專利名稱：基因重組人胸腺素β4的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及ー種用畢赤酵母表達(dá)的基因重組人胸腺素β 4的制備方法。
背景技術(shù)：
胸腺素(Thymosins)是由胸腺產(chǎn)生的一種淋巴生長因子，由Goldstein和White于1966年首次從胎牛胸腺蛋白提取液中發(fā)現(xiàn)，是ー組小分子多肽，含有40多種組分。根據(jù)這些多肽在等電聚焦電泳分析圖譜上的位置，可以劃分為α、β、Y三型PI (α)<5,5〈ΡΙ ( β )〈7，PI ( y ) >7。目前已經(jīng)有20多種β胸腺肽異構(gòu)體被鑒定出來，而人體內(nèi)主要存在三種胸腺素β4、胸腺素β 10和胸腺素β 15，其中胸腺素β 4含量最高。胸腺素β4是由43個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)高度保守的水溶性多肽，N末端具有こ?；揎?，平均分子量為 4964Da，等電點(diǎn)為5. I。胸腺素β 4被認(rèn)為是主要的球形肌動蛋白結(jié)合肽，能與球形肌動蛋白単體結(jié)合從而阻斷其聚合，具有免疫調(diào)節(jié)的功能，是ー種在多種組織均有表達(dá)的蛋白多肽，在液體，血液中均存在。大量的研究表明胸腺素β4能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管生成，井能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和心肌梗塞時(shí)心肌細(xì)胞的存活和血管生成。胸腺素β 4在治療皮膚、角膜創(chuàng)傷，治療心肌梗塞，抗腫瘤治療，抗炎等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，目前胸腺素β 4在治療創(chuàng)傷、心肌梗塞等方面已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。目前臨床和研究中使用的胸腺素β4的來源主要有兩種，一是從小牛胸腺提取，ニ是化學(xué)合成。從小牛胸腺中提取胸腺素β 4不僅成本高，且受材料來源和提取技術(shù)的限制，其純度不高，含量較低；而雜質(zhì)多也帶來許多問題，尤其是目前牛的病毒越來越多，給動物提取也帶來麻煩。隨著基因工程的發(fā)展，利用基因工程手段來生產(chǎn)胸腺素β 4將成為一個(gè)新的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述胸腺素β 4生產(chǎn)成本高、純度底的缺點(diǎn)，提供ー種所得產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)成本低、簡單有效的基因重組人胸腺素β4的制備方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是以I型人膠原蛋白作為前導(dǎo)肽引導(dǎo)人胸腺素β 4表達(dá)的基因重組人胸腺素β 4融合蛋白，I型人！]父原蛋白的氣基酸序列為I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET基因重組人胸腺素β 4融合蛋白的氨基酸序列為I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER 181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFDDDDKSDK PDMAEIEKFD KSKLKKTETQ EKNPLPSKET IEQEKQAGES基因重組人胸腺素β 4融合蛋白的氮端為I型人膠原蛋白的600個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)肽，碳端為人胸腺素β 4的43個(gè)氨基酸，兩段氨基酸序列之間添加腸激酶切割位點(diǎn)、用于連接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表達(dá)后，在體外經(jīng)腸激酶切割獲得基因重組人胸腺素β 4?；蛑亟M人胸腺素β 4的氨基酸序列如下I SDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES上述基因重組人胸腺素β 4的制備方法包括下述步驟I、基因的獲得從離體新生兒胎盤組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)I型人膠原蛋白基因PCR擴(kuò)增引物，引入限制性酶切位點(diǎn)Xho I.EcoR I，I型人膠原蛋白基因PCR擴(kuò)增引物的序列為F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法擴(kuò)增獲得I型人膠原蛋白基因，I型人膠原蛋白基因的核苷酸序列為I CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA601 GGGGCCMCG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC841 CCTGGTGACA AGGGTGMAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAMGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT1201 CCTGGTCCTG CTGGCAMGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA1261 CGTCCTGGTG MGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC1441 CCCTCTGGTG MCCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGMCG TGGTCCCCCT1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT1561 CCTGGTGCCG MGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT1801 GAGACAGAAT TC設(shè)計(jì)并全基因合成人胸腺素β 4的核苷酸序列，氨基酸序列不變，同時(shí)添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoR I.Not I、腸激酶切割位點(diǎn)GATGACGATGACAAG，人胸腺素β 4的核苷酸序列如下I GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C2、載體pPIC9K與I型人膠原蛋白、人胸腺素β 4的連接對pPIC9K、I型人膠原蛋白進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1 ;對pPIC9K-C0Ll質(zhì)粒與人胸腺素β 4分別進(jìn)行EcoR I、Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為pPIC9K-COLl-T0 4 ;該重組DNA序列如下I CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA601 GGGGCCMCG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC841 CCTGGTGACA AGGGTGMAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT1201 CCTGGTCCTG CTGGCAMGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA1261 CGTCCTGGTG MGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC1441 CCCTCTGGTG MCCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT1561 CCTGGTGCCG MGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAMCCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG1861 TTCGATMGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCMGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC3、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化將10μ g經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的pPIC9K-C0Ll_T β 4質(zhì)粒，與80 μ L畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞混勻，GSl 15感受態(tài)細(xì)胞購于西安依科生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)至O. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，電擊4 10毫秒，加入ImL冰預(yù)冷的lmol/L的山梨醇水溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，30°C倒置培養(yǎng)2 3天，在MD培養(yǎng)基平板上長出菌落。4、多拷貝插入重組子的篩選將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應(yīng)接種到G418濃度分別為O. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子，G418購于西安依科生物技術(shù)有限公司。5、基因重組人胸腺素β 4融合蛋白畢赤酵母發(fā)酵將篩選到的轉(zhuǎn)化子接種于400ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，作為ー級種子轉(zhuǎn)接于裝有4L FBS培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，300C、pH值為5. O培養(yǎng)16 20小吋，作為ニ級種子轉(zhuǎn)接入裝有FBS培養(yǎng)基的150L大罐發(fā)酵，生長溫度30°C、誘導(dǎo)溫度29°C、pH值為4. 5、溶氧控制在20% 30%，流加入質(zhì)量濃度為75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，F(xiàn)BS培養(yǎng)基與質(zhì)量濃度為75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的體積比為I O. 25，誘導(dǎo)發(fā)酵36 42小時(shí)。6、基因重組人胸腺素β 4的純化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液，用孔徑為O. I μπι的中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液，用分子量為10000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，得融合蛋白；用腸激酶切割法對融合蛋白進(jìn)行切割，用分子量為10000D或30000D或40000D的超濾膜超濾，收集濾過液，再用分子量為1000D的超濾膜超濾除鹽，得人胸腺素β4粗蛋白；對人胸腺素β4粗蛋白用裝有DEAES印harose FF填料的層析柱進(jìn)行層析分離，得基因重組人胸腺素β40在本發(fā)明的基因重組人胸腺素β 4的純化步驟6中，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心 分離，取上清液，用孔徑為O. I μ m中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液，用分子量為10000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，得融合蛋白；用腸激酶切割法對融合蛋白進(jìn)行切害I]，用分子量為30000D的超濾膜超濾，收集濾過液，再用分子量為1000D的超濾膜超濾除鹽，得人胸腺素β4粗蛋白；對人胸腺素β 4粗蛋白用裝有DEAE Sepharose FF填料的層析柱進(jìn)行層析分離，得基因重組人胸腺素β4。本發(fā)明的腸激酶切割方法為用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，稀釋至5mg/ml，加入重組腸激酶,每單位重組腸激酶切割5mg的融合蛋白，pH為6. O 8. 0，16°C切割18小時(shí)。本發(fā)明的腸激酶切方法為用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，稀釋至5mg/ml，加入重組腸激酶，每單位重組腸激酶切割5mg的融合蛋白，pH最佳為8. 0,16°C切割18小時(shí)。本發(fā)明利用人I型人膠原蛋白在畢赤酵母的高表達(dá)特性引導(dǎo)人胸腺素β 4在畢赤酵母中穩(wěn)定高效表達(dá)。在融合蛋白的I型人膠原蛋白前導(dǎo)肽與人胸腺素β4之間引入腸激酶切位點(diǎn)，避免了人胸腺素β 4因?yàn)榉肿恿枯^小，表達(dá)、純化過程中所遇到的難題，増加了表達(dá)量，簡化了純化程序，提高了產(chǎn)品的提取純化效率，可用于制備基因重組人胸腺素β4。


圖I是實(shí)施例I中載體pPIC9K-C0Ll-TP 4的質(zhì)粒圖譜。圖2是實(shí)施例I中I型人膠原蛋白基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖3是實(shí)施例I中pPIC9K-C0Ll-T β 4質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖。圖4是實(shí)施例I中人胸腺素β 4的Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖5是實(shí)施例I中人胸腺素β 4的Western Blot鑒定圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)ー步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I以I型人膠原蛋白作為前導(dǎo)肽引導(dǎo)人胸腺素β 4表達(dá)的基因重組人胸腺素β 4融合蛋白，氮端為I型人膠原蛋白的600個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)肽，碳端為人胸腺素β 4的43個(gè)氨基酸，兩段氨基酸序列之間添加腸激酶切割位點(diǎn)、用于連接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表達(dá)后，在體外經(jīng)腸激酶切割獲得基因重組人胸腺素β 4，基因重組人胸腺素β 4的氨基酸序列如前所述。上述基因重組人胸腺素β 4的制備方法包括下述步驟I、基因的犾得從離體新生兒胎盤組織中提取總RNA,采用GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit試劑盒按說明書的使用方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA, GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesis Kit試劑盒由西安依科生物技術(shù)有限公司銷售。根據(jù)GeneBank已發(fā)表的I型人膠原蛋白基因序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)I型人膠原蛋白基因PCR擴(kuò)增引物，同時(shí)引入限制性酶切位點(diǎn)Xho I.EcoR I，I型人膠原蛋白基因(COLl)PCR擴(kuò)增引物的序列為F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG25yL反應(yīng)體系中含有13.3yL滅菌的二次蒸餾水、2.5yL IOXPCR buffer,3. 5 μ L 2mmol/L dNTP Mix,2. 5 μ L MgCl2,1 μ L 10 μ mol/L Primer F,I μ L 10 μ mol/LPrimer R，0· 2 μ LO. 5U/ μ L Taq 酶，I μ L cDNA 模板。反應(yīng)條件為95°C 5 分鐘，94°C 30 秒，560C 30秒，72°C 60秒，30個(gè)循環(huán)，72°C 10分鐘，4°C 10分鐘，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。I型人膠原蛋白的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，由圖可見，在ISOObp處出現(xiàn)特異性條帶，與I型人膠原蛋白設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果一致。重新設(shè)計(jì)并全基因合成人胸腺素β 4 (Τβ 4)的核苷酸序列，氨基酸序列不變，同時(shí)添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoR I.Not I及腸激酶切割位點(diǎn)GATGACGATGACAAG，其核苷酸序列如下I GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C2、載體pPIC9K與I型人膠原蛋白、人胸腺素β 4的連接(I)載體pPIC9K和I型人膠原蛋白的雙酶切對載體pPIC9K、I型人膠原蛋白進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，pPIC9K載體購于美國Invitrogen公司。雙酶切體系如下
二次蒸饋TK150 μ L
IOXbuffer20 μ L
pPIC9K(200ng/yL)20 μ LXho Iο P L EcoR I5 μ L
總體系200 μ L
二次蒸餾水140 μ L
權(quán)利要求
1. ー種基因重組人胸腺素β 4的制備方法，其特征在于它包括下述步驟 (I)基因的獲得 從離體新生兒胎盤組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)I型人膠原蛋白基因PCR擴(kuò)增引物，引入限制性酶切位點(diǎn)Xho I.EcoR I，I型人膠原蛋白基因PCR擴(kuò)增引物的序列為F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG 采用PCR方法擴(kuò)增獲得I型人膠原蛋白基因，I型人膠原蛋白基因的核苷酸序列為I CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT.61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC . 121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT.181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT.241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG.301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA.361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT . 421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA . 481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC.541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA . 601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT . 661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT . 721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT . 781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC.841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT . 901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT . 961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT . 1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT . 1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT . 1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT . 1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA . 1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT . 1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG . 1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC.1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT.1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT.1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT . 1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT.1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT.1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT.1801 GAGACAGAAT TC設(shè)計(jì)并全基因合成人胸腺素β 4的核苷酸序列，氨基酸序列不變，同時(shí)添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)EcoR I.Not I、腸激酶切割位點(diǎn)GATGACGATGACAAG，人胸腺素β 4的核苷酸序列如下.1 GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT.61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC.121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C (2)載體pPIC9K與I型人膠原蛋白、人胸腺素β 4的連接 對pPIC9K、I型人膠原蛋白進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為PPIC9K-C0L1 ;對pPIC9K-C0Ll質(zhì)粒與人胸腺素β 4分別進(jìn)行EcoR I、Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，命名為pPIC9K-COLl-T0 4 ;該重組DNA序列如下.1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT.61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC.121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT.181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT.241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG.301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA.361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT.421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA.481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC.541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA.601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT.661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT.721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT.781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC.841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT.901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT.961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT.1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT.1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT.1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT.1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA.1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT.1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG.1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC.1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT.1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT.1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT.1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT.1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT.1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT.1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAAACCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG. 1861 TTCGATAAGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCAAGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG.1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC (3)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化 將10 μ g經(jīng)Sal I內(nèi)切酶線性化的pPIC9K-COLl-T β 4質(zhì)粒，與80 μ L畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至O. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，電擊4 10毫秒，加入ImL冰預(yù)冷的.lmol/L的山梨醇水溶液將菌體混勻，涂布MD培養(yǎng)基平板，30°C倒置培養(yǎng)2 3天，在MD培養(yǎng)基平板上長出菌落； (4)多拷貝插入重組子的篩選 將MD培養(yǎng)基平板上長出的菌落用無菌牙簽對應(yīng)接種到G418濃度分別為O. 5g/L、lg/L、.2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子； (5)基因重組人胸腺素β4融合蛋白畢赤酵母發(fā)酵 將篩選到的轉(zhuǎn)化子接種于400ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，作為一級種子轉(zhuǎn)接于裝有4L FBS培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，300C、pH值為5. O培養(yǎng)16 20小吋，作為ニ級種子轉(zhuǎn)接入裝有FBS培養(yǎng)基的150L大罐發(fā)酵，生長溫度30°C、誘導(dǎo)溫度29°C、pH值為4. 5、溶氧控制在20% 30%，流加入質(zhì)量濃度為75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，F(xiàn)BS培養(yǎng)基與質(zhì)量濃度為75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的體積比為I : O. 25，誘導(dǎo)發(fā)酵36 42小時(shí)； (6)基因重組人胸腺素β4的純化 發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液，用孔徑為O. I μ m的中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液，用分子量為10000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，得融合蛋白；用腸激酶切割法對融合蛋白進(jìn)行切割，用分子量為10000D或30000D或40000D的超濾膜超濾，收集濾過液，再用分子量為1000D的超濾膜超濾除鹽，得人胸腺素β4粗蛋白；對人胸腺素β4粗蛋白用裝有DEAE Sepharose FF填料的層析柱進(jìn)行層析分離，得基因重組人胸腺素β 4，人胸腺素β 4氨基酸序列如下ISDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因重組人胸腺素β4的制備方法，其特征在干在基因重組人胸腺素β4的純化步驟(6)中，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心分離，取上清液，用孔徑為.O.I μ m中空纖維微濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，收集濾過液,用分子量為10000D的卷式超濾膜超濾，收集濃縮液，得融合蛋白；用腸激酶切割法對融合蛋白進(jìn)行切割，用分子量為30000D的超濾膜超濾，收集濾過液，再用分子量為1000D的超濾膜超濾除鹽，得人胸腺素β4粗蛋白；對人胸腺素β 4粗蛋白用裝有DEAE Sepharose FF填料的層析柱進(jìn)行層析分離，得基因重組人胸腺素β 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因重組人胸腺素β4的制備方法，其特征在于所述的腸激酶切割方法為用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，稀釋至5mg/ml，加入重組腸激酶，每單位重組腸激酶切割5mg的融合蛋白，pH為6. O 8. 0，16°C切割18小吋。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組人胸腺素β4的制備方法，其特征在于所述的腸激酶切方法為用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，稀釋至5mg/ml，加入重組腸激酶，每單位重組 腸激酶切割5mg的融合蛋白，pH為8. 0,16°C切割18小吋。
全文摘要
一種基因重組人胸腺素β4的制備方法，包括基因的獲得、載體pPIC9K與I型人膠原蛋白和畢赤酵母電轉(zhuǎn)化人胸腺素β4的連接、多拷貝插入重組子的篩選、基因重組人胸腺素β4融合蛋白畢赤酵母發(fā)酵、基因重組人胸腺素β4的純化步驟。本發(fā)明利用人I型人膠原蛋白在畢赤酵母的高表達(dá)特性引導(dǎo)人胸腺素β4在畢赤酵母中穩(wěn)定高效表達(dá)。在融合蛋白的I型人膠原蛋白前導(dǎo)肽與人胸腺素β4之間引入腸激酶切位點(diǎn)，避免了人胸腺素β4因?yàn)榉肿恿枯^小，表達(dá)、純化過程中所遇到的難題，增加了表達(dá)量，簡化了純化程序，提高了產(chǎn)品的提取純化效率，可用于制備基因重組人胸腺素β4。
文檔編號C12N15/81GK102660550SQ20121014995
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者侯增淼, 李哲, 李曉穎, 趙金禮, 高恩 申請人:西安華澳麗康生物工程有限公司