專利名稱：新型重組15-kDa多肽及其在人類漢賽巴爾通體感染檢測(cè)中的用途的制作方法
新型重組15-kDa多肽及其在人類漢賽巴爾通體感染檢測(cè)
中的用途相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35U. S.C. § 1. 119(e)要求于2008年8月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/189，803號(hào)的優(yōu)先權(quán)的利益，其全部公開(kāi)內(nèi)容在此整體通過(guò)引用并入。背景漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)是紅細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌，且是人類中貓抓病的病原體。據(jù)估計(jì)家貓中有觀％被漢賽巴爾通體慢性感染。被感染的貓通過(guò)貓抓或咬將巴爾通體細(xì)菌傳播給人們。疾病通常顯示為局部淋巴結(jié)病，且一些患者在被抓部位出現(xiàn)皮膚損傷。雖然貓抓病在大部分健康個(gè)體中是自限性的，但是近10%的患者可能發(fā)展為桿菌性血管瘤病、桿菌性紫癜、復(fù)發(fā)性菌血癥和感染性心內(nèi)膜炎。(^i,例如， Rochalimaea N.,等人，New England Journal of Medicine, 1994,330 :1509—1515 頁(yè))。年幼的兒童和免疫系統(tǒng)弱化的人易患巴爾通體感染。在HIV-I患者中，漢賽巴爾通體能夠?qū)е聴U菌性血管瘤病或紫癜樣肝病，后者可包括內(nèi)臟器官受累(visceral involvement)(Fournier, P. Ε.禾口 D. Raoult. 1998. Cat scratchdisease and an overview of other Bartonella henselae related infections (貓抓病和其它漢賽巴爾通體相關(guān)感染綜述)，32-62頁(yè))。目前一些用于巴爾通體感染的診斷測(cè)定是可用的。這些診斷測(cè)定包括(i)培養(yǎng)， (ii)免疫熒光測(cè)定(“IFA”)，和(iii)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)技術(shù)。從血液樣品中培養(yǎng)巴爾通體細(xì)菌被證明是繁瑣的且需要大量的時(shí)間(即，幾周)，因此使這種測(cè)定成為次優(yōu)的。由于不同的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件，其不利地影響方法的重復(fù)性。IFA并非定量測(cè)定，并且不會(huì)提供與敏感性和特異性相關(guān)的有用信息。此外，巴爾通體細(xì)菌的IFA具有與其它人類病原體(例如，貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)、立氏立克次體(Rickettsiarickettsii)、 查菲埃立克體(Ehrlichia chaffeensis)、梅毒螺旋體(Ti^ponemapallidum))存在交叉反應(yīng)性的技術(shù)問(wèn)題(Cooper, Μ. D.，Μ· R. Ho llingdal e，J. W. Vinson 和 J.Costa· 1976. A passive hemagglutination test for diagnosis oftrench fever due to Rochalimaea auintana(用于診斷由五日熱羅卡利馬氏體菌引起的戰(zhàn)壕熱的被動(dòng)血凝試驗(yàn))..T. Infect. Dis. 134 :605-9)。并且，IFA易于被個(gè)別技術(shù)人員主觀闡釋。最后，IFA是耗時(shí)的并且需要諸如熒光顯微鏡的昂貴設(shè)備。PCR技術(shù)利用巴爾通體細(xì)菌中的16S rRNA基因檢測(cè)病原體的存在。PCR具有對(duì)來(lái)自多個(gè)巴爾通體物種(例如，漢賽巴爾通體(Bartonellahenselae)、五日熱巴爾通體 (Bartonella quintana)(Bartonella bacilliformis) ^^ll^SE/Kffl 體(Bartonella elizabethae)禾口克氏巴爾通體(Bartonella clarridgeiae))的 DNA 進(jìn) 亍同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。PCR的問(wèn)題是在測(cè)定時(shí)需要檢驗(yàn)樣品中存在生物體或其DNA，以容許物種特異性鑒定。由于這種局限，PCR測(cè)定僅在感染的早期階段是有用的?？乖臋z測(cè)代表了檢測(cè)漢賽巴爾通體的替代方法。例如，ELISA代表了能夠提供良好靈敏度和特異性的定量檢測(cè)測(cè)定。遺憾的是，已顯示僅有有限數(shù)量的來(lái)自巴爾通體細(xì)菌的抗原對(duì)巴爾通體的血清學(xué)檢測(cè)是有用的。Loa等人報(bào)道了 ELISA開(kāi)發(fā)中來(lái)自巴爾通體的17kDa蛋白的使用(Loa等人，2007)。仍然需要鑒定可用于血清學(xué)檢測(cè)的新型巴爾通體細(xì)菌抗原。本發(fā)明人已解決了先前技術(shù)中的這個(gè)缺陷，且從漢賽巴爾通體中成功克隆了基因且表達(dá)了相應(yīng)的多肽。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)15-kDa多肽對(duì)提供檢測(cè)患者血清中漢賽巴爾通體抗體存在的免疫測(cè)定是非常有用的。本文所公開(kāi)的抗原是新型的且在巴爾通體感染領(lǐng)域中提供了改良的臨床診斷工具。發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離的巴爾通體的virB7基因的克隆和表達(dá)，從而提供分子量為 15-kDa的重組蛋白。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該15-kDa蛋白在檢測(cè)漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)的診斷檢驗(yàn)中的ELISA測(cè)定中是有用的。在一方面，本發(fā)明提供了重組的15-kDa多肽。在另一方面，該15_kDa蛋白具有 SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含具有SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列的重組多肽和支持物。該支持物可以是微量滴定孔、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的15-kDa多肽的分離的多核苷酸。在一方面，本發(fā)明提供了編碼SEQ ID NO :2所列的多肽的分離的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了具有SEQ D NO :1所列的核苷酸序列的分離的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的分離的多核苷酸的表達(dá)載體，該表達(dá)載體與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)調(diào)控序列含有Iac 啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，載體是大腸桿菌(E.coli)的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的分離的多核苷酸和載體的重組宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的重組多肽的方法，該方法包括以下步驟 (a)將分離的多核苷酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，所述分離的多核苷酸具有SEQ ID NO :1所列的核苷酸序列；(b)在適宜條件下在培養(yǎng)物中使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以允許所述重組多肽產(chǎn)生； 和(c)分離所述重組多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)哺乳動(dòng)物的生物樣品中抗?jié)h賽巴爾通體抗體存在的方法，該方法包括以下步驟(a)將本發(fā)明的重組多肽固定在表面上；(b)在允許抗體-抗原復(fù)合物形成的條件下使所述重組多肽與生物樣品接觸；和(c)檢測(cè)所述抗體-抗原復(fù)合物的形成，其中所述抗體-抗原復(fù)合物的存在表明所述生物樣品中的所述抗?jié)h賽巴爾通體抗體的存在。在另一方面，本發(fā)明提供了診斷哺乳動(dòng)物中漢賽巴爾通體感染的方法，該方法包括以下步驟(a)從懷疑患有漢賽巴爾通體感染的哺乳動(dòng)物獲取生物樣品；(b)將本發(fā)明的重組多肽固定在表面上；(c)在允許抗體-抗原復(fù)合物形成的條件下，使所述重組多肽與所述生物樣品接觸；和(d)檢測(cè)所述抗體-抗原復(fù)合物，其中所述檢測(cè)的抗體-抗原復(fù)合物表明所述生物樣品中的抗?jié)h賽巴爾通體抗體的存在。在又一方面，本發(fā)明提供了制品或試劑盒，所述制品或試劑盒包括本發(fā)明的重組多肽和說(shuō)明所述重組多肽在抗?jié)h賽巴爾通體抗體存在的檢測(cè)中使用的說(shuō)明書(shū)。


圖1描繪了漢賽巴爾通體VirB操縱子的基因組組構(gòu)。箭頭代表不同毒力蛋白的開(kāi)放閱讀框。編碼漢賽巴爾通體15-kDa抗原的基因(基因座標(biāo)簽(locus tag)BH13310) 存在于virB7操縱子中。圖2描繪了漢賽巴爾通體中全長(zhǎng)15-kDa基因(SEQ ID NO 1)的核苷酸序列，該核苷酸序列先前存儲(chǔ)在NCBI GenBank (GeneID :2865504)中。圖3描繪了漢賽巴爾通體中15-kDa多肽(SEQ ID NO 2)的氨基酸序列，該氨基酸序列先前存儲(chǔ)在NCBI GenBank (編號(hào)#YP 034056)中。圖乜描繪了使用Phobius在線工具(http://phobius. sbc. su. se)得到的漢賽巴爾通體中15-kDa蛋白的跨膜拓?fù)鋵W(xué)。根據(jù)該模型，15-kDa蛋白含有單一跨膜區(qū)，該單一跨膜區(qū)跨越了 SEQ ID NO 2的氨基酸殘基37至55的區(qū)域。圖4b描繪了使用SOSUI (膜蛋白的分類和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)系統(tǒng))在線工具(http// bp. nuap. nagoya-u. ac. jp/sosui)得到的細(xì)胞膜內(nèi)15_kDa蛋白的預(yù)測(cè)的拓?fù)鋵W(xué)。根據(jù)該模型，15-kDa(virB7)蛋白的預(yù)測(cè)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明了單一跨膜螺旋的存在，該單一跨膜螺旋跨越了 SEQ ID NO 2的殘基37-55的區(qū)域。圖5示出了利用梯度PCR方法對(duì)來(lái)自漢賽巴爾通體Houston-I菌株基因組DNA的 15-kDa基因的PCR擴(kuò)增。對(duì)于6種不同退火溫度中的每一種在瓊脂糖凝膠上都觀察到了預(yù)期大小( 411bp)的單個(gè)擴(kuò)增子。圖6是含有T7啟動(dòng)子和His標(biāo)簽序列框內(nèi)的15_kDa基因的重組pET30載體的示意圖。圖7示出了 pET30載體中的重組15-kDa基因轉(zhuǎn)化到NovaBlue大腸桿菌中之后的 PCR擴(kuò)增。從生長(zhǎng)在LB板上的NovaBlue大腸桿菌中隨機(jī)選擇10個(gè)菌落，并通過(guò)PCR擴(kuò)增。圖8示出了 pET30載體中的重組15_kDa基因轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌中之后的PCR擴(kuò)增。從生長(zhǎng)在LB板上的BL21(DE3)大腸桿菌中隨機(jī)選擇10個(gè)菌落，并通過(guò)PCR 擴(kuò)增。圖9示出了重組15-kDa蛋白的IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析的工作流程。圖10描繪了 IPTG誘導(dǎo)的15-kDa蛋白的考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠。如文中所描述的，在IPTG加入之前使BL21大腸桿菌中的重組15-kDa在補(bǔ)充有葡萄糖的LB中生長(zhǎng)。在含IPTG的LB中孵育細(xì)胞指定的時(shí)間(2. 0-3. 5小時(shí))。箭頭指向預(yù)期大小( 21-kDa)的誘導(dǎo)的蛋白條帶。圖11描繪了 IPTG誘導(dǎo)的15-kDa蛋白的考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠。如文中所描述的，在IPTG加入之前使BL21大腸桿菌中的重組15-kDa在補(bǔ)充有葡萄糖的LB中生長(zhǎng)。在含IPTG的LB中孵育細(xì)胞指定的時(shí)間(3. 5小時(shí))。箭頭指向預(yù)期大小( 21-kDa) 的誘導(dǎo)的蛋白條帶。在對(duì)照泳道(即，“無(wú)IPTG”)中未觀察到誘導(dǎo)。圖12是描繪表達(dá)重組15-kDa蛋白的大腸桿菌細(xì)胞的可溶級(jí)分和不溶(內(nèi)含體) 級(jí)分的純化方案的流程圖。圖13描繪了利用抗6XHis標(biāo)簽的單克隆抗體對(duì)純化的重組15_kDa蛋白進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)(硝酸纖維素膜上的半干印跡)?？贵w與 21-kDa的蛋白條帶(即， 15-kDa+6XHis標(biāo)簽和相關(guān)序列的6-kDa)交叉反應(yīng)?？贵w還與 12_kDa的蛋白條帶交叉反應(yīng)。圖14描繪了考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠，其顯示了 15_kDa的鎳樹(shù)脂(Ni-NTA) 純化后獲得的蛋白級(jí)分。利用M-NTA在尿素變性條件下將含有15-kDa蛋白的裂解變性緩沖液進(jìn)行洗脫。FT =流經(jīng)，Wl =洗滌1 (pH6. 3)，W2 =洗滌2 (pH 6. 3)，E1-E5 =洗脫1-5， (pH 5. 9)，E6-E10 =洗脫6_10，ρΗ4· 5。15-kDa蛋白的大部分(E6、E7中的箭頭所示)洗脫在這兩個(gè)級(jí)分中。圖15描繪了考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠，其顯示了重組15_kDa蛋白的8個(gè)獨(dú)立的制備物(P1-P8)。將來(lái)自8個(gè)制備物各自的洗脫級(jí)分6和洗脫級(jí)分7在單一管中合并， 并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。圖16示出了利用重組的15-kDa蛋白覆蓋ELISA板的ELISA數(shù)據(jù)。對(duì)4個(gè)IFA陽(yáng)性(HHP =極高陽(yáng)性、高陽(yáng)性、中陽(yáng)性和低陽(yáng)性)和4個(gè)IFA陰性患者血清樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。圖17示出了利用重組的15-kDa蛋白覆蓋ELISA板的IgG ELISA數(shù)據(jù)。對(duì)10個(gè) IFA陽(yáng)性(HHP =極高陽(yáng)性、高陽(yáng)性、中陽(yáng)性和低陽(yáng)性)和10個(gè)IFA陰性患者血清樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。圖18示出了利用重組的15-kDa蛋白覆蓋ELISA板的IgM ELISA數(shù)據(jù)。對(duì)2個(gè) IFA陽(yáng)性和2個(gè)IFA陰性患者血清樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。發(fā)明詳述從以下結(jié)合附圖的優(yōu)選實(shí)施方案的描述中，本發(fā)明可被更好的理解。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是本文所提供的所描述的本發(fā)明的實(shí)施方案僅是示例性和例證性的而非限制性的。認(rèn)為本發(fā)明的實(shí)施方案的改變形式的大量實(shí)施方案屬于本發(fā)明及其等同物的范圍內(nèi)。本文所提到的所有出版物、專利申請(qǐng)和其它參考文獻(xiàn)以其整體通過(guò)引用并入。定義如本文所用的術(shù)語(yǔ)“15-kDa”是指具有SEQ D NO 2所列的氨基酸序列的多肽。該多肽代表漢賽巴爾通體的virB7蛋白(IV型分泌蛋白系統(tǒng)中的12種蛋白之一)。本發(fā)明人所示的15-kDa多肽在ELISA測(cè)定中與巴爾通體患者血清中所存在的抗體結(jié)合。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，該15-kDa旨在包括一些變異，只要這些變異在ELISA測(cè)定中具有與巴爾通體患者血清相互作用的能力即可。本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員將理解氨基酸序列變異可包括氨基酸的保守性取代或缺失。還應(yīng)理解的是具有99%或95%同一性的多肽可具有結(jié)合能力且因此包含在本發(fā)明之中。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”(當(dāng)在多肽和核酸的情況下使用時(shí))意思是多肽或核酸與可能被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)與所述多肽或核酸在一起的其它物質(zhì)基本上脫離。尤其是，多肽和核酸是基本上純的以便可用于，例如，生成抗體、表達(dá)或產(chǎn)生藥物制劑。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”是指在宿主微生物中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適宜于原核生物的調(diào)控序列包括例如，啟動(dòng)子、任選的操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指含有載體并支持載體的復(fù)制和表達(dá)的細(xì)胞。 宿主細(xì)胞可以是諸如大腸桿菌的原核細(xì)胞或諸如酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的真核細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入的”是指將核酸插入到細(xì)胞中，其包括“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”并包括如下含義將核酸整合入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中，在該真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中核酸可能整合入細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體DNA或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或被瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“ELISA”是指“酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定”，是用于檢測(cè)樣品中抗體或抗原存在的生物化學(xué)技術(shù)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指哺乳動(dòng)物綱的任何脊椎動(dòng)物，其身體具有或多或少的毛發(fā)覆蓋，用來(lái)自乳腺的乳汁養(yǎng)育幼兒，且除產(chǎn)卵的單孔類動(dòng)物外，生產(chǎn)幼崽。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“％氨基酸序列同一性”定義為與15-kDa多肽的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方式實(shí)現(xiàn)用于測(cè)定氨基酸序列同一性目的的比對(duì)，例如，使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件的公開(kāi)可得的計(jì)算機(jī)軟件。 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”或“蛋白”可交換使用。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”包括如下的含義啟動(dòng)子和第二個(gè)序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列起始并介導(dǎo)與第二個(gè)序列對(duì)應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常， “可操作地連接”意思是所連接的核苷酸序列是連續(xù)的并且，在需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域時(shí)是連續(xù)的且在同一閱讀框中。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”包括轉(zhuǎn)錄起始上游的且參與識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白以起始轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域的含義。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“重組體”包括通過(guò)異源核苷酸的導(dǎo)入而被修飾的細(xì)胞或載體或來(lái)源于經(jīng)上述這種修飾的細(xì)胞的細(xì)胞的含義。如本文所用的，“載體”可以是通過(guò)限制性酶消化和連接將所需序列插入到其中以在不同基因環(huán)境之間轉(zhuǎn)運(yùn)或在宿主細(xì)胞中表達(dá)的大量核酸中的任一種。載體通常由DNA組成，但RNA載體也是可用的。載體包括，但不局限于，質(zhì)粒和噬菌粒?？寺≥d體是能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的載體，其特征還包括一個(gè)或多個(gè)核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)，在該核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)可通過(guò)可測(cè)定的方式切割載體并將所需DNA序列連接到其中從而使得到的新型重組載體保留其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情況下，當(dāng)質(zhì)粒在宿主細(xì)菌中的拷貝數(shù)增加時(shí)，所需序列的復(fù)制可發(fā)生很多次；或當(dāng)宿主通過(guò)有絲分裂復(fù)制時(shí)所需序列的復(fù)制在每個(gè)宿主中僅發(fā)生一次。表達(dá)載體是可以通過(guò)限制性酶消化和連接在其中插入所需DNA序列從而使所需DNA序列與調(diào)控序列可操作地連接并作為RNA轉(zhuǎn)錄物被表達(dá)的載體。載體還可包含適用于鑒定細(xì)胞是否被載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物序列。標(biāo)志物包括例如， 編碼對(duì)抗生素或其它化合物抗性或敏感性增加或減少的蛋白的基因、編碼其活性通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定可檢測(cè)的酶(例如，β -半乳糖苷酶或堿性磷酸酶)的基因和明顯影響被轉(zhuǎn)化或被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、宿主、菌落或噬菌斑的表型的基因。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制并表達(dá)其所可操作地連接的DNA區(qū)段中存在的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的那些。漢賽巴爾通體的15-kDa多肽本發(fā)明包括具有SEQ ID NO 2所列的氨基酸序列的分離的15_kDa多肽。在漢賽巴爾通體中，已知virB操縱子除了別的以外包含編碼15-kDa多肽的virB7基因(Alsmark 等人，2004)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 15-kDa多肽變體，只要這些變體與取自巴爾通體感染患者的血清中存在的抗體相互作用即可?？赏ㄟ^(guò)多種方式對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行改變，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。這些操作的方法通常是本領(lǐng)域中公知的。例如，氨基酸序列變異可通過(guò)DNA中的突變來(lái)制備。誘變和核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域中公知的。本發(fā)明旨在包括保守性取代、比如將一種氨基酸與另一種進(jìn)行交換而不改變對(duì)取自巴爾通體感染患者的血清中存在的抗體的結(jié)合性質(zhì)。本發(fā)明旨在包括與15-kDa多肽具有> 95%和> 99%氨基酸同一性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其編碼具有SEQID NO 2所列的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :1所列的核苷酸序列的分離的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括為SEQ D NO :1所列的核酸殘基的變體的分離的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體包括含有簡(jiǎn)并密碼的核酸殘基。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)15-kDa多肽作為抗原發(fā)揮作用，推測(cè)其在哺乳動(dòng)物中引起特異的免疫反應(yīng)。因此在感染漢賽巴爾通體的哺乳動(dòng)物中，引起抗15-kDa多肽的免疫反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括構(gòu)成抗原的本發(fā)明的多核苷酸，所述抗原對(duì)患有漢賽巴爾通體感染的血清陽(yáng)性患者中存在的抗體具有特異的結(jié)合活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗原具有對(duì)患有漢賽巴爾通體感染的血清陽(yáng)性患者中存在的IgG或IgM同種型的特異結(jié)合活性。可復(fù)制載體的選擇可將編碼本發(fā)明的15-kDa的核酸(例如，基因組DNA)插入到可復(fù)制載體中以進(jìn)行克隆(DNA的擴(kuò)增)或表達(dá)。多種載體是公開(kāi)可得的。載體可以是，例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式?？赏ㄟ^(guò)多種程序?qū)⒑线m的核酸序列插入到載體中。通常，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)中。載體組分通常包括，但不局限于，一個(gè)或多個(gè)信號(hào)序列、復(fù)制起始點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。含有這些組分中的一個(gè)或多個(gè)的適宜載體的構(gòu)建使用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。大量啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的實(shí)踐。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用在大腸桿菌中指導(dǎo)本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子。多種來(lái)源的其它等效轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。15-kDa不僅可直接重組產(chǎn)生，還可作為與異源多肽的融合多肽產(chǎn)生，該異源多肽可以是信號(hào)序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特異切割位點(diǎn)的其它多肽。通常，信號(hào)序列可以是載體的組分，或可以是插入到載體中的15-kDa編碼DNA的一部分。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列可用來(lái)指導(dǎo)蛋白分泌，比如來(lái)自同樣或相關(guān)物種的分泌多肽的信號(hào)序列，以及病毒分泌前導(dǎo)序列。表達(dá)載體和克隆載體都含有使載體能夠在一種或多種選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。用于多種細(xì)菌、酵母和病毒的這種序列是公知的。表達(dá)載體和克隆載體通常將含有選擇基因，也叫做可選擇標(biāo)志物。典型的選擇基因編碼如下的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，例如，氨芐西林、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中無(wú)法獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)
9物，例如，編碼桿狀菌D-丙氨酸消旋酶的基因。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的適宜的可選擇標(biāo)志物的例子包括能夠鑒定有能力攝入 15-kDa編碼核酸的細(xì)胞的那些，比如DHFR或胸苷激酶。當(dāng)使用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系，該CHO細(xì)胞系如tolaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216(1980)所描述的進(jìn)行制備和繁殖。用于酵母的適宜的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒 YRp7 中的 trpl 基因 Gtinchcomb 等人，Nature, 282 :39(1979) ；Kingsman 等人， Gene, 7 :141(1979) ；Tschemper 等人，Gene, 10 :157(1980))。trpl 基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)的能力的酵母突變株提供了可選擇標(biāo)志物，例如，ATCC第44076號(hào)或PEP4-1 (Jones, Genetics,85 :12(1977))。表達(dá)載體和克隆載體通常包含與15-kDa編碼核酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子以指導(dǎo)mRNA合成。多種潛在宿主細(xì)胞所識(shí)別的啟動(dòng)子是公知的。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等人，Nature，275 :615(1978) ；Goeddel等人， Nature, 281 :544 (1979))、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel, Nucleic Acids Res. ,8 :4057(1980) ；EP 36，776)、和諸如 tac 啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子(deBoer 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :21-25 (1983))。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還將包含與編碼15-kDa的 DNA可操作地連接的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。由高級(jí)真核生物進(jìn)行的編碼15-kDa的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入到載體中而提高。增強(qiáng)子是通常大約從IObp到300bp的DNA順式作用元件，可作用于啟動(dòng)子而提高DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列是已知的。然而通常將會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括復(fù)制起始點(diǎn)后側(cè)的SV40增強(qiáng)子(100-270bp)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起始點(diǎn)后側(cè)的多瘤增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子?？蓪⒃鰪?qiáng)子在15-kDa編碼序列的5'位置或3' 位置剪接到載體中，但優(yōu)選地位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。用于真核宿主細(xì)胞(酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、人類細(xì)胞或來(lái)自其他多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還將包含轉(zhuǎn)錄終止所需和使mRNA穩(wěn)定所需的序列。這種序列通?？蓮恼婧说幕虿《镜腄NA或cDNA的5'端非翻譯區(qū)獲得，偶爾從3'端非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)域含有被轉(zhuǎn)錄為編碼15-kDa的mRNA的非翻譯部分中的多聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化用本文所描述的用于15-kDa生產(chǎn)的表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 并在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，所述常規(guī)培養(yǎng)基經(jīng)改良適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。培養(yǎng)條件，比如培養(yǎng)基、溫度、PH及其類似條件，可由技術(shù)人員進(jìn)行選擇以避免不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。通常，使細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)率最大化的原理、實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)踐技術(shù)可在 Mammalian Cell Biotechnology :a Practical Approach (哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物技術(shù)實(shí)踐方法)，Μ. Butler，編輯.(IRL Press, 1991)中查找。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法是普通技術(shù)人員已知的，例如，CaCl2, Ca2PO4、脂質(zhì)體介導(dǎo)和電穿孔。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，利用適合這種細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用氯化鈣進(jìn)行的鈣處理，如Sambrook等人所描述的，或電穿孔通常用于原核生物。對(duì)于沒(méi)有這種細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可采用Graham和van der Eb, ViroloRY,52 456-457(1978)的磷酸鈣沉淀方法。酵母中的轉(zhuǎn)化通常按照Van Solingen等人，Τ. Bact., 130 :946(1977)和 Hsiao 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，76 :3829(1979)的方法進(jìn)行。 但是，其它將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法也可使用，比如通過(guò)核微注射、電穿孔、細(xì)菌與完整細(xì)胞的原生質(zhì)體融合或聚陽(yáng)離子，例如聚凝胺、聚鳥(niǎo)氨酸。對(duì)于用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種技術(shù)，參見(jiàn) Keown 等人，Methods inEnzymology (酶學(xué)方法)，185 :527-537 (1990)和 Mansour 等人，Nature, 336 :348-352 (1988)。本文中用于在載體中克隆或表達(dá)DNA的適宜的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或高等真核細(xì)胞。適宜的原核生物包括但不局限于真細(xì)菌、比如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科(enterobacteriaceae)比如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株是公開(kāi)可得的，比如大腸桿菌K12菌株匪294(ATCC 31，446)；大腸桿菌X1776 (ATCC 31， 537)；大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772 (ATCC 53,635) 其它適宜的原核宿主細(xì)胞包括腸桿菌科，諸如埃希氏桿菌屬，例如，大腸桿菌；腸細(xì)菌屬(Enterobacter)； 歐文氏菌屬(Erwinia)；克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)；變形桿菌屬(Proteus)；沙門氏菌屬(Salmonella)，例如，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌屬 (Serratia)，例如，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌屬(Shigella)以及諸如枯草桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)的桿菌和諸如綠膿桿菌 (P. aeruginosa)的假單胞菌屬(I^seudomonas)和鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)。這些例子是示例性而非限制性的。葡萄糖和IPTG提高了細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白表達(dá)向細(xì)菌培養(yǎng)物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是誘導(dǎo)Iac啟動(dòng)子調(diào)控下的基于質(zhì)粒的基因表達(dá)以產(chǎn)生重組蛋白的長(zhǎng)期方式。IPTG與大腸桿菌中的Iac抑制子結(jié)合，因此阻止抑制子蛋白與DNA的結(jié)合并阻斷基因轉(zhuǎn)錄。利用IPTG誘導(dǎo)方法在大腸桿菌中表達(dá)重組的15-kDa蛋白。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物在含有 IPTG的細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，LB)中生長(zhǎng)時(shí)獲得低水平的蛋白表達(dá)。令人驚奇的是，在IPTG誘導(dǎo)前加入葡萄糖顯著提高蛋白表達(dá)水平。雖然并不受任何理論制約，本發(fā)明人認(rèn)為15-kDa 蛋白表達(dá)達(dá)到了變?yōu)閷?duì)細(xì)胞具有毒性的表達(dá)水平。葡萄糖的加入能夠提高15-kDa在內(nèi)含體中的局部化，因此使細(xì)胞免受毒性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)在IPTG誘導(dǎo)前加入葡萄糖而在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中提高蛋白表達(dá)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將葡萄糖以大約5mg/mL-10mg/mL之間的范圍加入，并且更優(yōu)選地以大約8mg/mL至10mg/mL的范圍加入。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)在IPTG誘導(dǎo)前加入葡萄糖而將蛋白表達(dá)集中在細(xì)胞的不溶級(jí)分的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將葡萄糖以大約5mg/mL-10mg/mL之間的范圍加入，并且更優(yōu)選地以大約8mg/mL至10mg/mL的范圍加入。檢測(cè)基因擴(kuò)增/表達(dá)基因擴(kuò)增和/或表達(dá)可在樣品中直接測(cè)量，例如，通過(guò)常規(guī)DNA印跡法、RNA印跡法對(duì) mRNA 的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行定量(Thomas，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :5201-5205 (1980))、斑點(diǎn)印跡法(DNA分析)、或利用合適標(biāo)記的探針以本文所提供的序列為基礎(chǔ)進(jìn)行原位雜交。 可選地，可使用能夠識(shí)別特異雙鏈體的抗體，該特異雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、和 DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體。繼而可對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，并進(jìn)行測(cè)定，在該測(cè)定中雙鏈體與表面結(jié)合，使得一旦在表面上形成雙鏈體，就可以檢測(cè)到與雙鏈體結(jié)合的抗體的存在。可選地，可通過(guò)免疫學(xué)方法測(cè)量基因表達(dá)以直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)，所述免疫學(xué)方法比如細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測(cè)定。對(duì)免疫組織化學(xué)染色和/或樣品液體的測(cè)定有用的抗體可以是單克隆的或多克隆的，并且可以在任何哺乳動(dòng)物中制備。方便地，可以制備如下的抗體針對(duì)天然序列的15-kDa多肽或針對(duì)基于本文提供的DNA序列的合成肽或針對(duì)與15-kDa DNA融合且編碼特異抗體表位的外源序列。重組的15-kDa多肽的純化重組的15-kDa表達(dá)以后，可從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物中將其回收。如果是膜結(jié)合的，可利用適宜的洗滌劑溶液(例如，Triton-X 100)或通過(guò)酶切割使其從膜中釋放。 可通過(guò)多種物理或化學(xué)方法破壞用于15-kDa表達(dá)的細(xì)胞，這些方法比如凍融循環(huán)法、超聲法、機(jī)械破壞法或細(xì)胞裂解劑。從重組細(xì)胞蛋白或多肽中純化15-kDa是期望的。以下的程序是適宜的純化程序的示例通過(guò)離子交換柱進(jìn)行分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相HPLC ；在硅膠或在諸如DEAE的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上進(jìn)行色譜；色譜聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；利用，例如，Sephadex G-75 進(jìn)行凝膠過(guò)濾；蛋白A瓊脂糖凝膠柱以除去諸如IgG的污染物；以及金屬螯合柱以結(jié)合帶表位標(biāo)簽的(印itope-tagged)形式的15_kDa?？刹捎枚喾N蛋白純化的方法并且這些方法是本領(lǐng)域已知的，并且在諸如Deutscher, Methods inEnzymoloRY (酶學(xué)方法)，182 (1990)； Scopes, Protein Purification Principlesand Practice (蛋白純化原 禾口實(shí)踐)， Springer-Verlag, New York(1982)中描述。所選擇的純化步驟將根據(jù)例如所用的生產(chǎn)方法的性質(zhì)和所產(chǎn)生的特定的15-kDa而不同。利用15-kDa多肽檢測(cè)和診斷漢賽巴爾通體的方法本發(fā)明提供了利用以上所描述的分離的核苷酸和15-kDa多肽檢測(cè)漢賽巴爾通體的方法。本發(fā)明還包括診斷哺乳動(dòng)物中的漢賽巴爾通體，該診斷包括對(duì)取自所述哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞檢驗(yàn)樣品中的15-kDa的存在或不存在進(jìn)行檢測(cè)，其中所述檢驗(yàn)樣品中15-kDa 的存在或不存在表明了所述哺乳動(dòng)物中漢賽巴爾通體的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用諸如ELISA的免疫測(cè)定以檢測(cè)15_kDa并從而診斷漢賽巴爾通體是否存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，血清、尿或子宮分泌物的樣品可獲自患者， 并且可與本發(fā)明的15-kDa多肽相接觸。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)抗體與 15-kDa的結(jié)合。15-kDa可以，例如，被固定在基底上，并與樣品接觸從而允許抗原與表位的結(jié)合，且然后洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)。然后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)合蛋白的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血清、尿或子宮分泌物的樣品可獲自患者，并且可與15-kDa 抗體相接觸?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)抗體與15-kDa的結(jié)合。15-kDa表位的抗體可以，例如，被固定在基底上，與樣品接觸以允許抗體與表位的結(jié)合，且然后洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)。然后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)合蛋白的存在?？蛇x地，測(cè)定可以是“夾心”型的，其中首先將第一組15-kDa抗體與樣品接觸，然后洗滌，然后加入第二 15-kDa表位的標(biāo)記的抗體。第二組抗體的結(jié)合表明與第一組結(jié)合的15-kDa的存在。所用標(biāo)記可以是本領(lǐng)域已知的任何一種(例如，酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記)。其它的抗體檢驗(yàn)，包括競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)，對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將是明顯的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫相關(guān)疾病制品或診斷試劑盒，所述免疫相關(guān)疾病制品或診斷試劑盒包括適宜包裝的本發(fā)明的15-kDa多肽或抗15-kDa抗體以及運(yùn)載體。該試劑盒優(yōu)選地含有使用15-kDa多肽或抗體分別檢測(cè)抗15-kDa抗體或15-kDa多肽的存在的說(shuō)明書(shū)。優(yōu)選地所述載體是藥學(xué)上可接受的。ELISA 測(cè)定可通過(guò)ELISA測(cè)定對(duì)與漢賽巴爾通體特異性結(jié)合的抗體存在的檢測(cè)進(jìn)行分析。首先將漢賽巴爾通體抗原固定在表面上。然后加入生物樣品(比如血液、血漿或血清)。允許生物樣品中存在的抗體與所結(jié)合的漢賽巴爾通體抗原相結(jié)合。洗滌后，可加入結(jié)合有可檢測(cè)部分的二抗以增強(qiáng)檢測(cè)。ELISA可易于適合完成與漢賽巴爾通體抗原和與其特異性結(jié)合的抗體二者的檢測(cè)。IgG ELISA可按以下程序進(jìn)行⑴將漢賽巴爾通體抗原固定在表面上；⑵使所結(jié)合的抗原與來(lái)自哺乳動(dòng)物的含有抗體的生物樣品相接觸；C3)加入具有可檢測(cè)部分(例如，辣根過(guò)氧化物酶)的抗人IgG抗體；(4)加入酶的底物；(5)加入顯色劑。顏色變化表明了 IgG抗體的存在。IgM ELISA可用與以上所描述的IgG ELISA相似的實(shí)驗(yàn)方案(S卩，將15_kDa蛋白固定在表面上)來(lái)進(jìn)行?？蛇x地，IgM ELISA可按照以下步驟通過(guò)“抗體捕捉”來(lái)進(jìn)行(1)將抗人IgM抗體固定在表面上；( 使所結(jié)合的抗體與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品接觸；C3)使以上與生物素化的漢賽巴爾通體抗原(例如，15-kDa)接觸；(4)加入鏈霉抗生物素-辣根過(guò)氧化物酶； (5)加入顯色劑。顏色變化表明了 IgM抗體的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了 IgM捕捉 ELISA。特別地，用山羊抗人IgM抗體覆蓋平底96孔聚苯乙烯板，然后加入包括5種陰性對(duì)照在內(nèi)的血清的連續(xù)的兩倍稀釋物，生物素化的漢賽巴爾通體或陰性對(duì)照抗原，和山羊抗鏈霉抗生物素-辣根過(guò)氧化物酶和底物(TMB)。在每?jī)蓚€(gè)步驟之間，將板在37°C下孵育1 小時(shí)，然后用在磷酸鹽緩沖鹽水(PH7.4)中的0.05% Tween 20洗滌3次。當(dāng)檢測(cè)漢賽巴爾通體抗原時(shí)和陰性對(duì)照抗原時(shí)血清樣品中的吸光度差異超過(guò)被檢測(cè)漢賽巴爾通體和陰性對(duì)照抗原二者的5個(gè)陰性對(duì)照血清的平均值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，則血清的稀釋物被認(rèn)為是陽(yáng)性的。IgG和IgM ELISA測(cè)定對(duì)于貓抓病和桿菌性血管瘤的診斷均是有效的。為進(jìn)一步例證本發(fā)明的各種優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)，提供了以下的實(shí)施例。然而， 應(yīng)該理解這些實(shí)施例并不限制權(quán)利要求書(shū)中所描述的本發(fā)明的范圍。許多變化形式和修改形式將包括在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1 VirB7 (15-kDa)基因和其蛋白產(chǎn)物(15_kDa蛋白)virB7 (15-kDa)基因的基因組定位在漢賽巴爾通體中，已知VirB操縱子除其他外含有編碼15-kDa多肽的virB7基因(Alsmark等人，2004)。virB7基因產(chǎn)物(即，15-kDa)的功能很大程度上還是未知的。已顯示virB7基因的蛋白產(chǎn)物和virB5基因的蛋白產(chǎn)物在物理上是連接著的。兩種蛋白產(chǎn)物都屬于巴爾通體中的IV型分泌系統(tǒng)(TIVSS) (Shamaei-Tousi，2004)。圖1描繪了漢賽巴爾通體中的VirB操縱子的組構(gòu)。
15-kDa多肽是預(yù)測(cè)的具有單一跨膜域的膜蛋白就本發(fā)明人的知識(shí)所及，對(duì)于15-kDa多肽的細(xì)胞定位并無(wú)公眾可得的信息。我們使用了計(jì)算機(jī)手段來(lái)預(yù)測(cè)該蛋白的推測(cè)的細(xì)胞定位。首先，我們利用了根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)( 一種植物病原體)中的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，該證據(jù)證明virB7是漢賽巴爾通體中15-kDa的功能同系物(Krall等人，2002 ；Ward等人，2002)。按照Krall氏模型，virB7是錨定在外膜上的周質(zhì)蛋白。值得注意地，virB7在漢賽巴爾通體中與TIVSS內(nèi)的virB5和virB9相互作用(Krall等人，2002 ； Ward 等人，2002)。接下來(lái)，我們使用了 TMHMM 服務(wù)器 2. 0 (A. Krogh 等人，2001, http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. 0)，并分析了 15-kDa蛋白中存在的可能的跨膜螺旋的數(shù)量和定位 (數(shù)據(jù)未示出)。并且，我們使用T Phobius在線工具(http //phobius. sbc. su. se)，并分析了 15-kDa蛋白的跨膜區(qū)的存在和信號(hào)肽的存在。Phobius工具被報(bào)道具有超過(guò)TMHMM程序的額外優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠滹@著降低偽跨膜和信號(hào)肽類別的水平(Sormhammer等人，2004)。按照W1Obius模型，我們發(fā)現(xiàn)15-kDa蛋白含有跨越氨基酸殘基37-55的單一跨膜結(jié)構(gòu)域。我們還從Wiobius模型中觀察到15-kDa蛋白缺少信號(hào)肽。我們的發(fā)現(xiàn)總結(jié)在圖如中，該圖顯示了利用Phobius程序得到的15-kDa蛋白中跨膜螺旋的概率圖。我們還評(píng)價(jià)了 15-kDa蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。為實(shí)現(xiàn)此目的，我們使用了 SOSUI (膜蛋白的分類和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)系統(tǒng))在線工具(http://bp. nuap. nagoya-u. ac. jp/sosui)。按照SOSUI模型，我們發(fā)現(xiàn)15-kDa含有跨越氨基酸殘基37-55的單一跨膜螺旋。我們的發(fā)現(xiàn)總結(jié)在圖4b中，其顯示了所預(yù)測(cè)的細(xì)胞膜中virB7(15-kDa)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。最后，Phobius和SOSUI模型都顯示了跨越殘基37_55區(qū)域的單一跨膜螺旋的存在?？傊@些計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)為15-kDa是膜結(jié)合蛋白提供了有力證據(jù)。實(shí)施例2VirB7(15kD)基因的擴(kuò)增和亞克隆我們接下來(lái)對(duì)來(lái)自漢賽巴爾通體的15-kDa蛋白是否是免疫檢測(cè)的良好抗原進(jìn)行了測(cè)定。我們通過(guò)表達(dá)重組的15-kDa蛋白并對(duì)其作為漢賽巴爾通體的良好診斷標(biāo)志物的有用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而解決了該問(wèn)題。在本研究中，我們PCR擴(kuò)增了編碼15-kDa蛋白的完整ORF的15-kDa基因，并將所克隆的基因連接到表達(dá)載體中。virB7基因的PCR擴(kuò)增漢賽巴爾通體Houston-Ι菌株的基因組DNA核苷酸序列已存儲(chǔ)于GenBan中(登錄號(hào) NC_005956)。virB7 (15-kDa)基因的核苷酸序列已存儲(chǔ)于 GenBan 中(GeneID :2865504)。 基因組DNA和virB7 (15-kDa)基因核苷酸序列的公開(kāi)內(nèi)容在此以其整體并入。漢賽巴爾通體Houston-Ι菌株的基因組DNA購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection) (ATCC 49882)。我們?cè)O(shè)計(jì)了擴(kuò)增 15-kDa基因的 PCR 引物。正向和反向PCR引物包括5' LIC延伸，以促使定向克隆和框內(nèi)克隆到pET30Ek/ LIC載體(Novagen, Madison WI)中。正向和反向引物的序列分別是5，-GACGACGACA AGATGTGCATTTTGTAAG-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-GAGGAGAAGC CCGGTTTAATTTTCACG-3，(SEQ ID NO 4)。利用這些引物，我們通過(guò)梯度PCR方法擴(kuò)增了漢賽巴爾通體VirB7(15-kDa)。我們進(jìn)行了 PCR反應(yīng)(條件細(xì)節(jié)，參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)。PCR完成之后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)反應(yīng)
14的等分試樣進(jìn)行分析以確定預(yù)期大小( 411bp)的擴(kuò)增子的存在。對(duì)PCR反應(yīng)的剩余部分進(jìn)行處理以去除用于亞克隆的制劑中的其中過(guò)量的引物和DNA聚合酶。對(duì)于所檢測(cè)的不同退火溫度中的每一個(gè)我們都觀察到了所預(yù)期大小的擴(kuò)增子(參見(jiàn)圖5)，表明在所檢測(cè)的溫度范圍內(nèi)的成功的PCR擴(kuò)增。virB7的T4聚合酶處理和與pET30載體的連接我們選擇了來(lái)自56°C反應(yīng)的擴(kuò)增子用于進(jìn)一步分析。在本研究中，我們將擴(kuò)增子亞克隆到PET30表達(dá)載體(Novagen)中。為實(shí)現(xiàn)該目的，需要在擴(kuò)增子和所選載體(即， pET30Ek/LIC)之間構(gòu)建相容末端。我們通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增子進(jìn)行T4聚合酶處理而在插入DNA 上生成了與砍/LIC克隆載體相容的突出端(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)。我們將處理的擴(kuò)增子連接到表達(dá)載體中從而形成pET30/15-kDa。圖6描繪了含有15_kDa插入基因的pET30載體。實(shí)施例3VirB7基因的表達(dá)N0VaBlue大腸桿菌的轉(zhuǎn)化在該系列的實(shí)驗(yàn)中，我們將pET30/15_kDa插入物轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞(NovaBlue大腸桿菌)中。我們選擇NovaBlue大腸桿菌因?yàn)樵摷?xì)胞對(duì)于產(chǎn)生含重組插入物的穩(wěn)定細(xì)胞系是最優(yōu)的。(參見(jiàn)，Novagen EK/LIC手冊(cè))。使用用于轉(zhuǎn)化的熱激方案(細(xì)節(jié)參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板在含抗生素(卡那霉素)的LB瓊脂板上。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在37°C 下孵育過(guò)夜。實(shí)施例4NovaBlue轉(zhuǎn)化體的菌落PCR為證實(shí)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中插入DNA(pET30/15_kDa)的存在，我們選擇了幾個(gè)菌落(即， 10個(gè)菌落)并進(jìn)行了菌落PCR以證實(shí)這些菌落中pET30/15-kDa的存在。利用與來(lái)自巴爾通體基因組DNA的15-kDa基因的擴(kuò)增中相同的一套砍/LIC引物(實(shí)施例1中所描述的) 進(jìn)行菌落PCR。如圖7所示，菌落PCR分析后觀察到了所預(yù)期大小( 411bp)的擴(kuò)增子。 然后在LB-卡那霉素肉湯中進(jìn)一步培養(yǎng)含有pET30/15-kDa插入物的NovaBlue大腸桿菌菌落(用于分離質(zhì)粒)。實(shí)施例5用于序列分析的重組質(zhì)粒的分離我們選擇了菌落1和菌落2(圖7中的凝膠所示)進(jìn)行進(jìn)一步分析。我們挑取了菌落1和菌落2并分別將每個(gè)菌落在5mL含卡那霉素的LB肉湯中接種并培養(yǎng)。過(guò)夜生長(zhǎng)之后，我們利用Wizard Plus SV miniprep DNA純化系統(tǒng)從這些培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒。利用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和品質(zhì)(0D26Q/28Qnm)。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA具有足以進(jìn)行序列分析的濃度和品質(zhì)。實(shí)施例6來(lái)自轉(zhuǎn)化的NovaBlue大腸桿菌的pET30/15_kDa插入物的測(cè)序在本研究中，我們對(duì)pET30/15_kDa插入物進(jìn)行測(cè)序以(i)證實(shí)其同一性和(ii)確定開(kāi)放閱讀框與His標(biāo)簽序列是否是符合讀框的。為進(jìn)行測(cè)序，我們使用了兩套引物。第一套引物與實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增所用的相同。第二套引物含有正向 T7 啟動(dòng)子(5 ‘ -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ‘ ) (SEQID NO 5)和反向 T7 終止子 (5' -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3‘ ) (SEQ IDNO :6)載體特異性引物。利用兩套引物和分離的pET30/15-kDa質(zhì)粒，我們跨越插入物/載體連接處從正向和反向兩個(gè)方向測(cè)序。利用 AppliedBiosystems 3130Genetic Analyzer (HITACHI, Foster City, CA)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。利用從菌落1和菌落2獲得的序列，我們使用BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool (基本局部序列比對(duì)搜索工具)，http//blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast.c￡i)分析并發(fā)現(xiàn)插入DNA(來(lái)自菌落2)與以GeneID :2865504存儲(chǔ)的15-kDa基因序列完全匹配。利用用于序列操作的Lasergene 6軟件(DNAMar)，我們確定His標(biāo)簽與開(kāi)放閱讀框(ORF)(登錄號(hào)#YP_034056)是符合讀框的。我們的序列分析證實(shí)了菌落1和菌落2均含有15-kDa插入物。選擇了菌落2的重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。實(shí)施例7VirB7基因的表達(dá)BL21 (DE3)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化我們將pET30/15_kDa質(zhì)粒(從菌落2獲得)轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)大腸桿菌 (Novagen)中。我們選擇BL21 (DE3)大腸桿菌是因?yàn)樵摷?xì)胞是蛋白表達(dá)最優(yōu)的。使用熱激轉(zhuǎn)化方案(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)將pET30/15-kDa質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21(DE!3)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到LB瓊脂板(含卡那霉素)上，并在37°C孵育過(guò)夜。實(shí)施例8BL21 (DE3)轉(zhuǎn)化體的菌落PCR我們證實(shí)了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中插入DNA(pET30/15_kDa)的存在。我們選擇了 10個(gè)菌落并利用與從巴爾通體基因組DNA中擴(kuò)增15-kDa基因(實(shí)施例1中所描述的)相同的一套砍/LIC引物進(jìn)行了菌落PCR。如圖8中所示，在十個(gè)菌落中的每一個(gè)中都觀察到了所預(yù)期大小( 411bp)的擴(kuò)增子。我們制備了這些菌落的甘油貯存液。對(duì)于IPTG誘導(dǎo)和表達(dá)研究，我們使用了來(lái)自所述甘油貯存液的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。實(shí)施例9大腸桿菌中virB7 (15-kDa)的蛋白表達(dá)我們利用IPTG誘導(dǎo)方法在BL21 (DE3)大腸桿菌中表達(dá)了重組的15_kDa蛋白。在實(shí)驗(yàn)方案章節(jié)中所詳述的條件下，用IPTG誘導(dǎo)了 BL21(DE3)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。簡(jiǎn)言之，在 37°C下使轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(0D_ = 0.幻，然后通過(guò)加入IPTG(ImM)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。在陰性對(duì)照中無(wú)IPTG加入。在371下繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時(shí)。圖9描繪了重組15-kDa的 IPTG誘導(dǎo)和分析的工作流程圖。在3. 5小時(shí)孵育后收獲細(xì)胞并對(duì)其處理以獲得可溶的和不溶的級(jí)分，然后通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。當(dāng)培養(yǎng)物在含IPTG(ImM)的LB 中生長(zhǎng)時(shí)我們?cè)谌我患?jí)分中都觀察到了很少的蛋白表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例10利用葡萄糖增強(qiáng)大腸桿菌中virB7 (15-kDa)的蛋白表達(dá)我們一致觀察到了利用IPTG(ImM)的蛋白誘導(dǎo)；并且誘導(dǎo)的15_kDa蛋白通常在 100yg/ml的濃度下獲得。我們作出了提高誘導(dǎo)的蛋白水平的若干嘗試。我們猜測(cè)15-kDa 可能是對(duì)大腸桿菌細(xì)胞具有毒性的，并因此導(dǎo)致了次優(yōu)的蛋白表達(dá)。我們接下來(lái)檢測(cè)了葡萄糖是否能夠改變蛋白表達(dá)，由于葡萄糖可能具有降低重組質(zhì)粒表達(dá)的基線水平的能力。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在IPTG之前在大腸桿菌培養(yǎng)物中加入葡萄糖增強(qiáng)了 15-kDa的蛋白表達(dá)。我們檢測(cè)了一系列的葡萄糖的濃度(5mg/mL-10mg/mL) 和不同的IPTG孵育時(shí)間O小時(shí)-3. 5小時(shí))。用5mg/mL葡萄糖僅觀察到了 15-kDa表達(dá)的少量增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未示出)。用8mg/mL和10mg/mL葡萄糖顯著增強(qiáng)了 15-kDa蛋白表達(dá)。 使用8mg/mL葡萄糖時(shí)，我們?cè)?-3. 5小時(shí)之間的整個(gè)IPTG孵育時(shí)間段內(nèi)觀察到了增強(qiáng)的 15-kDa蛋白表達(dá)。(參見(jiàn)，圖10和圖11)。實(shí)施例11表達(dá)的15-kDa蛋白的可溶的和不溶的級(jí)分在無(wú)葡萄糖時(shí)，我們觀察到表達(dá)的15-kDa蛋白質(zhì)只定位于可溶級(jí)分中，且可從不溶級(jí)分(即，內(nèi)含體)中純化出可以忽略不計(jì)的水平(數(shù)據(jù)未示出)。明顯相反地，葡萄糖增強(qiáng)了 15-kDa蛋白的表達(dá)，并且我們觀察到了表達(dá)的蛋白的大部分定位于內(nèi)含體中。為純化15-kDa蛋白，首先利用BugBuster Master Mix(Novagen) 裂解大腸桿菌細(xì)胞。圖12描繪了分離可溶級(jí)分和不溶級(jí)分以及獲得內(nèi)含體的程序的工作流程。獲得了可溶級(jí)分和不溶級(jí)分。實(shí)施例12表達(dá)的15-kDa蛋白的SDS-PAGE分析圖10和圖11中所示的SDS-PAGE考馬斯藍(lán)凝膠表明重組的15_kDa蛋白的大部分存在于不溶級(jí)分中(箭頭)。在本研究中，在IPTG誘導(dǎo)前在補(bǔ)充有葡萄糖的LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。(^Ii,圖10和圖11)。實(shí)施例13重組表達(dá)的15-kDa蛋白的純化我們使用Ni-NTA樹(shù)脂柱從可溶級(jí)分和不溶級(jí)分中純化表達(dá)的15-kDa蛋白。通過(guò)在Ni-NTA樹(shù)脂(鎳樹(shù)脂)柱(Novagen，Madison，WI)上加入可溶級(jí)分進(jìn)行純化。我們按照以下步驟在尿素變性條件下純化不溶級(jí)分。首先，在細(xì)1裂解緩沖液中重懸不溶級(jí)分。然后，將Iml的Ni-NTA樹(shù)脂加入到管中。室溫下在旋轉(zhuǎn)混合器上將含有樹(shù)脂/蛋白混合物的管搖晃1小時(shí)。在1小時(shí)末時(shí)，將樹(shù)脂/蛋白混合物完全倒入柱中，并收集級(jí)分。圖14顯示了在尿素變性條件下進(jìn)行15-kDa的Ni-NTA純化(在裂解變性緩沖液中)后所得蛋白級(jí)分的考馬斯藍(lán)染色的SDS凝膠。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，重組蛋白的大部分連續(xù)洗脫在級(jí)分6和級(jí)分7中。圖15顯示了從8個(gè)獨(dú)立的純化實(shí)驗(yàn)(P1-P8)中得到的混合的級(jí)分6和級(jí)分7中所收集的重組蛋白的考馬斯藍(lán)染色的凝膠。實(shí)施例14利用單克隆抗His標(biāo)簽抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析評(píng)估rVirB7(rl5_kDa) 抗原圖13顯示了利用抗6XHis標(biāo)簽的單克隆抗體對(duì)純化的重組15_kDa蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)(在硝酸纖維素膜上的半干印跡)的結(jié)果?？贵w與 21-kDa(15-kDa+6XHiS標(biāo)簽和相關(guān)序列的6-kDa)的蛋白條帶交叉反應(yīng)。我們還注意到抗體與另外蛋白(S卩， 12-kDa)交叉反應(yīng)(參見(jiàn)，圖13)。不受任何理論束縛，我們推測(cè)交叉反應(yīng)蛋白是缺少蛋白的c末端部分的15-kDa的截短形式。當(dāng)表達(dá)含有諸如 Arg (AGG、AGA、CGG、CGA)、Gly (GGA)、lie (AUA)、Leu (CUA)、Pro (CCC)的在大腸桿菌基因組中不充分表達(dá)的罕用密碼子的重組蛋白時(shí)，可出現(xiàn)截短形式。當(dāng)異源靶基因的 mRNA在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)時(shí)，密碼子使用的差異能夠妨礙翻譯，這是因?yàn)樾枰谠撊后w中是稀有的或是缺少的一種或多種tRNA。因此，tRNA群體精確反映了 mRNA群體的密碼子偏倚。(參見(jiàn)，例如，PET系統(tǒng)手冊(cè))(Novagen用戶手冊(cè)TB055)。不足的tRNA庫(kù)可能導(dǎo)致翻譯的延遲、過(guò)早的翻譯終止、翻譯移碼以及氨基酸錯(cuò)誤摻入。為進(jìn)一步檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)，我們使用了 Graphical Codon Usage Analyzer2. O在線工具(http://Rcua. schoedl. de/sequential v2. html)以展示出在大腸桿菌中表達(dá)的漢賽巴爾通體15-kDa蛋白的密碼子使用頻率和相對(duì)適應(yīng)性值。數(shù)據(jù)表明在15-kDa的84位的密碼子CTA(亮氨酸)小于在大腸桿菌中使用次數(shù)的20%。因此，重組蛋白在氨基酸殘基第 84位的過(guò)早終止將具有8-kDa的推測(cè)的分子量。當(dāng)考慮到氨基端 6-kDa 6XHis_標(biāo)簽區(qū)時(shí)，重組蛋白的推測(cè)的分子量為 14-kDa。這些推測(cè)與我們所觀察到的與抗6X-His標(biāo)簽的 MAB交叉反應(yīng)的較小分子量條帶整體上極好地吻合(圖13)。這些觀察有力支持了如下觀點(diǎn)在蛋白質(zhì)印跡中所見(jiàn)的較低分子量交叉反應(yīng)條帶是由大腸桿菌中罕用的CTA密碼子的
17存在引起的15-kDa的截短形式。實(shí)施例15在IPTG之前利用葡萄糖的誘導(dǎo)研究在我們的實(shí)驗(yàn)工作過(guò)程期間，當(dāng)宿主細(xì)胞在誘導(dǎo)表達(dá)的IPTG加入之前在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，我們一致觀察到了重組15-kDa非常少量的表達(dá)。純化的蛋白在巴爾通體陽(yáng)性和陰性患者血清間表現(xiàn)出明顯區(qū)別，但需要頻繁生產(chǎn)新批次的重組蛋白。這些觀察使我們猜測(cè)該蛋白可能對(duì)大腸桿菌具有毒性。我們開(kāi)始鑒定用于提高BL21 (DE3)中表達(dá)的pET30/15_kDa質(zhì)粒的穩(wěn)定性的方法。 我們通過(guò)在補(bǔ)充有葡萄糖的LB中生長(zhǎng)細(xì)胞，維持了大腸桿菌中低水平的潛在毒性蛋白的表達(dá)。如圖10和圖11中所示，當(dāng)在15-kDa的IPTG誘導(dǎo)之前在LB培養(yǎng)基中加入0.8% (w/ w)的葡萄糖時(shí)，我們觀察到了重組蛋白的整體的良好誘導(dǎo)。當(dāng)使用(w/w)的葡萄糖時(shí)我們也觀察到了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。注意到單獨(dú)的葡萄糖(0.5% w/w)并不會(huì)顯著提高蛋白表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例16人血清中存在的結(jié)合抗體中的重組15-kDa (r 15-kDa)的評(píng)估為評(píng)估將重組15-kDa抗原用于漢賽巴爾通體抗體檢測(cè)的可行性，如下進(jìn)行 ELISA:用rl5-kDa抗原覆蓋96孔板，然后按照實(shí)驗(yàn)方案(參見(jiàn)以下)中的描述用人血清檢測(cè)。漢賽巴爾通體陽(yáng)性和陰性的人血清獲自重點(diǎn)診斷和專業(yè)實(shí)驗(yàn)室(Focus Diagnostics and Specialty Laboratories)。陽(yáng)性樣品中的6個(gè)和陰性樣品中的2個(gè)由Burt Anderson 博士 (Department ofMolecular Medicine, College of Medicine, University of South Florida(南佛羅里達(dá)大學(xué)，醫(yī)學(xué)院，分子醫(yī)學(xué)系))惠贈(zèng)。所有樣品在用于ELISA檢驗(yàn)前通過(guò)IFA確認(rèn)為陽(yáng)性或陰性。IgG ELISA 分析純化的重組15-kDa蛋白在包被緩沖液(0. 015M Na2C03、0. 0；35麗aHC03，pH 9. 6)中稀釋并固定在96孔板上。圖16和圖17顯示了在96孔板上利用重組15-kDa蛋白作為覆蓋抗原得到的IgG ELISA數(shù)據(jù)。圖16總結(jié)了來(lái)自4個(gè)IFA血清-陽(yáng)性血清和1個(gè)IFA血清-陰性血清的數(shù)據(jù)。15-kDa蛋白與IFA高血清陽(yáng)性血清和IFA中血清陽(yáng)性血清結(jié)合，但不與IFA低血清陽(yáng)性血清和IFA血清陰性血清反應(yīng)。圖17總結(jié)了來(lái)自10個(gè)IFA血清陽(yáng)性和1個(gè)IFA血清陰性患者的血清的數(shù)據(jù)。15-kDa蛋白與IFA高血清陽(yáng)性血清和IFA中血清陽(yáng)性血清結(jié)合，但不與IFA低血清陽(yáng)性血清和IFA血清陰性血清反應(yīng)。IgM ELISA 分析純化的重組15-kDa蛋白在包被緩沖液(0. 015M Na2CO3^O. 0；35麗aHC03，pH 9. 6)中稀釋并附著在96孔板上。圖18顯示了在96孔板上利用從不溶級(jí)分(即，內(nèi)含體)中純化的重組15-kDa作為覆蓋抗原得到的IgM ELISA數(shù)據(jù)。圖18總結(jié)了獲自2個(gè)IFA血清陽(yáng)性和2個(gè)IFA血清陰性患者樣品的數(shù)據(jù)。使用了 4種不同的包被濃度的重組15-kDa蛋白(參見(jiàn)圖18)。重組15-kDa蛋白的最低水平 (與不溶級(jí)分相比為 5%)出現(xiàn)在大腸桿菌裂解物的可溶級(jí)分中。來(lái)自可溶級(jí)分的純化的15-kDa重組蛋白表現(xiàn)出相似的IgM ELISA結(jié)合活性(數(shù)據(jù)未示出)。因此，當(dāng)15-kDa蛋白固定在表面上時(shí)，與IFA血清陽(yáng)性血清中存在的抗體結(jié)合，并且僅具有與IFA陰性血清可以忽略的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明15-kDa蛋白可用于檢測(cè)感染漢賽巴爾通體的患者中的IgM抗體反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)方案⑴漢賽巴爾通體中15-kDa基因的擴(kuò)增和克降從購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC 4988 的漢賽巴爾通體Houston-Ι菌株的基因組DNA中擴(kuò)增15-kDa基因內(nèi)編碼的開(kāi)放閱讀框(ORF)(參見(jiàn)圖1)，其擴(kuò)增引物按照存儲(chǔ)于GenBank中的由Anderson，S. G.等人提交的核苷酸序列(GeneID =2865504)稍作修改而設(shè)計(jì)。正向和反向PCR引物包含5' LIC延伸以促使定向克隆和框內(nèi)克隆到pET30Ek/ LIC載體(Novagen，MadisonWI)中。正向和反向引物的序列分別是5，-GACGACGACAAGATGT GCATTTTGTAAG-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-GAGGAGAAGCCCGGTTTAATTTTCACG-3，(SEQ ID NO: 4)。利用這些引物，使用以下條件通過(guò)梯度PCR擴(kuò)增漢賽巴爾通體15-kDa基因94°C 2分鐘，然后94°C 30秒、48°C至58°C的退火溫度范圍、68°C的延伸時(shí)間的30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)包括完成運(yùn)行后的10分鐘的最終退火時(shí)間。PCR完成后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)的等分試樣。對(duì)于PCR反應(yīng)所用的6種不同的退火溫度的每一種觀察到了所預(yù)期大小Gllbp)的條帶(圖5)。利用Wizard PCR Clean-up試劑盒(ftOmega)按照生產(chǎn)商推薦的方案對(duì)每個(gè) PCR反應(yīng)的剩余物進(jìn)行處理以除去過(guò)量的引物和DNA聚合酶。(ii) 15-kDa擴(kuò)增子的T4DNA聚合酶處理通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增子進(jìn)行T4DNA聚合酶處理在插入DNA上生成與pET_30Ek/LIC克隆載體相容的突出端。簡(jiǎn)言之，建立由純化的PCR產(chǎn)物、T4DNA聚合酶緩沖液、dATP、DTT和 T4DNA聚合酶(LIC品質(zhì)的)組成的終反應(yīng)體積為20 μ 1的反應(yīng)。通過(guò)加入酶起始反應(yīng)，然后在室溫下孵育30分鐘。在75°C下孵育20分鐘而使酶失活。( 與PET30載體連接為了將重組蛋白表達(dá)為帶His標(biāo)簽的融合蛋白，選擇了 pET30載體，由于pET30載體存在位于靶蛋白插入位點(diǎn)框內(nèi)的His標(biāo)簽編碼序列和T7啟動(dòng)子(圖6)。對(duì)于載體和砍/ LIC插入物的退火，建立由pET-30Ek/LIC載體(圖6)、T4DNA聚合酶處理的Ek/LIC插入 DNA(0. 02pmol)組成的反應(yīng)。將反應(yīng)在室溫下孵育5分鐘，然后加入25mM EDTA。在室溫下將反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行額外的5分鐘。(iv) NovaBlue大腸桿菌的轉(zhuǎn)化如下進(jìn)行NovaBlue感受態(tài)大腸桿菌(Novagen)轉(zhuǎn)化從_80°C取出合適數(shù)量的 20 μ 1等分試樣的感受態(tài)細(xì)胞，使管在冰上融化幾分鐘，然后邊輕輕攪拌邊向細(xì)胞中加入 1 μ 1的退火反應(yīng)物。將混合物在冰上孵育5分鐘，然后在42°C水浴中準(zhǔn)確加熱管30秒。 立即將管置于冰上2分鐘。2分鐘孵育后，加入室溫的S0C，在37°C下孵育反應(yīng)物，同時(shí)以 250rpm振動(dòng)。將細(xì)胞鋪板在LB瓊脂板(含卡那霉素)上，將板倒置，并在37°C下孵育過(guò)夜。(v)BL2KDE3)和 pLysS(DE3)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化如下進(jìn)行BL21(DE3)和pLysS(DE3)感受態(tài)大腸桿菌(Novagen)中的轉(zhuǎn)化， 從-80°C取出合適數(shù)量的20 μ 1等分試樣的感受態(tài)細(xì)胞，使管在冰上融化幾分鐘，然后邊輕輕攪拌邊向細(xì)胞中加入ι μ 1的退火反應(yīng)物。將混合物在冰上孵育5分鐘，然后在42°C水浴中準(zhǔn)確加熱管30秒。立即將管置于冰上2分鐘。2分鐘孵育之后，加入室溫的S0C，在37°C 下孵育反應(yīng)物，同時(shí)以250rpm振動(dòng)。將細(xì)胞鋪板在LB瓊脂板(含卡那霉素)上，將板倒置， 并在37°C下孵育過(guò)夜。(Vi)質(zhì)粒小量制備
利用Wizard Plus SV Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)按照生產(chǎn)商推薦的方案從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA。(Vii)插入物的測(cè)序利用AppliedBioSystems 3130Genetic Analyzer DNA測(cè)序儀器對(duì)質(zhì)粒小量制備 DNA進(jìn)行測(cè)序分析。(viii) 15-kDa在大腸桿菌中的表汰為表達(dá)重組蛋白，按以下方法用IPTG誘導(dǎo)pET30-15-kDa質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的 BL21(DE3)大腸桿菌用pET30-15-kDa質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21的菌落接種3ml的補(bǔ)充有葡萄糖(0.5^^0.8^^1% )的LB肉湯培養(yǎng)基(含終濃度為30μβ/πι1的卡那霉素)。在37°C 下以250rpm振蕩使細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(0D· = 0. 5)。當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)對(duì)數(shù)中期時(shí)，將全部3ml加入到IOOmlLB(含卡那霉素和葡萄糖)中，并使其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中晚期(0D_ = 0.5-1.0)。當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)對(duì)數(shù)中晚階段時(shí)，將其分成兩個(gè)獨(dú)立的50ml批次。在一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入500 μ 1的IPTG (終濃度為ImM)。另一個(gè)培養(yǎng)瓶不加入IPTG，作為對(duì)照。使IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物和非誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的生長(zhǎng)在37°C下繼續(xù)2-3. 5小時(shí)，同時(shí)以250rpm振蕩。通過(guò)在4°C下以3，OOOrpm離心15分鐘收集細(xì)胞沉淀，然后如以下所描述用BugBuster Master Mix(Novagen)進(jìn)行處理。(ix)可溶的胞質(zhì)級(jí)分和不溶的蛋白級(jí)分的純化利用BugBuster Master Mix(Novagen)按照生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案分離重組的抗原。 通過(guò)以3，OOOrpm離心15分鐘從液體培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。在5ml的BugBuster Master Mix(Novagen)中通過(guò)輕輕旋渦將細(xì)胞沉淀重懸。將所得的細(xì)胞懸浮液在室溫下在旋轉(zhuǎn)混合器上孵育20分鐘。將混合物在4°C下在16，OOOXg下離心20分鐘以除去不溶的細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中用于SDS PAGE分析。然后對(duì)沉淀進(jìn)行處理以分離不溶的胞質(zhì)級(jí)分，其由細(xì)胞碎片和聚集的蛋白(內(nèi)含體)組成。內(nèi)含體純化是通過(guò)在同樣體積(5ml)的用于重懸初次細(xì)胞沉淀的IX BugBuster Master Mix中重懸沉淀而進(jìn)行的。將混合物進(jìn)行旋渦以獲得均勻的懸浮液，然后加入20ml 1 10稀釋的BugBuster Master Mix。將懸浮液旋渦，然后在4°C下在5，OOOXg下離心15分鐘以收集內(nèi)含體。在15ml的1 10稀釋的 BugBuster Master Mix中重懸沉淀，旋渦，并在5，000X g下離心15分鐘。以16，OOOXg進(jìn)行15分鐘的離心重復(fù)這個(gè)步驟。棄去上清液，將沉淀在500 μ 1的IX PBS中重懸。在SDS PAGE凝膠上對(duì)純化的內(nèi)含體級(jí)分的等分試樣進(jìn)行分析。(x)15_kDa 蛋白的純化SDS PAGE分析證實(shí)了內(nèi)含體級(jí)分中所預(yù)期蛋白條帶( 21_kDa)的存在(圖10 和圖11)。因此，在變性條件下從該級(jí)分中純化該蛋白。將內(nèi)含體沉淀在^il的變性裂解 /結(jié)合緩沖液中重懸。將Iml的Ni-NTAHis ·結(jié)合漿液(Novagen)加入到該混合物中。在旋轉(zhuǎn)搖床上輕輕混合懸浮液1小時(shí)。將裂解物-樹(shù)脂混合物小心載入置于15ml圓錐管上方的柱子上，并收集流經(jīng)的物質(zhì)并保存用于后續(xù)分析(在圖14中標(biāo)記為FT)。用細(xì)1的洗滌緩沖液對(duì)柱子進(jìn)行洗滌，該洗滌緩沖液被收集在另一個(gè)圓錐管中，保存該級(jí)分以用于后續(xù)分析(在圖14中標(biāo)記為Wl)。用的洗滌緩沖液對(duì)柱子再次洗滌，保存該級(jí)分以用于后續(xù)分析(在圖14中標(biāo)記為W2)。用5X0. 5ml的洗脫緩沖液(pH 5. 9)洗脫重組蛋白，留出每次的級(jí)分以用于后續(xù)分析(在圖14中標(biāo)記為E1-E5)。用5X0. 5ml的洗脫緩沖液(pH4. 5)進(jìn)行額外的洗脫，并留出每次的級(jí)分以用于后續(xù)分析(在圖14中標(biāo)記為E6-E10)。(xi)緩沖液組成(所有緩沖液均在臨使用前新鮮制備)含尿素的裂解緩沖液IOOmM磷酸鹽緩沖液IOmM Tris-Cl8M 尿素；將緩沖液pH調(diào)節(jié)至8.0含尿素的洗滌緩沖液IOOmM磷酸鹽緩沖液IOmM Tris-Cl8M 尿素；將緩沖液pH調(diào)節(jié)至6. 3含尿素的洗脫緩沖液(dH5. 9)IOOmM磷酸鹽緩沖液IOmM Tris-Cl8M 尿素；將緩沖液pH調(diào)節(jié)至5. 9含尿素的洗脫緩沖液(dH4. 5)IOOmM磷酸鹽緩沖液IOmM Tris-Cl8M 尿素；將緩沖液pH調(diào)節(jié)至4. 5(xii)IgG ELISA 分析在包被緩沖液(0. 015M Na2C03>0. 035M NaHCO3, pH 9. 6)中稀釋純化的多肽并將其附著在96孔板上。(xiii)IgM ELISA 分析在包被緩沖液(0. 015M Na2C03>0. 035M NaHCO3, pH 9. 6)中稀釋純化的多肽并將其附著在96孔板上。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員還將明顯的是，前面說(shuō)明書(shū)中所教導(dǎo)的實(shí)施方案和特征的多種組合形式是可能的，并能更優(yōu)選的實(shí)施本發(fā)明。因此，這些變化形式和修改形式屬于所附權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
2權(quán)利要求
1.一種重組多肽，該重組多肽具有SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列。
2.一種組合物，該組合物含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多肽和支持物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述支持物選自由聚乙烯、聚丙烯和玻璃組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述支持物是微量滴定孔。
5.一種分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸具有SEQID NO 1所列的核苷酸序列。
7.一種載體，該載體含有根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸。
8.一種載體，該載體含有根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其中所述載體還包含與所述分離的多核苷酸可操作地連接的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體，其中所述載體還包含與所述分離的多核苷酸可操作地連接的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中所述載體選自由pET、pENTR和 pCR 8/GW/TOPO 組成的組且所述啟動(dòng)子選自由Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中所述載體是pET且所述啟動(dòng)子是Iac啟動(dòng)子。
13.一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌是NoVaBlUeK12菌株、 BL21 (DE3)或 BL21 pLyss(DE3)。
16.一種制備具有SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列的重組多肽的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將分離的多核苷酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，所述分離的多核苷酸具有SEQID NO. 1所列的核苷酸序列；(b)在適宜條件下使所述宿主細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)以允許所述重組多肽的產(chǎn)生；和(c)分離所述重組多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述生長(zhǎng)步驟還包括在加入IPTG之前將葡萄糖加入到所述培養(yǎng)物中的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中加入所述葡萄糖以達(dá)到大約8mg/mL至大約 10mg/mL的終濃度。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中加入所述葡萄糖以達(dá)到大約8mg/mL的終濃度。
20.—種檢測(cè)哺乳動(dòng)物的生物樣品中抗?jié)h賽巴爾通體(Bartonellahenselae)抗體的存在的方法，所述方法包括以下的步驟(a)將SEQID NO 2所列的重組多肽固定在表面上；(b)在允許抗體-抗原復(fù)合物形成的條件下，使所述重組多肽與患者的生物樣品接觸， 所述生物樣品含有IgG或IgM ；和(C)檢測(cè)所述抗體-抗原復(fù)合物的形成，所述檢測(cè)的抗體-抗原復(fù)合物表明所述生物樣品中所述抗?jié)h賽巴爾通體抗體的存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抗體是IgG或IgM。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟還包括在步驟(b)之后加入含有信號(hào)生成化合物的指示劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述指示劑是辣根過(guò)氧化物酶。
25.—種診斷哺乳動(dòng)物中漢賽巴爾通體感染的方法，所述方法包括(a)從懷疑患有漢賽巴爾通體感染的哺乳動(dòng)物獲得生物樣品；(b)將SEQID NO 2所列的分離的多肽固定在表面上；(c)在允許抗體-抗原復(fù)合物形成的條件下，使所述純化的多肽與所述生物樣品接觸；(d)檢測(cè)所述抗體-抗原復(fù)合物，其中所述檢測(cè)的抗體-抗原復(fù)合物表明所述生物樣品中所述抗?jié)h賽巴爾通體抗體的存在。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是貓或人。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗體選自由IgG和IgM組成的同種型。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述接觸步驟在室溫下進(jìn)行大約1小時(shí)。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟還包括在步驟(b)之后加入含有信號(hào)生成化合物的指示劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述指示劑是辣根過(guò)氧化物酶。
31.一種制品，該制品含有包裝材料；和SEQ ID NO :2所列的重組多肽。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制品，其中所述包裝材料包括檢測(cè)抗?jié)h賽巴爾通體抗體存在的說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
公開(kāi)了漢賽巴爾通體的新型抗原的克隆和表達(dá)。該重組多肽被發(fā)現(xiàn)具有高免疫原性且作為診斷檢驗(yàn)抗原是有用的。本發(fā)明的多肽提供了利用患者血清進(jìn)行漢賽巴爾通體感染的靈敏、快速和準(zhǔn)確的診斷的診斷測(cè)定的基礎(chǔ)。還公開(kāi)了IgG和IgM的ELISA，并使早期感染和晚期感染的診斷成為可能。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102203120SQ200980142024
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
發(fā)明者伊萊·莫迪凱, 約翰·霍伊, 馬丁·阿德?tīng)柹? 黃麗莎 申請(qǐng)人:醫(yī)療診斷實(shí)驗(yàn)室有限責(zé)任公司