Afp和il-2雙基因共表達重組載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發(fā)明所述的雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接AFP基因和IL-2基因，能夠在同一載體中同時表達人甲胎蛋白以及人白細胞介素-2，該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發(fā)揮細胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對肝癌產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
【專利說明】AFP和IL-2雙基因共表達重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種雙基因共表達重組載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年發(fā)生的肝癌占全世界的50%以上，肝癌死亡率己占全國腫瘤死亡率的第二位，是一種嚴重威脅人們生命健康的疾病。手術(shù)切除是目前療效最好的肝癌治療手段，目前肝移植技術(shù)亦相當(dāng)成熟，但由于費用高、供體來源困難，術(shù)后使用抗排斥藥物會因免疫抑制而使殘癌生長更快和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移等問題，對中晚期肝癌的療效欠佳。
[0003]近年來，隨著分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，腫瘤免疫治療已成為腫瘤治療研究的熱點，多種免疫治療方法已用于肝癌的臨床研究，比如細胞因子治療，自體完整的腫瘤細胞疫苗，效應(yīng)細胞回輸治療，以樹突狀細胞為基礎(chǔ)的肝癌疫苗等。目前，多種不同的免疫治療策略已經(jīng)顯示了抗肝癌的生物免疫活性和初步的臨床效力，能夠影響肝癌復(fù)發(fā)和治療后生存期。其中，細胞因子基因免疫治療是腫瘤免疫治療與基因治療的結(jié)合，其通過將具有抗腫瘤作用的細胞因子基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，并使之穩(wěn)定有效地表達，使體內(nèi)持續(xù)存在一定水平的內(nèi)源性細胞因子，以發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而，目前的細胞因子基因免疫治療方法缺乏腫瘤靶向性，其抗腫瘤效果有待提高。
[0004]白細胞介素-2(interleukin-2, IL-2),又名 T 細胞生長因子(T cell growthfactor, TCRF)，是主要由活化的⑶4+T細胞和⑶8+T細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細胞因子。IL-2是所有T細胞亞群的生長因子，并可促進活化B細胞增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，其亦參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。IL-2抗腫瘤作用的機制主要通過刺激機體的固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)`來對腫瘤細胞進行殺傷作用。IL-2可以促進某一特定T細胞群的克隆性擴增，其可通過提高NK細胞與淋巴激活殺傷細胞(LAK)的細胞數(shù)量和活性，并激活TIL細胞，從而誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤生長停止或瘤體消退。此外，IL-2也在調(diào)節(jié)T細胞成熟過程中起重要作用，同時也能協(xié)同刺激B細胞增殖與分泌、增強活化的T細胞產(chǎn)生干擾素。
[0005]近年來，IL-2因其能夠激活抗腫瘤免疫作用，被認為是治療消化系統(tǒng)實質(zhì)性腫瘤的有效選擇。聯(lián)合使用吉西他濱和IL-2對于胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的治療或是胰腺癌術(shù)后預(yù)防肝轉(zhuǎn)移都有較好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2是肝癌病人的一個重要的預(yù)后影響因子，甚至對于一些早期的病人來說也是如此；經(jīng)門靜脈直接注射IL-2能夠更好地刺激肝臟自然殺傷細胞(Nature Killer Cell, NK細胞)，對肝臟腫瘤起殺傷作用；而聯(lián)合使用IL-2和IL-12被報道能夠提高肝癌術(shù)后患者機體免疫能力并延長生存率。然而，目前的IL-2基因免疫治療方法只是局部地提高機體的IL-2蛋白表達水平，其免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤能力較小，且缺乏免疫治療的靶向性。
[0006]甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein, AFP)是一個胚胎特異性的a-球蛋白，是哺乳動物早期胚胎血清中的一個重要的組份。正常情況下，AFP是由胎兒的肝臟和卵黃囊產(chǎn)生的，胎兒出生后，血清中的AFP含量迅速下降，在正常的成人體內(nèi)是檢測不到或僅有極其微量的AFP。AFP是人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有臨床應(yīng)用價值的腫瘤標志物，一直以來被認為是診斷原發(fā)性肝細胞癌的重要標志物。在成人中，約有80%的原發(fā)性肝細胞癌患者的血清中，都可以檢測到AFP的表達，顯示AFP篩查是發(fā)現(xiàn)早期肝癌的一種高效的手段。AFP可以作為腫瘤標志物，作為腫瘤免疫治療的靶位，刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，腫瘤細胞可以在其表面表達并遞呈AFP多肽與MHC復(fù)合物，進而刺激機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細胞，殺傷腫瘤細胞。研究表明，AFP可以和多種抗癌藥物結(jié)合，并通過受體介導(dǎo)的胞吞作用選擇性地進入腫瘤細胞，從而靶向、高效地殺死腫瘤細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此，有必要針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發(fā)揮細胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對肝癌產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是，提供所述AFP和IL-2雙基因共表達重組載體的制備方法。
[0009]本發(fā)明的再一個目的是，提供所述AFP和IL-2雙基因共表達重組載體在肝癌的基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0010]AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示,所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0011]在其中一個實施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為PIRES2-AFP-1L-2重組載體；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
[0012]在其中一個實施例中，所述pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被IL-2基因替代。
[0013]本發(fā)明所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0014]I)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段；
[0015]2)將步驟I)得到的AFP基因片段連接于載體，構(gòu)建含有AFP基因的重組載體；
[0016]3)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段；
[0017]4)將步驟3)得到的IL-2基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體。
[0018]在其中一個實施例中，所述的pIRES2-AFP-1L-2重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0019]a)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段:從肝癌細胞H印G2獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點序列的AFP特異性引物進行PCR擴增，得到含有BglII和EcoR I酶切位點的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0020]b)構(gòu)建pIRES2-AFP-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶Bgl I1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重組載體；
[0021]c)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進行雜交PCR反應(yīng)，得到IL-2基因片段混合物，其中的一種IL-2基因片段具有BstX
I和Not I酶切粘性末端；
[0022]d)構(gòu)建pIRES2-AFP-1L-2重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX 1.Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-AFP-EGFP重組載體，將步驟c)得到的IL-2基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)，得到pIRES2_AFP-1L_2
重組載體。
[0023]在其中一個實施例中，步驟a)所述的AFP特異性引物為:
[0024]AFP 上游引物:5 ’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3，，
[0025]AFP 下游引物:5 ’ -TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3 ’。
[0026]在其中一個實施例中，步驟c)所述的IL-2特異性引物包括IL-2第一引物對和IL-2第二引物對，所述的IL-2第一引物對由IL-2上游長引物和IL-2下游長引物組成，所述的IL-2第二引物對由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物組成:
[0027]IL-2第一引物對為:
[0028]IL-2 上游長引物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0029]IL-2 下游長引物:5’-GGCCGCTCAAGTCAGTGITGAGATGAT-3’ ；
[0030]IL-2第二引物對為:
[0031]IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0032]IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGITGAGATGATGC-3’。
[0033]本發(fā)明所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體在肝癌基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0034]在其中一個實施例中，將所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體轉(zhuǎn)染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內(nèi)，進行肝癌基因免疫治療。
[0035]本發(fā)明所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接AFP基因和IL-2基因，能夠在同一載體中同時表達人甲胎蛋白(AFP)以及人白細胞介素-2 (IL-2)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關(guān)的外源基因序列的引入。其中，AFP是腫瘤靶向性的相關(guān)抗原，IL-2是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，兩者聯(lián)合使用，既可以發(fā)揮細胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又可以靶向性地針對肝癌產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，從而能夠獲得更好的肝癌免疫治療效果。將雙基因共表達重組載體轉(zhuǎn)染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內(nèi)，AFP的大量表達，可刺激樹突狀細胞遞呈AFP多肽與MHC復(fù)合物，進而刺激機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細胞，靶向性殺傷表達AFP多肽的腫瘤細胞；而IL-2的大量表達，能進一步增 強機體免疫調(diào)節(jié)能力，并能增強特異性T淋巴細胞的擴增能力和細胞活力，增強活化的T細胞產(chǎn)生干擾素，協(xié)同擴大抗腫瘤免疫效應(yīng)。
[0036]IRES序列是來源于某些病毒和細胞mRNA5’端的一段非翻譯區(qū)，可以不依賴帽的方式啟動遠端的mRNA翻譯，可在上游啟動子的控制下和與之相連的基因共同轉(zhuǎn)錄，在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。IRES連接多基因進行共表達時，多個基因的mRNA在同一條轉(zhuǎn)錄子上，但轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程相互獨立，上游基因以傳統(tǒng)方式進行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進行翻譯，保證了各個基因的獨立結(jié)構(gòu)及功能。利用IRES代替內(nèi)部啟動子，不但可使多基因共表達載體大大縮小，而且還克服了傳統(tǒng)多基因表達載體中啟動子之間的相互抑制現(xiàn)象，避免融合蛋白的產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為實施例一所得的含有特異性酶切位點序列的AFP基因片段的電泳圖，其中，I為AFP基因，M為標記；
[0038]圖2 為 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒圖譜；
[0039]圖3為實施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體圖譜；
[0040]圖4為實施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應(yīng)產(chǎn)物，M為標記；
[0041]圖5為實施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標記；
[0042]圖6為實施例三所得的帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端的IL-2基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴增產(chǎn)物A，2為PCR擴增產(chǎn)物B，M為標記；
[0043]圖7為實施例三所述的雜交PCR反應(yīng)的流程圖；
[0044]圖8為實施例四所得的PIRES2-AFP-1L-2重組載體圖譜；
[0045]圖9為實施例四所得的PIRES2-AFP-1L-2重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為Bgl II/EcoR I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，3為Bgl I I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標記。
【具體實施方式】`
[0046]下述實施例中，所用到的實驗技術(shù)，例如PCR技術(shù)、引物設(shè)計技術(shù)、載體構(gòu)建技術(shù)、檢測技術(shù)、電泳技術(shù)等均為基因工程中的常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社第三版；或者按照產(chǎn)品說明書進行)。在操作過程中所用到的設(shè)備、試劑、載體、菌株等，均為通過市場購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0047]實施例一:獲取含有特異性酶切位點的AFP基因片段
[0048]1、引物設(shè)計
[0049]根據(jù)AFP基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和pIRES2_EGFP質(zhì)粒載體上預(yù)期插入的多克隆位點，設(shè)計特異性引物如下:
[0050]AFP上游引物(如序列表中SEQ ID N0:4所示):
[0051]5? -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3?(下劃線部分為 Bgl II 酶切位點序列)，
[0052]AFP下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0053]5，-TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點序列)。
[0054]2、獲取cDNA模板
[0055]TRIzon法從人肝癌細胞H印G2中提取RNA(TRIzon總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，產(chǎn)品編號為CW0580)，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號為RR019A)。[0056]3、獲取含有特異性酶切位點的AFP基因片段
[0057]以人肝癌細胞H印G2中提取的RNA所反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，通過PCR反應(yīng)獲得AFP基因片段，其上游含有Bgl II酶切位點序列，下游含有EcoR I酶切位點序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。
[0058]PCR反應(yīng)體系如下(50 ii L):
[0059]
【權(quán)利要求】
1.AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因； 所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: I所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，其特征在于：所述的載體為pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2-AFP-IL-2重組載體；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體，其特征在于：所述PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被IL-2基因替代。
4.權(quán)利要求1所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟： 1)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段； 2)將步驟I)得到的AFP基因片段連接于載體，構(gòu)建含有AFP基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段； 4)將步驟3)得到的IL-2基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體。
5.權(quán)利要求2所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟： a)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段：從肝癌細胞H印G2獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點序列的AFP特異性引物進行PCR擴增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位點的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)構(gòu)建pIRES2-AFP-EGFP重組載體：用限制性內(nèi)切酶BglII、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段：從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進行雜交PCR反應(yīng)，得到IL-2基因片段混合物，其中的一種IL-2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構(gòu)建pIRES2-AFP-IL-2重組載體：用限制性內(nèi)切酶BstXI.Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-AFP-EGFP重組載體，將步驟c)得到的IL-2基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)，得到pIRES2_AFP-IL_2重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的AFP特異性引物為： AFP 上游引物：5’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3’， AFP 下游引物：5’ -ITGAAITCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟c)所述的IL-2特異性引物包括IL-2第一引物對和IL-2第二引物對，所述的IL-2第一引物對由IL-2上游長引物和IL-2下游長引物組成，所述的IL-2第二引物對由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物組成： IL-2第一引物對為： IL-2 上游長引物：5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，IL-2 下游長引物：5’ -GGCCGCTCAAGTCAGTGITGAGATGAT-3’ ； IL-2第二引物對為： IL-2 上游短引物：5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’， IL-2 下游短引物：5’ -GCTCAAGTCAGTGITGAGATGATGC-3’。
8.權(quán)利要求1或2所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體在肝癌基因免疫治療中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：將所述的AFP和IL-2雙基因共表達重組載體轉(zhuǎn)染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內(nèi)，進行肝癌基因免疫治療。
【文檔編號】C12N15/85GK103614414SQ201310603467
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】曹毓琳, 左百樂, 栗炳南, 連杰, 林俊堂, 豐慧根 申請人:河南省華隆生物技術(shù)有限公司