專利名稱：重組人sCTLA4－Ig融合蛋白基因及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4的融合蛋白基因，更特別的，本發(fā)明涉及一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白基因及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
即溶細胞性T細胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte associate Antigen-4，CTLA-4，又稱CD152)，是表達在活化T細胞表面的標志性分子之一。研究表明，該成分是維持體內(nèi)T細胞穩(wěn)定性的負調(diào)控因子，具有抑制活化T-細胞的增值的功能，與CD28構(gòu)成了一對十分重要的免疫調(diào)節(jié)因子。目前，它被作為免疫抑制受體進行了廣泛的研究，在臨床上有可能作為抑制免疫排斥反應的制劑進行應用。
T-細胞、抗原提呈細胞表面參與產(chǎn)生共刺激作用的分子統(tǒng)稱為共刺激分子。目前公認最重要的共刺激通道為B7-CD28共刺激通路。B7位于抗原提呈細胞，與T細胞表面的CD28分子結(jié)合可以產(chǎn)生共刺激。當T細胞激活后，其細胞表面會岀現(xiàn)另外一種可以與B7細胞結(jié)合的分子CTLA4。CTLA4與B7的親和力很高，該分子與B7細胞結(jié)合后可以誘導B7細胞的調(diào)亡。因此目前認為它對T細胞激活有負調(diào)節(jié)作用，對于維持人體內(nèi)免疫狀態(tài)的平衡起重要作用。CTLA4還可以與CD80和CD86結(jié)合，它們的親和力比CD28明顯高，其功能與CD28相反，對T細胞有負調(diào)節(jié)作用。
CTLA-4是一種極性跨膜蛋白。將這種蛋白的膜外可溶性部分與抗體分子的Fc片段的編碼區(qū)融合在一起構(gòu)成的融合基因sCTLA4-Ig，插入適當?shù)妮d體，導入適當?shù)募毎罂梢缘玫揭环N天然不存在的融合蛋白，它既有細胞表面受體預期原有配體結(jié)合的能力，又有抗體分子一樣的可溶性，半衰期和抗體分子接近，保持活性時間比較長。利用人源基因獲得的蛋白分子在體內(nèi)不會引起免疫反應。目前已經(jīng)由多種類似的可溶性融合蛋白質(zhì)被制備出來并成功地用于臨床。CTLA4的可溶性受體可以競爭性地與B7分子結(jié)合，而且其對B7的親和力遠遠大于CD28，因此可以明顯地抑制B7-CD28通道。
sCTLA4-Ig與APC上表達的CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的親和力高于T細胞上表達的CD28與B7-1和B7-2的親和力。sCTLA4-Ig的作用是抑制CD28介導的T細胞共刺激作用。CD40/CD40L途徑是另一組攻刺激分子，能刺激T和B細胞同時轉(zhuǎn)化。如封閉CD40/CD40L途徑，能延長小鼠和靈長類的同種異體移植物存活。如果聯(lián)合sCTLA4-Ig和抗CD40L單抗封閉這兩種共刺激作用途徑將顯著延長移植物存活。鑒于T細胞在移植物排斥中的重要作用，目前臨床使用和正在研制的絕大多數(shù)免疫抑制劑都作用于T細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白基因，其具有SEQ ID NO1所述的基因序列。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物，所述的藥物組合物中包含sCTLA4-Ig融合蛋白、海藻糖以及磷酸鹽緩沖液。
更特別的，所述的重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物含有sCTLA4-Ig融合蛋白10-30mg/ml，含有海藻糖20-50mg/ml，溶解在100mM的磷酸鹽緩沖液中。比如，其中可含有CTLA4-Ig融合蛋白20mg/ml，含有海藻糖40mg/ml，溶解在100mM的磷酸鹽緩沖液中。
更特別的，在制備所述的重組人sCTLA4-Ig融合蛋白的藥物組合物時，可將液態(tài)的藥物組合物制成凍干制劑，在施用時用蒸餾水重懸。
更特別的，所述的重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物可采取肌內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥或皮內(nèi)給藥。
在本發(fā)明中，“本發(fā)明的藥物組合物”指含有sCTLA4-Ig融合蛋白和藥學上可接受的載體的組合物，可起到抑制機體免疫反應的作用。
在本發(fā)明中，“(s)CTLA4-Ig融合蛋白”指由人CTLA-4可溶部分(sCTLA-4)與人Ig抗體Fc片段融合所形成的融合蛋白。
海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-(-吡喃葡糖苷))是天然存在的非還原型二糖。海藻糖的形式包括結(jié)晶型的海藻糖二水合物(TD)，非結(jié)晶型海藻糖(AT)，也可以是無水形式的海藻糖，即無水非晶型海藻糖(AAT)和無水結(jié)晶海藻糖(ACT)。本發(fā)明中可使用任何物理形式的海藻糖，包括無水、部分水合、完全水合的海藻糖。
在使用本發(fā)明的藥物組合物時，是將安全有效量藥物組合物用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10μg sCTLA4-Ig融合蛋白/Kg體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8mg sCTLA4-Ig融合蛋白/Kg體重，較佳地該劑量是約10μg/千克體重-約1mg/Kg體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況、年齡等因素。


圖1顯示了本發(fā)明所用的表達載體pMG18-3K，標明了其中的元件及酶切位點。HCMV pro，人巨細胞病毒Major Immediate早期啟動子；Ck，人κ鏈恒定區(qū)基因；CH，人γ1鏈恒定區(qū)基因；pA，多聚腺苷化信號；DHFR，二氫葉酸還原酶基因；pUC origin，質(zhì)粒復制起始位點；Amp為氨芐青霉素抗性基因。
優(yōu)選實施方式實施例1重組人sCTLA-4融合蛋白的設(shè)計與制備1.重組人sCTLA-4基因的設(shè)計在本申請人的已有專利CN01132075.3中，已經(jīng)公開了本申請人設(shè)計的重組人sCTLA-4融合蛋白基因結(jié)構(gòu)，在本專利中，以改進蛋白的表達量和親和力為出發(fā)點，本申請人對sCTLA-4的基因做了進一步的改進。
基于上述已有專利，本發(fā)明參考一些基因表達的規(guī)律，根據(jù)已有的經(jīng)驗以及密碼子的偏愛性，經(jīng)過數(shù)百次的設(shè)計和改進，設(shè)計出了一段帶有克隆表達操作序列的新的重組sCTLA-4基因(SEQ ID NO1)CATgctagcATGGCTATGCACG TCGCGCAGCC AGCCGTAGTT CTCGCGAGGA GCCGTGGAAT GGCAAGTATA 60GTCTGAGACT AAGCTTCCCC TGGAAAGGCA ACGGACGTGC GAGTCACTGT CCTACGCCAT 120GCAGAGAGGC ACGTCACAGA GGTGTGAGCC GCTACGTAGA ACACCGGAAA GGACTTCACG 180TTGCTCGAAG AGTCGATATG GACCGGAACA TCGAGAGGTA AGCAAGTCAA GCTGACAATT 240CATGGTCTCA GCGCGATGGA GACCGGTCTG TAGATGTGGA ACGTCGACCT GATGTAGCCT 300
CCACGTTAGT AGCTCGGAAT CGGAAAGGGT AGGCACATAT ACGTCATAGA ACCTGATCCC 360TGGCCTGAAT CAGAGTTGCT GCTGTGCATA CTAGCTGCTG TAAGATCCGG CTTCTAATTA 420TAAAGGTTGC TACTGACTGC AGTATCATTC AGGAATATGC TTAACAATAG TAGGCCACTA 480ACTACTGGCG TGTAAGTCAA TATGCCTCCC ACTGACCCTG ATTGAGATAA CCATTTGCAT 540CCTTAATTAA TCGGAATGAA TTGT5642.sCTLA-4/Fc融合基因的獲得人IgG1 Fc片段的序列是已知的(參見例如Genebank登錄號acc82527)。以前述的sCTLA4和帶有全長IgG1基因的質(zhì)粒pMG18-3K(圖1，也可參考DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASEDON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，BelarusState University Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)為模板，設(shè)計相應的引物，進行PCR(具體方法可參見本申請人的專利CN01132075.3)。在瓊脂糖凝膠電泳上獲得分子大小約為1233bp的單一條帶后進行凝膠回收。獲得的DNA按照常規(guī)方法克隆到pUC18載體上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進行藍白斑篩選，通過酶切鑒定和測序，確認序列完全正確的克隆，即為sCTLA4/Fc。
可選擇的，還可以在sCTLA4和IgG1之間加上接頭序列，為(Ala3Ser2)5(SEQID NO2)，其基因序列為5’-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO3)，即為sCTLA4/接頭/Fc(具體方法可參見本申請人的專利CN01132075.3)。
實施例2sCTLA-4融合蛋白的表達1.融合基因表達載體的構(gòu)建將前述構(gòu)建的pUC18[sCTLA-4/Fc]和pUC18[sCTLA-4/接頭/Fc]正確克隆接種于含有氨芐青霉素的20ml液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，用Promega公司的Midi質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，各得質(zhì)粒DNA約30微克。
分別用Nhe I和Xho I(Phamarcia)(10U/μl)消化pUC 18[sCTLA-4/Fc]，pUC18[sCTLA-4/接頭/Fc]和表達質(zhì)粒pMSG(Phamarcia)。酶切反應37℃反應過夜。酶切產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖電泳上進行分離鑒定，用Promega公司的凝膠回收試劑盒回收大小約為1500bp的片段。
分別用T4DNA連接酶(10U/μl)將sCTLA-4/Fc或sCTLA-4/接頭/Fc連接到pMSG載體的Nhe I和Xho I位點。
按照常規(guī)方法(見Sambrook等，1989)用連接所得重組pMSG轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選。各取白斑12個接種于LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)后抽取質(zhì)粒如前所述進行酶切鑒定，每種融合基因至少獲得4個具有正確大小的插入片段的克隆，作為候選克隆。
將上述候選克降中的兩個進行DNA測序。根據(jù)測序結(jié)果，分別確認插入片段的序列與設(shè)計的完全一致。將所得的正確克隆分別記作pMSG[sCTLA4/Fc]、pMSG[sCTLA4/接頭/Fc]。
2.CHO細胞的轉(zhuǎn)化與表達取帶有上述2種重組pMSG的大腸桿菌菌株，分別接種于500ml加入了氨芐青霉素的2xYT液體培養(yǎng)基，37℃，260rpm震蕩培養(yǎng)16小時。用Qiagen公司的“Ultrapure Plasmid Purification Kit”抽提質(zhì)粒DNA，抽提過程按照廠家提供的說明書進行。
用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細胞，轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogene公司。轉(zhuǎn)染時分別取上述純化的pMSG[sCTLA4/接頭/Fc]、pMSG[sCTLA4/Fc]質(zhì)粒100微克作為DNA樣品對CHO細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作程序按照廠家的說明書進行。
轉(zhuǎn)染后的CHO細胞經(jīng)連續(xù)3個月的氨甲喋呤(MTX)篩選，其濃度從0.05μM到10μM，每兩周增加一次濃度，每次MTX的用量約為前一次的2倍，具體視細胞生長情況而定。細胞培養(yǎng)按照常規(guī)進行，培養(yǎng)基為15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后按照常規(guī)極度稀釋法進行單克隆化。應用ELISA方法分別檢測其融合蛋白的表達量，總共得到pMSG[sCTLA4/接頭/Fc]克隆152個、pMSG[sCTLA4/Fc]克隆128個。
在DEME培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，用ELISA對上述部分克隆sCTLA-4的表達強度進行了研究，具體數(shù)據(jù)如下表表1

以上數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明的重組sCTLA-4基因顯著提高了融合蛋白的表達水平，比原有的水平提高了大約一個數(shù)量級(10倍)。
實施例3sCTLA-4融合蛋白抑制淋巴細胞增殖能力的研究將上述pMSG[sCTLA4/接頭/Fc]和pMSG[sCTLA4/Fc]的表達細胞株培養(yǎng)后用A蛋白-Sepharose進行親和層析，獲得純度達90％以上的融合蛋白。
1.常規(guī)分離人外周血淋巴細胞(PBMC)，調(diào)整細胞密度為2×106cells/ml，PBMC和等體積培養(yǎng)液混合后以2×105cells/0.2ml/孔接種“U”型96孔培養(yǎng)板，加入不9同量的純化融合蛋白，設(shè)置等體積相應空載體轉(zhuǎn)染上清或培養(yǎng)基作對照，每組3復孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)5d，終止培養(yǎng)前16h加入3H-TdR(終濃度5μCi/ml)，收集細胞于0.45μm微孔濾膜上，烘干，液體閃爍計數(shù)儀測DPM值。
2.結(jié)果以x±s表示，Microsoft Excel統(tǒng)計程序進行均數(shù)差異顯著性分析。
3.在MLR反應(Linsley P S，Brady W，Urnes M，et al.CTLA-4 is a second receptorfor the B cell activation antigen B7[J].J Exp Med，1991，174(3)561-569.)體系中，分別加入1微克、5微克和10微克Protein A純化純化的sCTLA4/接頭/Fc、sCTLA4/Fc或空載體轉(zhuǎn)染CHO細胞上清，結(jié)果表明，即使加入1微克A蛋白純化的融合蛋白，也能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為60％～70％；而加入同樣體積的空載體轉(zhuǎn)染CHO細胞上清，則無此作用，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果有統(tǒng)計學意義。同樣，我們也曾用未純化的轉(zhuǎn)染細胞的上清直接進行MLR實驗，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細胞轉(zhuǎn)染上清中異源蛋白的刺激作用與微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有關(guān)。
實施例4本發(fā)明的藥物組合物的制備首先配制100mM的磷酸鹽緩沖液，并且調(diào)節(jié)緩沖液的PH值，使其在PH7.0左右。在磷酸鹽緩沖液中加入適量的海藻糖，使其達到50mg/ml，接著加入sCTLA-4融合蛋白，使其達到50mg/ml，獲得的藥劑可以直接施用于哺乳動物(包括人)，如通過靜脈注射的方式。
另外，也可將本發(fā)明的藥物組合物制成凍干制劑，以便于運輸和貯藏。在需要施用時，可以用生理可用的溶劑將本發(fā)明的藥物組合物進行重懸，比如可以使用蒸餾水進行重懸。
序列表<110>上海中信國健藥業(yè)有限公司<120>重組人sCTLA4-Ig融合蛋白基因及其藥物組合物<160>3<210>1<211>564<212>DNA<213>聚核苷酸<400>1GCTATGCACG TCGCGCAGCC AGCCGTAGTT CTCGCGAGGA GCCGTGGAAT GGCAAGTATA 60GTCTGAGACT AAGCTTCCCC TGGAAAGGCA ACGGACGTGC GAGTCACTGT CCTACGCCAT 120GCAGAGAGGC ACGTCACAGA GGTGTGAGCC GCTACGTAGA ACACCGGAAA GGACTTCACG 180TTGCTCGAAG AGTCGATATG GACCGGAACA TCGAGAGGTA AGCAAGTCAA GCTGACAATT 240CATGGTCTCA GCGCGATGGA GACCGGTCTG TAGATGTGGA ACGTCGACCT GATGTAGCCT 300CCACGTTAGT AGCTCGGAAT CGGAAAGGGT AGGCACATAT ACGTCATAGA ACCTGATCCC 360TGGCCTGAAT CAGAGTTGCT GCTGTGCATA CTAGCTGCTG TAAGATCCGG CTTCTAATTA 420TAAAGGTTGC TACTGACTGC AGTATCATTC AGGAATATGC TTAACAATAG TAGGCCACTA 480ACTACTGGCG TGTAAGTCAA TATGCCTCCC ACTGACCCTG ATTGAGATAA CCATTTGCAT 540CCTTAATTAA TCGGAATGAA TTGT564<210>2<211>25<212>PRT<213>接頭肽<400>2Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala5 10 15Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser20 25<210>3
<211>75<212>DNA<213>接頭基因<400>3ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA 60ACCACAACCT CGTCA 7權(quán)利要求
1.一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白的基因，其特征在于，具有SEQ ID NO1所述的基因序列。
2.一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中包含sCTLA4-Ig融合蛋白、海藻糖以及磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物，其特征在于，其中含有sCTLA4-Ig融合蛋白10-30mg/ml，含有海藻糖20-50mg/ml，溶解在100mM的磷酸鹽緩沖液中。
4.權(quán)利要求3-4中任何一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物，其特征在于，可將液態(tài)的藥物組合物制成凍干制劑，在施用時用蒸餾水重懸。
5.權(quán)利要求3-4中任何一種重組人sCTLA4-Ig融合蛋白藥物組合物，其特征在于，可采取肌內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥或皮內(nèi)給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，公開了一種在CHO等哺乳動物細胞中具有高的表達量的重組人sCTLA4－Ig融合蛋白基因。本發(fā)明還公開了一種特異性的免疫抑制劑藥物組合物，其有效成分包含sCTLA4的細胞外區(qū)域和免疫球蛋白的恒定區(qū)域。本發(fā)明的藥物組合物在體內(nèi)可以與抗原提呈細胞表面的CTLA4配體相結(jié)合，從而阻斷B7－1和/或B7－2與T細胞表面的CD28和/或CTLA4受體的結(jié)合，起到抑制機體免疫反應的作用。
文檔編號C12N15/62GK1693465SQ20051002487
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者侯盛, 陳靜 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司