專利名稱：基因重組Exendin-4的表達和制備新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于基因重組制備Exendin-4的工藝，重點是經(jīng)優(yōu)化后的工程菌構(gòu)建、 發(fā)酵表達、純化的工藝。
背景技術(shù)：
近二十年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率急劇升高。全球糖尿病患者 已近2. 5億，并且以10%以上的速度遞增。目前我國糖尿病患者已逾7000萬，并且糖尿病 患者增長率是歐美國家的2倍。胰高血糖素樣肽-Kglucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1)受體激動劑為II型糖尿病的治療提供了新的思路。此類藥物促胰島素分泌作用呈 明顯的血糖依賴性，低血糖發(fā)生幾率低；同時改善胰島0細胞功能并促進0細胞增殖，并 且可以減輕體重，降低血壓，在II型糖尿病治療領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢，成為近來糖尿病治療 領(lǐng)域的研究熱點。人體內(nèi)源性激動劑GLP-1在可以被DPPIV和中性肽鏈內(nèi)切酶24. 11迅速降解，體 內(nèi)半衰期僅l-2min。Exendin-4是從希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中分離得到的，其具有 GLP-1相同的調(diào)控血糖功能，并且這一天然化合物對DPPIV具有很高的耐受性，在體內(nèi)的穩(wěn) 定性遠高于GLP-1，體內(nèi)半衰期達2-4小時。Exendin-4的臨床實驗效果充分體現(xiàn)了 GLP-1 受體激動劑的優(yōu)勢，每天注射兩次，控制血糖、降低體重的效果良好。并且其優(yōu)勢還在于不 需要根據(jù)糖化血紅蛋白(HbAlc)或血糖水平來調(diào)整劑量，在早餐和晚餐前給予固定劑量即 可，從而減少監(jiān)測血糖的不便。該藥物已由美國Amylin和禮來合作開發(fā)上市，最初批準和 二甲雙胍、磺脲類藥物聯(lián)合使用治療使用口服降糖藥未能取得良好效果的II型糖尿病患 者。2009年10月，F(xiàn)DA批準擴大Byetta的適應(yīng)癥，可用于單一療法，結(jié)合飲食和鍛煉控制 血糖。Exendin-4多肽的制備方法有化學合成法和基因重組法，目前用化學合成法的比 較多，已上市的Byetta是化學合成的。但是合成儀器昂貴、成本較高，過程涉及有害化學物 質(zhì)。基因重組法易于規(guī)模放大，對環(huán)境影響小，制備成本低。研究內(nèi)容本發(fā)明提供的Exendin-4生產(chǎn)方法，采用基因重組法，步驟簡捷，安全高效，周期 短，易于規(guī)模放大。研究內(nèi)容包括表達工程菌的構(gòu)建、工程菌發(fā)酵表達、目的蛋白的純化工藝和活性 理化性質(zhì)分析鑒定。1.工程菌的構(gòu)建內(nèi)容包括根據(jù)密碼子偏愛性設(shè)計序列、合成全基因序列、酶切連接轉(zhuǎn)導，構(gòu)建了 以大腸桿菌BL21 (DE3)plysS為宿主菌、以pET32a(+)為表達載體的Exendin-4融合表達 系統(tǒng)。全基因序列中包括構(gòu)建克隆所需的BglII、XhoI酶切位點、腸激酶酶切位點，序列 如“序列表”所述?；蛉蛄械暮铣?、BL21(DE3)plysS宿主菌都購自invitrogen公司；pET32a(+)表達載體購自Novagen公司，是基因重組表達的常用菌株，融合蛋白表達量高、 可溶性高、便于捕獲純化。工程菌構(gòu)建完成后，經(jīng)目的片段測序鑒定，結(jié)果表明工程菌構(gòu)建正確。2.工程菌發(fā)酵表達本發(fā)明的工程菌發(fā)酵采用乳糖誘導法。以葡萄糖、乳糖為碳源，在優(yōu)先利用葡萄 糖后，添加乳糖為碳源，同時誘導融合蛋白表達。而常用的誘導劑IPTG，對人體有潛在的毒 性，價格也比較昂貴；乳糖誘導則兼?zhèn)涮峁┨荚?、無毒、價格低，也可獲得誘導產(chǎn)生相同量的 表達蛋白。如果試驗設(shè)計合理，還可減少了補加誘導劑步驟，操作簡便，減少污染機會。確立了工程菌株后，通過對種子培養(yǎng)基、接種濃度、發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵過程參數(shù)的 摸索，確定工藝步驟如下(1)將凍存種子按1 100接種于含50微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在 37°C、180rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)約8_12小時，為一級種子液；(2)將一級種子液按適當比例接種于含適量抗生素的LB培養(yǎng)基，在37°C、200rpm 下?lián)u瓶培養(yǎng)約6-8小時，0D_ = 2. 0 3. 0時為二級種子；菌體此時處于對數(shù)生長期初期， 生長旺盛，更容易適應(yīng)新的生長環(huán)境；(3) 二級種子液接種比例為1 10接種入發(fā)酵起始培養(yǎng)基；發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度 控制在37°C，氨水調(diào)節(jié)pH至7. 00 士 0. 2，溶氧率通過攪拌速度和通氣量維持在30 %以上，用 20 %的泡敵溶液做消泡劑，根據(jù)發(fā)酵過程各培養(yǎng)階段工程菌生長補料。工程菌生長達合適密度時，開始乳糖誘導。誘導培養(yǎng)要保證適合濃度的乳糖碳源 和氮源，維持溶氧率在20%以上，誘導表達3. 5小時終止發(fā)酵離心收菌。乳糖誘導發(fā)酵可選 擇①批式培養(yǎng)初始培養(yǎng)基含有葡萄糖(5-10g/L)和乳糖(5g/L)，大腸桿菌在優(yōu)先利用葡 萄糖后，用自行啟動乳糖做碳源，既可促進菌體生長，又可促進蛋白表達。但是若乳糖濃度 過高，則會產(chǎn)生抑制作用。批式培養(yǎng)適合搖瓶培養(yǎng)摸索乳糖濃度和小試規(guī)模。②乳糖誘導 液補料培養(yǎng)在M9發(fā)酵培養(yǎng)基加葡萄糖培養(yǎng)工程菌至合適密度時，開始流加乳糖和酵母提 取物的誘導培養(yǎng)液。此種方式，適合于中試及以上規(guī)模，乳糖濃度相對恒定，誘導培養(yǎng)時間 容易掌握。3.目的蛋白的純化工藝研究內(nèi)容包括融合蛋白的捕獲、腸激酶酶切融合蛋白、酶切混合物的純化。其中第 三步，與以往的二次M柱收集流穿的粗分離，結(jié)合SOURCE反相、離子交換的精細純化相比， 本發(fā)明提供的C4反相工藝實現(xiàn)了一步純化得99%以上純品的目標。該工藝簡化了流程，節(jié) 省時間、空間、試劑耗材，易于規(guī)模放大。具體步驟如下(1) :Ni-Sepharose 6FF 親和層析法捕獲帶 His-S-Trx 標簽的 Exendin-4 融合蛋 白；(2)適宜濃度的腸激酶酶切融合蛋白，得到標簽蛋白與目的多肽的混合液；(3):制備級HPLC的C4反相柱純化，得到高純度的目的多肽；后續(xù)可通過 Superdex30或S印hadexG-25將目的多肽置換到制劑溶液中。4.活性理化性質(zhì)分析鑒定經(jīng)SDS-PAGE電泳、HPLC、質(zhì)譜、相應(yīng)的細胞活性檢測分析鑒定，獲得的目的多肽與設(shè)計的完全一致。
具體實施例方式實施例一搖瓶批式發(fā)酵，摸索乳糖誘導濃度(1)將凍存種子按1 100接種于含50 u g/mL Amp的20mL/瓶LB培養(yǎng)基1瓶， 在37°C、180rpm下?lián)u瓶過夜培養(yǎng)；(2)將上述種子液按1 100接種于含50 u g/mLAmp的200mL/瓶LB培養(yǎng)基7瓶， 在37°C、200rpm下培養(yǎng)；約2小時后，OD600 = 0 . 6時，開始誘導，分別加入Og/L乳糖、3g/L 乳糖、6g/L乳糖、9g/L乳糖、12g/L乳糖、15g/L乳糖、0. 4mMIPTG。37 °C繼續(xù)培養(yǎng)4h，收菌。(3)取相同重量的每份菌產(chǎn)物，稀釋為相同濃度，超聲破碎，取上清，觀察蛋白表達 量(見圖2)。實施例二乳糖誘導液補料發(fā)酵培養(yǎng)(1)將凍存種子按1 100接種于含50 u g/mL Amp的20mL/瓶LB培養(yǎng)基1瓶， 在37°C、180rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)約12小時，為一級種子液；(2)將一級種子液按1 100接種于含50 u g/mLAmp的200mL/瓶LB培養(yǎng)基5瓶， 在36°C、200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)約8小時，為二級種子；(3) 二級種子液接種比例為1 10接種入9L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分g/ L :glucose 2. 5, tryptone 10, yeast extract 5, KH2P042, K2HP044, NaH2P04 12H20 7, (NH4)2S041. 2,NH4C10. 2,MgS04 '7H20 0.2，NaCI 1)的發(fā)酵罐；溫度控制在 37°C，氨水調(diào)節(jié) pH 至7. 0士0. 2，初始攪拌速度為250rpm，通過逐步增加攪拌速度和通氣量維持溶氧量在30% 以上。約2 2. 5h后，溶氧急劇上升到80%以上時，按0. 2 0. 3mL/L/min的速度補加 20%葡萄糖溶液(glucose 200g/L, yeast extract 50g/L)，60 120min后停止。此時 0D_ 為11 13，首次快速加入至乳糖終濃度9g/L，之后按0. 15 0. 3mL/L/min的速度補加乳 糖誘導液(Iactose200g/L，yeast extract 50g/L)，誘導5h后收菌。經(jīng)離心后稱重共獲得 濕菌400克。取誘導Oh、lh、2h、3h、4h、5h的菌體，相同濃度超聲破碎，取上清。經(jīng)15 % SDS-PAGE 膠檢驗，分子量約為21KD，目的蛋白表達量約為15 20% (見圖3)。實施例三目的多肽的純化菌體處理取100g濕菌，溶于1. 0L Tris緩沖液(50mM Tris,300mM NaCl)中，超 聲破碎，4°C，8000rpm離心20min，取上清，0. 45 u m濾膜過濾。(1)加20mLlM咪唑于細胞裂解液，使上樣緩沖液含20mM咪唑；選用含 lOOmLNiSepharose 6FF柱料的柱子，經(jīng)平衡(20mM咪唑)、上樣(20mM咪唑)、清洗(40mM咪 唑)、洗脫(100 150mM咪唑)，收集Exendin-4融合蛋白；(2)用50mMTris溶液將融合蛋白稀釋到酶切緩沖液(50mMTris，50mMNaCl, 15 25mM咪唑)，加入合適濃度的腸激酶，30 37度酶切6 12h ；
(3)選用制備級HPLC的C4反相柱(250mmX 10mm)，檢測波長為214nm，柱溫30°C ； 以H20(0. 1 % TFA)為流動相A，以乙腈(0. 1 % TFA)為流動相B ；上樣100mL，流速4. OmL/ min，線性梯度洗脫，收集第11峰，其保留時間為16. 470 (見圖4)。經(jīng)檢測，收集的目的多肽組分純度為99. 8%。后續(xù)可用S印hadexG-25將目的多肽置換到制劑緩沖液中。Exendin-4多肽純化過 程的Tris-Tricine電泳圖(見圖5)。實施例四部分性質(zhì)分析鑒定(1)純度檢測選用C4色譜柱(100mmX4. 6mm)，檢測波長為214nm，柱溫30°C，流 速0. 8mL/min ；以H20(0. 1% TFA)為流動相A，以乙腈(0. 1% TFA)為流動相B ；線性梯度洗 脫從20% B到60% B。結(jié)果表明目的多肽純度為99% (見圖6)。(2)分子量檢測基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF，ABI-4700 型)進行分子量測定，結(jié)果表明所純化多肽的分子量為4186. 4，與理論值一致(見圖7)。(3)細胞體外活性檢測選用大鼠胰島素瘤細胞株RINm_5F，接種處于對數(shù)生長期 的細胞1. 0X105個/mL，100 ii L于96孔板一培養(yǎng)2天后，待細胞長至90%覆蓋率一換為無 血清1640培養(yǎng)基，饑餓孵育2h —用1640培養(yǎng)基將樣品和對照品預(yù)稀釋到一定濃度，然后 做2倍系列稀釋梯度，用此稀釋梯度刺激lOmin —去上清，收集細胞，用R&D公司的cAMP酶 免試劑盒檢測各樣品中的cAMP值。經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析，用Exendin-4樣品濃度的lg值做X軸，cAMP值做Y軸；樣品與 參考品的四點直線回歸部分R2(參考品)=0.96、鏟(樣品)=0.95，斜率無顯著性差異， 活性與參考品相當(見圖8)。


圖1 工程菌的質(zhì)粒目的序列測序圖；圖2 批式培養(yǎng)發(fā)酵工藝過程，融合蛋白表達圖各泳道是不同誘導劑作用下產(chǎn)生的菌體裂解上清，誘導劑分別為1 :0g/L乳糖； 2 :3g/L 乳糖；3 :6g/L 乳糖；4 :9g/L 乳糖；5 :12g/L 乳糖；6 :15g/L 乳糖；7 0. 4mMIPTG ；M Markero圖3 乳糖誘導液補料發(fā)酵培養(yǎng)過程，融合蛋白表達圖各泳道是發(fā)酵過程不同時間點樣品的裂解上清，分別是1 誘導Oh ；2 誘導lh ；3 誘導 2h ；4 誘導 3h ；5 誘導 4h ；6 誘導 5h ；M :Marker。圖4 純化過程，在線檢測圖；圖5 純化全程及目的多肽的Tris-Tricine圖各泳道分別為1 工程菌發(fā)酵誘導前上清；2 工程菌發(fā)酵誘導后上清；3 :Ni S印har0Se6FF親和純化融合蛋白；4 腸激酶酶切融合蛋白混合物；5 :C4反相柱純化后原 液的3 ii L上樣；M :Marker ；6 :C4反相柱純化后原液的6 y L上樣；7 :C4反相柱純化后原液 的10 ii L上樣；圖6 :目的多肽的HPLC純度分析圖；圖7 :目的多肽的質(zhì)譜分析圖8 目的多肽的細胞活性檢測分析圖。
序列表
<110>揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司
揚子江藥業(yè)集團
<120>基因重組Exendin-4的表達和制備新方法
<160>1
<170>Patentln 3.3
<210>1
<211>148
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含酶切位點
<400>1
agatctggac gacgacgaca agcatggtga aggtaccttc accagcgatctgtctaagca 60
aatggaagag gaggccgtgc gtctgtttat tgaatggctg aaaaacggtggcccaagctc 120
tggcgcgccg ccaccaagct gactcgag148
菌株構(gòu)建補充說明
1.基因合成
全基因序列合成可由生物公司協(xié)助完成，序列包括構(gòu)建克隆所需的BglII、XhoI
酶切位點、腸激酶酶切位點，序列如“序列表”所述。2.表達載體構(gòu)建以購自Novagen公司的pET32a(+)為表達載體，以BglII、XhoI酶切位點將目的序 列片段插入表達載體。3.表達菌株構(gòu)建選用電轉(zhuǎn)法或熱激法，將含有目的片段的表達載體轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)plysS感受態(tài) 菌株，該菌株購自irwitrogen公司。涂布于LB/Amp+培養(yǎng)基上，挑選單克隆做鑒定。4.篩選與鑒定可通過菌株P(guān)CR、提取質(zhì)粒測序、提取質(zhì)粒酶切、表達蛋白大小分析等手段檢測所 挑選的菌株是否與設(shè)計的一致。鑒于此，本發(fā)明涉及的菌株可自行構(gòu)建完成，無需生物材料樣品保藏。
權(quán)利要求
采用經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列構(gòu)建工程菌，經(jīng)過發(fā)酵表達、純化，獲得高純度的目的多肽；多肽經(jīng)理化活性分析鑒定，與設(shè)計的一致。
2.如權(quán)利要求1所述，目的多肽的堿基序列如說明書中所述。
3.如權(quán)利要求1所述，工程菌的發(fā)酵過程采用流加乳糖誘導法。
4.如權(quán)利要求2所述，目的多肽的純化經(jīng)金屬螯合捕獲融合蛋白一腸激酶酶切一制備 級HPLC的C4反相柱純化，一步酶切二步層析法獲得高純度目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于基因重組Exendin-4的表達和制備新方法，各個步驟經(jīng)過優(yōu)化后，簡捷高效，縮小了所需時間空間，選用對環(huán)境和人員無害的原材，便于操作和規(guī)模放大。優(yōu)化后的方法流程如下(1)用密碼子優(yōu)化后的堿基序列，構(gòu)建大腸桿菌工程菌株；(2)工程菌的發(fā)酵表達采用乳糖誘導法；(3)純化工藝中，目的多肽的分離采用制備級C4柱反相純化；(4)所純化的多肽經(jīng)過理化、活性分析鑒定，與設(shè)計的一致。
文檔編號C07K1/20GK101993851SQ201010513310
公開日2011年3月30日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者丁宇, 干玉, 李光偉, 李國偉, 楊子義, 閆榮 申請人:揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司;揚子江藥業(yè)集團有限公司