溶物后，適當(dāng)組合通過超濾膜進(jìn)行的濃縮、硫酸銨沉淀等鹽析、透析、離子交換樹脂等各種層析等，進(jìn)行分離和純化，獲得本酶。另一方面，在從菌體內(nèi)回收時，例如，可以在通過加壓處理、超音波處理等破碎菌體后，與上述方式一樣，進(jìn)行分離和純化，獲得本酶。而且，可以在通過過濾、離心處理等預(yù)先從培養(yǎng)液中回收菌體后，進(jìn)行上述一系列的工序(菌體的破碎、分離、純化)。本酶的純化度沒有特別限定。而且，最終形態(tài)既可以是液體狀也可以是固體狀(包括粉體狀)。而且，表達(dá)的確認(rèn)或表達(dá)產(chǎn)物的確認(rèn)，簡便的是使用針對鞣酸酶的抗體進(jìn)行，但也可以通過測定鞣酸酶活性進(jìn)行表達(dá)的確認(rèn)。在本發(fā)明的其它方式中，使用上述轉(zhuǎn)化體制造鞣酸酶。該方式的制造方法中，首先，在其中導(dǎo)入的基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(步驟(i))。各種載體宿主系統(tǒng)相關(guān)的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件是公知的，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以容易地設(shè)定適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。在培養(yǎng)步驟之后，回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(即、鞣酸酶)(步驟(ii))?；厥蘸推浜蟮募兓?，也可以與上述方式的情況一樣進(jìn)行。(酶劑)本酶以例如酶劑的形態(tài)提供。酶劑除了有效成分(本發(fā)明的酶)之外，還可以含有賦形劑、緩沖劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理食鹽水等。作為賦形劑，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨 (benzalkonium chloride)、苯甲醇、三氯叔丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對氧基苯甲酸、三氯叔丁醇等。(鞣酸酶的用途)本發(fā)明的另一個方面提供，使用本酶(或含有本酶的酶劑)的水解法作為本酶的用途。本發(fā)明的水解法中，使本酶(或含有本酶的酶劑)作用于鞣酸或含有鞣酸的組合物。 本發(fā)明的水解法對于含有鞣酸的食品的品質(zhì)改善是有效的。例如，可用于防止茶類飲料的冷后渾(Cream down)、防止果汁飲料或蔬菜飲料或啤酒類飲料等的沉淀或渾濁。這里所謂的“茶類飲料”，是含有茶葉或茶葉以外的植物的提取成分的飲料。茶類飲料的例子，是綠茶、紅茶、烏龍茶、杜仲茶、草藥茶等。所謂“果汁飲料”是用通過果實(shí)榨汁等方式獲得的果汁制造的飲料。同樣，所謂“蔬菜飲料”，是使用蔬菜汁制造的飲料?！捌【祁愶嬃稀敝邪ㄆ【?、發(fā)泡酒、和具有類似于啤酒的風(fēng)味· 口感的酒精飲料(酒稅上，被分類為其它雜類·利口酒類，所謂的第3啤酒等)。而且，本發(fā)明的水解法的作為適用對象的飲料不限于上述例子。例如，在加入果汁的茶類飲料、使用果汁和蔬菜汁的蔬菜水果飲料等的品質(zhì)改善中也可以使用本發(fā)明的水解法。如上所述的本酶穩(wěn)定作用的pH域很廣。S卩，本酶在pH3.0 8.0下穩(wěn)定，可以在弱酸性和中性域的食品等中使用。茶類飲料的PH處于中性域，果汁飲料PH處于弱酸性域， 但本酶對二者都有良好的作用。另一方面，本酶由于其最適溫度是60 70°C，例如，還可以在從茶葉中加熱提取的同時進(jìn)行反應(yīng)。而且，本酶，可以響應(yīng)“根據(jù)防腐的觀點(diǎn)來說，在高溫下的反應(yīng)是理想的”這樣的要求。而且，本酶由于在飲料的制造工序中的通常的加熱殺菌條件(例如95°C以上)下迅速失活，因此不需要用于使本酶失活的特別的加熱工序。不過，也不妨設(shè)置用于使本酶失活的加熱工序。
實(shí)施例 <鞣酸酶活性測定方法>如下所述，改變 Deschamps 的方法(J. Ferment. Technol. 61 [1] 55-59，1983)，測定鞣酸酶的活性。在含有鞋酸(Tannic acid, ACS Reagent〔 SIGMA〕)的 50mM 檸檬酸緩沖液 (ρΗ5· 0) 0. 5mL中添加酶溶液0. 5ml, 37°C、溫育30分鐘后，添加含有2% BSA的0. 2M醋酸緩沖液(pH5.0)停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后，在冰中靜置20分鐘后，3000rpm、離心20分鐘。將獲得的上清稀釋50倍，測定波長^Onm的吸光度。使用沒食子酸，制作校正曲線，以1分鐘內(nèi)游離1 μ mol的沒食子酸的酶量作為1個單位。<底物特異性測定方法>如下所示，通過Sharma的方法(Anal. Biochem. 279，85-89，2000)的改良方法研究底物特異性。在含有0. 17%鞣酸或IOmM沒食子酸酯(沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、沒食子酸丙酯和沒食子酸異戊酯)的50mM檸檬酸緩沖液(pH5. 0) 125 μ L中添加酶溶液125 μ L， 37°C、溫育30分鐘后，添加并混合含有0. 667%羅丹寧(Rhodanine)的甲醇300 μ L，靜置10 分鐘。然后，添加并混合0. 5Ν NaOH 200 μ L，靜置10分鐘。接著，用9mL的蒸餾水稀釋，放置 5分鐘后，測定波長520nm的吸光度。使用沒食子酸制成校正曲線，以1分鐘內(nèi)生產(chǎn)1 μ mol 沒食子酸的活性作為1個單位。1.耐熱性鞣酸酶產(chǎn)生菌的篩選對于在固體培養(yǎng)的浸液或液體培養(yǎng)的培養(yǎng)上清中確認(rèn)了鞣酸酶活性的各種菌株中，屬于黑曲霉(Aspergillus niger)的 5 個菌株(1332 株、1349 株、1363 株、9331 株、9；340 株)和屬于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的3個菌株(1725株、1736株、NBRC-4033 株)，研究其是否產(chǎn)生耐熱性鞣酸酶。將各個菌株在馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學(xué)) 上，于30°C培養(yǎng)10-14天直至實(shí)現(xiàn)良好的孢子形成。用滅菌孢子懸浮用緩沖液(0.85% NaCl、0.05% TWEEN(注冊商標(biāo))80)收集獲得的菌落上形成的孢子，制備孢子懸浮液。將該孢子懸浮液接種于表1的培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)3天。將該培養(yǎng)液接種于表2的培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)4天。[表1]
權(quán)利要求
1.一種鞋酸酶，來源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉(Aspergillus niger)，對于65°C的熱處理(ρΗ5· 0、30分鐘)具有耐性。
2.一種具有下述酶化學(xué)性質(zhì)的鞣酸酶(1)作用作用于縮酚酸鍵而進(jìn)行水解；(2)分子量約23萬Da(通過凝膠過濾測定)；(3)溫度穩(wěn)定性直到65°C都穩(wěn)定(ρΗ5·0,30分鐘)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鞣酸酶，還具有下述酶化學(xué)性質(zhì)(4)最適溫度約70°C；(5)最適 !1:約5.5;(6)pH穩(wěn)定性在pH3 8的范圍穩(wěn)定(3030分鐘)(7)底物特異性良好地作用于鞣酸，作用于沒食子酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鞣酸酶，來源于泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 0
5.一種鞣酸酶，具有序列號5所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列等價的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鞣酸酶，所述等價的氨基酸序列是與序列號5所示的氨基酸序列90 %以上相同的氨基酸序列。
7.一種酶劑，以權(quán)利要求1 6中任一項所述的鞣酸酶為有效成分。
8.一種鞣酸酶基因，由選自以下㈧ (C)中的任一項的DNA構(gòu)成(A)編碼序列號5所示的氨基酸序列的DNA；(B)由序列號4所示的堿基序列構(gòu)成的DNA;(C)具有與序列號4所示的堿基序列等價的堿基序列、且編碼具有鞣酸酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
9.一種重組載體，含有權(quán)利要求8所述的鞣酸酶基因。
10.一種轉(zhuǎn)化體，導(dǎo)入有權(quán)利要求8所述的鞣酸酶基因。
11.一種鞣酸酶的制造方法，其特征在于，包含以下的步驟(1)和O)，或包含以下的步驟⑴和(ii)(1)培養(yǎng)選自泡盛曲霄(Aspergillusawamori)禾口黑曲霄(Aspergillus niger)中的微生物的步驟，(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和/或菌體回收鞣酸酶的步驟；(i)在產(chǎn)生所述基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化體的步驟， ( )回收產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的鞣酸酶的制造方法，所述微生物是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IF0-4033)。
13.一種水解法，其特征在于，使權(quán)利要求1 6中任一項所述的鞣酸酶、權(quán)利要求7所述的酶劑、或用權(quán)利要求11或12所述的制造方法獲得的鞣酸酶作用于鞣酸或含有鞣酸的組合物。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供微生物來源的耐熱性鞣酸酶。提供泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉(Aspergillus niger)來源的耐熱性鞣酸酶。優(yōu)選的一個方式的鞣酸酶具有下述酶化學(xué)性質(zhì)(1)作用作用于縮酚酸鍵而進(jìn)行水解；(2)分子量約23萬Da(通過凝膠過濾產(chǎn)生)；(3)溫度穩(wěn)定性直到65℃都穩(wěn)定(pH5.0、30分鐘)。
文檔編號C12N5/10GK102203248SQ200980142179
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者中川惠美, 天野仁, 山口莊太郎, 松本直樹 申請人:天野酶株式會社