專利名稱：用于成年人的人生長激素制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于成年人的人生長激素制劑，更具體地說涉及用于生長激素缺陷型成年患者替代治療的人生長激素制劑。
人生長激素是一種不僅在正常人的生長期間而且在整個(gè)生命周期內(nèi)連續(xù)地從腦垂體分泌的一種激素。最初是從人的腦垂體提取和純化該人生長激素。該人生長激素已知存在兩種類型一種類型的分子量為約22000(下文中稱為22千道爾頓人生長激素)，另一種類型的分子量為約20000(下文中稱為20千道爾頓人生長激素)。已經(jīng)有人報(bào)道20千道爾頓人生長激素具有的促進(jìn)生長的活性等同于22千道爾頓人生長激素，但是其誘導(dǎo)葡萄糖不耐受性的活性比22千道爾頓人生長激素弱，因此其致糖尿病作用較小(Lewis U.J.，et alEndocrinol.Japan 34 73-85，1987)。因此，20千道爾頓人生長激素作為人生長激素缺陷型疾病的治療劑的效果已經(jīng)引起人們的關(guān)注((Hisao Seo，et alIgaku no Ayumi 165247-251，1993)。
盡管發(fā)展了重組DNA技術(shù)，但是生產(chǎn)20千道爾頓人生長激素仍是十分困難的，以胞內(nèi)表達(dá)方法表達(dá)的在N末端具有附加的Met的20千道爾頓人生長激素的量為22千道爾頓人生長激素表達(dá)量的二十分之一(Miyamoto，et alInternational Symposium onGRF；Growth Hormone and Somatomedin Program andAbstracts 28 1-2，1986)。在制造蛋白質(zhì)時(shí)，已知通常以胞內(nèi)表達(dá)方法在細(xì)胞內(nèi)不能準(zhǔn)確地形成較高等級(jí)的結(jié)構(gòu)，所以需要折疊過程。但是，由于與22千道爾頓人生激素不同的是，還沒有這種20千道爾頓人生長激素的國際標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品，故難以通過與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物進(jìn)行比較而對(duì)經(jīng)折疊過程獲得的結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。而且，該20千道爾頓人生長激素是高度疏水的，要對(duì)其純化也是困難的，并且實(shí)質(zhì)上不能使用分泌方法生產(chǎn)與從腦垂體衍生的20千道爾頓人生長激素有相同氨基酸序列的真正20千道爾頓人生長激素。
因此，該真正20千道爾頓人生長激素的獲得率很低是研究以其作為一種藥物的障礙(Fukashi MatsuzakiIgaku no Ayumi165 243-246，1993)。
下文中將描述該人生長激素的生物學(xué)特性，其生物學(xué)特性是其作為藥物的基礎(chǔ)一種生長激素與體內(nèi)的各種活動(dòng)相關(guān)，例如脂解，蛋白質(zhì)合成代謝和骨生成。因此，對(duì)于生長激素缺陷患者，脂解活性，胰島素樣生長因子I(下文中稱為IGF-I)分泌活性，蛋白質(zhì)合成刺激活性，骨代謝活性等均有所降低。在這些活動(dòng)中，脂解活性的降低是導(dǎo)致皮下脂肪或內(nèi)臟脂肪積累的因素之一，其導(dǎo)致明顯的肥胖。因此，對(duì)于生長激素缺陷患者，已知在許多情況下存在高血脂并發(fā)癥，并且報(bào)道循環(huán)紊亂例如動(dòng)脈硬化的發(fā)病率和心血管疾病引起的死亡率較高。還有人報(bào)道由于IGF-I與體內(nèi)各種生理活動(dòng)有關(guān)，所以因IGF-I分泌活性降低導(dǎo)致的血清IGF-I濃度降低可引發(fā)各種紊亂。此后，還有人報(bào)道蛋白質(zhì)合成刺激活性的降低可引起肌肉的強(qiáng)度和活動(dòng)能力降低，從而導(dǎo)致日?；顒?dòng)困難。
根據(jù)上面描述的事實(shí)，對(duì)于生長激素缺陷型患者，需要改善身體組分，即將體內(nèi)蛋白質(zhì)含量，體內(nèi)脂肪含量和骨密度調(diào)整到接近于正常水平。更具體地說，需要提高降低了的體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和骨密度，并降低增加了的體內(nèi)脂肪含量。降低體內(nèi)脂肪含量這里是指抑制體內(nèi)的脂肪積累，刺激體內(nèi)脂肪水解等等，因而刺激體內(nèi)脂肪水解不是降低體內(nèi)脂肪含量的唯一途徑。因此，刺激體內(nèi)脂肪水解是改善身體的組分的因素之一。
已知生長激素缺陷患者中與22千道爾頓人生長激素相關(guān)的活動(dòng)如下所述作為人生長激素缺陷患者的替代治療方法，已經(jīng)嘗試了給患者投用以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的22千道爾頓人生長激素；就上文中提到的改善體內(nèi)組分而言，有人報(bào)道在投用22千道爾頓人生長激素三年的期間內(nèi)體內(nèi)脂肪含量降低到正常水平(Jorgensen，J.OL.，et alEuropean Journal of Endocrinology 130 224-228，1994)，投用22千道爾頓人生長激素六周使血清IGF-I濃度升高到正常水平，并且提高了體內(nèi)氮含量，即體內(nèi)蛋白質(zhì)含量提高到接近正常(Bengtsson，B.A.，et alJ.Clin.Endocrinol.Metab.76 309-317，1993)。但是就生長激素缺陷患者以外的成年人而言，由于沒有進(jìn)行臨床給藥試驗(yàn)，所以尚未獲得任何資料。
另一方面，給成年人使用人生長激素往往會(huì)誘導(dǎo)葡萄糖不耐受性。事實(shí)上，有人證明給生長激素缺陷成年患者用藥，誘發(fā)了不常見的但嚴(yán)重的葡萄糖代謝異常(Beshyah，S.A.，et alEndocrinology and Metabolism(suppl.B)，32，1994)。
荻得真正20千道爾頓人生長激素是困難的。因此，迄今為止進(jìn)行的有關(guān)20千道爾頓人生長激素生理學(xué)特性的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究中，已經(jīng)使用了從腦垂體制備的純化產(chǎn)品或者由重組基因技術(shù)制備的在N末端具有甲硫氨酸的非真正重組產(chǎn)物(下文中稱為Met型20千道爾頓人生長激素)。從利用這些產(chǎn)品進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中獲得的生理學(xué)特性如下所述有報(bào)道認(rèn)為從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素的促進(jìn)生長活性相同于22千道爾頓人生長激素(Lewis，U.J.，et alJ.Biol.Chem.253 2679-2687，1978)。下述的脂肪細(xì)胞的親合力和脂解刺激活性是已知的。從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素對(duì)脂肪細(xì)胞的親合力顯著地低達(dá)22千道爾頓人生長激素的3％(De Meyts，P.，et alJ.Biol.Chem.262 11071-11079，1987)。另一方面，就脂解刺激活性而言，對(duì)于給人生長激素缺陷患者用藥是重要的，由22千道爾頓人生長激素體內(nèi)發(fā)揮的脂解刺激作用導(dǎo)致的血清中游離脂肪酸濃度提高40％，而用從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素沒有觀察到這一濃度提高(Lewis，U.J.，et 1Biochem.Biophys.Res.Commun.91778-782，1979)。此外，從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素在體外沒有脂解刺激活性(Lewis，U.J.，et alMetabolism4 237-243，1985)。
因此，通常認(rèn)為與22千道爾頓人生長激素相比，20千道爾頓人生長激素沒有或者只有較低的脂解刺激活性。該事實(shí)與預(yù)料的結(jié)果相反，從給成人用藥尤其是給生長激素缺陷成年患者用藥后其誘導(dǎo)葡萄糖不耐受性的低能力可預(yù)料20千道爾頓人生長激素具有優(yōu)點(diǎn)，因此在給人生長激素缺陷成年患者用藥后，它可能沒有產(chǎn)生上文所說的脂解刺激和對(duì)體內(nèi)組分的改善效果。
下述的血清IGF-I濃度增加活性是已知的。已知通過將生長激素結(jié)合到肝受體上可根本上從肝中釋放出血清IGF-I(″IGF-growth hormone and its related peptides″by KazuoShizume，132-136，1992)；但是已知在大鼠中和在兔中，從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素與肝受體的親合力分別是22千道爾頓人生長激素的3-12％和8-20％(Sigel，M.B.，et alEndocrinology 108 1600-1603，1981)；在人體中，已知從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激Met型20千道爾頓人生長激素對(duì)肝受體幾乎沒有親合力(Baumann，G.，et alMolecular andCellular Endocrinology73 11-14，1990)。
因此，有人提示20千道爾頓人生長激素在肝內(nèi)幾乎沒有或者只有較低的生產(chǎn)和釋放IGF-I的活性。還有報(bào)道當(dāng)給切除垂體的大鼠投用時(shí)，從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素將血清IGF-I濃度調(diào)整到類似于22千道爾頓人生長激素產(chǎn)生的濃度(Spencer，E.，et alEndocrinol.101 1301-1302，1981)。但是有人指出，在從腦垂體中純化20千道爾頓人生長激素時(shí)，由于20千道爾頓和22千道爾頓生長激素的生理化學(xué)特性類似，所以難以將20千道爾頓人生長激素與22千道爾頓人生長激素完全分離開，因此在迄今為止的實(shí)驗(yàn)中所使用的從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素都是與22千道爾頓人生長激素混合的，這樣便可能影響了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(Baumann，G.，et alMolecularand Cellular Endocrinology 73 11-14，1990)。因此，還沒有獲得基于用純化之20千道爾頓人生長激素進(jìn)行研究的足夠的知識(shí)。
如上所述，對(duì)于真正20千道爾頓人生長激素，還沒有獲得有關(guān)其改善體內(nèi)組分，刺激脂解或提高血清IGF-I濃度的知識(shí)。
本發(fā)明的主題是給成年人提供一種可有效地改善身體組分，刺激脂解和/或提高血清IGF-I濃度的人生長激素制劑來解決上述問題，因此，本發(fā)明的目的是提供用于成年人，特別是生長激素缺陷成年患者的替代治療的人生長激素，該制劑含有作為活性成分的真正20千道爾頓人生長激素并且其誘導(dǎo)葡萄糖不耐受性的活性低。
為了解決上述問題，本發(fā)明人建立了一種利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)真正20千道爾頓人生長激素的方法，制備了一種含有真正20千道爾頓人生長激素的藥物制劑并利用得到的人生長激素制劑進(jìn)行了各項(xiàng)研究。結(jié)果，本發(fā)明人新奇地發(fā)現(xiàn)真正20千道爾頓人生長激素具有改善身體組分，刺激脂解和/或提高血清IGF-I濃度的顯著活性，并進(jìn)一步證實(shí)真正的20千道爾頓人生長激素比22升道爾頓人生長激素具有較低的致糖尿病活性。
從對(duì)提取和純化自腦垂體之20千道爾頓人生長激素或者M(jìn)et型20千道爾頓人生長激素的常規(guī)知識(shí)，不能推斷出有關(guān)如此獲得之真正20千道爾頓人生長激素的上述知識(shí)。就是說，根據(jù)利用從腦垂體提取和純化的20千道爾頓人生長激素進(jìn)行的試驗(yàn)的結(jié)果不能推斷出有關(guān)真正20千爾頓人生長激素具有刺激脂解的活性(作為改善體內(nèi)組分的因素之一)的結(jié)論。此外，從有關(guān)20千道爾頓人生長激素對(duì)肝受體具有的低親合力的常規(guī)知識(shí)不易推斷出沒有22千道爾頓人生長激素之純化的真正20千道爾頓人生長激素具有類似于22千道爾頓人生長激素之提高血清IGF-I濃度能力的知識(shí)(Baumann，G.，et alMolecular and Cellular Endocrinology73 11-14，1990)。本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)上述真正20千道爾頓人生長激素具有改善身體組分、刺激脂解和提高血清IGF-I濃度的顯著活性，從而進(jìn)一步證實(shí)了20千道爾頓人生長激素作為成人藥物的用途。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與迄今報(bào)道的有關(guān)20千道爾頓人生長激素的常規(guī)知識(shí)相反，真正20千道爾頓人生長激素具有極好的改善身體組分、刺激脂解和提高血清IGF-I濃度的能力。
根據(jù)上面描述的知識(shí)，可將該制劑用作成年人的人生長激素制劑，特別是用作生長激素缺陷成年患者的替代治療藥的極好人生長激素制劑。


圖1描述了人生長激素對(duì)小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂解活性的刺激作用。空心柱沒有生長激素；十字交叉圖形柱有22千道爾頓人生長激素；實(shí)心柱有真正20千道爾頓人生長激素。
圖2描述了人生長激素對(duì)大鼠附睪脂肪的脂肪組織中脂解活性的刺激作用?？招闹鶝]有生長激素；十字交叉圖形柱有22千道爾頓人生長激素；實(shí)心柱有真正20千道爾頓人生長激素。
圖3描述了人生長激素對(duì)切除垂體的大鼠之脂解活性的刺激作用?？招闹鶎?duì)照；十字交叉圖形柱有22千道爾頓人生長激素；實(shí)心柱有真正20千道爾頓人生長激素。
圖4描述了人生長激素對(duì)C57BL/6J-ob/ob小鼠身體內(nèi)組分的改善活性。十字交叉圖形柱有22千道爾頓人生長激素；實(shí)心柱有真正20千道爾頓人生長激素。
圖5描述了人生長激素對(duì)切除垂體的大鼠的提高血清IGF-I濃度的活性?？招闹鶝]有生長激素；十字交叉圖形柱有22千道爾頓人生長激素；實(shí)心柱有真正的20千道爾頓人生長激素。
圖6描述了20千道爾頓人生長激素和22千道爾頓人生長激素在C57BL/6J-ob/ob小鼠中的葡萄耐受性。記號(hào)為■對(duì)照；▲22千道爾頓人生長激素；和●真正20千道爾頓人生長激素。
本發(fā)明提供了用于成年人的人生長激素制劑，它含有作為有效成分的真正20千道爾頓人生長激素。
該用于成年人的人生長激素制劑含有作為主要成分的真正20千道爾頓人生長激素。
真正20千道爾頓人生長激素是指具有分子量為約20000并且沒有連接到N末端上之Met的人生長激素。對(duì)于真正20千道爾頓人生長激素，已經(jīng)報(bào)道了兩種類型，其中分別為從N末端起第14位氨基酸分別為Met和Ser。即Martial等人(Martial，J.A.，et alScience 205 602，1979)報(bào)道了編碼從N末端起第14位氨基酸的mRNA序列是AUG(編碼Met)，Masuda等人(Masuda，N.，et alBiophysica Acta 949 125，1988)報(bào)道了，編碼從N末端起第14位氨基酸的cDNA序列是AGT(編碼Ser)。這兩種類型的氨基酸序列如下SEQ ID NO1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr35 40 45Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu50 55 60Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val65 70 75Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala80 85 90Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly95 100 105Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr110 115 120Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser125 130 135His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys140 145 150Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val155 160 165Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe170 175SEQ ID NO2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr35 40 45Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu50 55 60Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val65 70 75Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala80 85 90Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly95 100 105Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr110 115 120Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser125 130 135His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys140 145 150Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val155 160 165Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe170 175
兩種類型均可用于本發(fā)明的激素制劑中。此外，應(yīng)該明白其氨基酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸被取代，丟失，插入或者缺失得到的氨基酸序列都落在本發(fā)明所說的真正20千道爾頓人生長激素的范圍內(nèi)。
在制備本發(fā)明的藥物制劑時(shí)，可使用通常用于藥物制劑中的添加劑、醫(yī)藥上可接受的溶劑等。
可將真正20千道爾頓人生長激素與藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑結(jié)合以制備本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明的藥物組合物中可以含有有效量的真正20千道爾頓人生長激素，例如含有0.1-99％重量，較好0.5-20％重量的真正20千道爾頓人生長激素。
本發(fā)明的藥物組合物可以以含有合適的載體和/或稀釋劑的冷凍或凍干的形式提供。
本發(fā)明的藥物組合物可以以用生長激素進(jìn)行治療的常規(guī)方法給藥。例如采用皮下注射或肌內(nèi)注射方式給藥。
也可以使用常規(guī)方法使用的載體和稀釋劑。例如可將有效成分加到注射用水中，加或不加合適的添加劑，以制備含水的注射液。
用于成年人的真正20千道爾頓人生長激素的劑量依據(jù)不同的病例而定。例如以每公斤體重0.005-5mg，較好0.015-1.5mg真正20千道爾頓人生長激素的劑量，1周重復(fù)用藥幾次。
實(shí)施例借助下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述；但是本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1真正20千道爾頓人生長激素的制備在含有0.5％甘油的濃縮2倍的LB培養(yǎng)基中接種大腸桿菌轉(zhuǎn)化體MT-10765(根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定該菌株寄存于the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology of theAgency of Industrial Science&Technology of theMinistry of International Trade and Industry 1-3，Higashi 1-chome，Tukuba-shi，Ibaraki-ken，305，Japan，寄存號(hào)為FERM BP-5020)并且在28℃培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)之后收集細(xì)胞并且采用滲透休克方法從溶液中獲得含有真正20千道爾頓人生長激素的周質(zhì)組分。經(jīng)離子交換層析和凝膠過濾層析對(duì)該組分進(jìn)行純化，將得到的具有SEQ ID NO1之氨基酸序列的真正20千道爾頓人生長激素溶于磷酸鹽緩沖液中。由反相HPLC和SDS-PAGE分析證實(shí)其純度為99.9％。將其冷凍貯存。實(shí)施例2用于成年人替代治療的人生長激素制劑的制備向?qū)嵤├?中獲得的1.4mg真正20千道爾頓人生長激素中加入2.4mg D-甘露醇。將該混合物冷凍貯存并用于制造對(duì)成年人替代治療的生長激素制劑。實(shí)施例3在小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中研究真正20千道爾頓人生長激素的脂解刺激活性。
將含有10％牛血清的Dulbecco′s改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)分散于24孔多孔平板的各個(gè)孔中。將小鼠3T3-L1成纖維細(xì)胞(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)接種于各個(gè)孔中并且培養(yǎng)直到融合，然后再培養(yǎng)2天。將培養(yǎng)完成那一天作為分化誘導(dǎo)的0天。用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基替代上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，所說分化培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清(FCS)、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.25μM地塞米松、172nM胰島素的DMEM。在分化誘導(dǎo)的第二天將培養(yǎng)基換成含有10％FCS和172nM胰島素的DMEM培養(yǎng)基，然后在分化誘導(dǎo)的第4天再換成含有10％FCS的DMEM。在分化誘導(dǎo)的第6或7天，換成在分化誘導(dǎo)的第4天使用的相同培養(yǎng)基以及小鼠3T3-L1成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞。在上面所說的培養(yǎng)過程中，向所有的培養(yǎng)基中加入50U的青霉素和50μg/ml的鏈霉素以便防止污染，并在37℃、5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。
在分化誘導(dǎo)的第8或9天，當(dāng)成纖維細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞時(shí)，用含有2％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM替換原培養(yǎng)基以便排除血清的影響。然后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
除去由此獲得的脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基，并且將含有4％BSA、2mM葡萄糖和40mM地塞米松的Krebs-Ringer緩沖液(1.2mM KH2PO4，4.7mM KCL，118mM NaCL，25mM NaHCO3，2.5mM CaCl2，pH7.4)以750μl/孔的濃度分散到多孔平板的每個(gè)孔中。向由此制備的孔中加入濃度為0、0.1、0.5、1、10、100ng/ml的實(shí)施例1中制備的真正20千道爾頓人生長激素或22千道爾頓人生長激素(Genotropin，Sumitomo Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后在37℃，5％CO2氣體環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)。
用NEFA C-Test Wako(Wako Pure Chemical IndustriesLtd.)檢測釋放到培養(yǎng)基中的游離脂肪酸的量，它的量是脂解作用的指標(biāo)之一。
對(duì)于生長激素的每個(gè)濃度設(shè)置四個(gè)相同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行脂解刺激試驗(yàn)。以油酸的當(dāng)量值計(jì)算檢測到的數(shù)據(jù)。
結(jié)果顯示于圖1中。在0.5ng/ml或者更高的濃度時(shí)，真正20千道爾頓人生長激素顯示出顯著的脂解刺激活性，在作為成年人特別是生長激素缺陷的成年患者的替代治療藥具有顯著的臨床效果的濃度下其脂解刺激活性相當(dāng)于或者高于22千道爾頓人生長激素。實(shí)施例4在來源于大鼠內(nèi)臟脂肪的脂肪組織中研究真正20千道爾頓人生長激素的脂解刺激活性。
將六周齡雄性SlcSD大鼠無痛苦處死，從該動(dòng)物體內(nèi)切除內(nèi)臟脂肪的脂肪組織。將10ml含有4％BSA，255nM地塞米松，5.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液(pH7.4)分散到100mm直徑的平皿中，并且向每個(gè)平皿中加入15片重量各為30-50mg的切除的脂肪碎片。向如此制備的平皿中加入濃度為0、1、10、100、1000和2500ng/ml的實(shí)施例1中生產(chǎn)的真正20千道爾頓人生長激素或者22千道爾頓人生長激素(Genotropin，Sumitomo PharmaceuticalCo.，Ltd.)，在37℃，5％CO2環(huán)境下保溫4小時(shí)。在該預(yù)保溫完成之后，將其組分相同于預(yù)保溫步驟中使用的培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)基各1ml分散到24孔多孔平板的每個(gè)孔中，向每個(gè)孔內(nèi)移入一片脂肪組織碎片。然后在相同于預(yù)保溫的條件下保溫5小時(shí)。
利用F-kit甘油(Boehringer Mannheim)檢測釋放到保溫培養(yǎng)基中的甘油量，它的量是脂解作用的指標(biāo)之一。
對(duì)于每個(gè)生長激素濃度利用15片脂肪完成該脂解刺激試驗(yàn)。測量結(jié)果以每片組織(重量)的摩爾濃度來表示。
結(jié)果顯示于圖2中。真正20千道爾頓人生長激素在濃度為1ng/ml或更高時(shí)具有顯著的脂解刺激活性，在作為成人特別是生長激素缺陷的成年患者的替代治療劑具有顯著臨床效果的濃度下其脂解刺激活性相當(dāng)于或者高于22千道爾頓人生長激素。實(shí)施例5在切除垂體的大鼠中研究真正20千道爾頓人生長激素的脂解刺激活性將4周齡雄性SlcSD大鼠的垂體切除，喂養(yǎng)至6周齡，然后空腹過夜。以50或100μg/大鼠的量將實(shí)施例1中制備的真正20千道爾頓人生長激素或者22千道爾頓人生長激素(Genotroppin，Sumitomo Pharmaceutiacl Co.，Ltd.)經(jīng)腹腔內(nèi)途徑注射到這些動(dòng)物體內(nèi)。用鹽水代替生長激素注射對(duì)照動(dòng)物。在生長激素(或者鹽水)給藥后5小時(shí)從頸靜脈取血，利用NEFA C-Test Wako(WakoPure Chemical Industries Ltd.)檢測血清游離脂肪酸濃度。
以6只切除垂體的大鼠為一組完成該試驗(yàn)。檢測結(jié)果根據(jù)油酸的當(dāng)量數(shù)計(jì)算得到。
結(jié)果顯示于圖3中。投用真正20千道爾頓人生長激素與投用22千道爾頓人生長激素相比，由于體脂水解作用而顯著地增加了血清游離脂肪酸濃度。因此，可以證明在體內(nèi)真正20千道爾頓人生長激素基本上具有等同于22千道爾頓人生長激素的脂解刺激活性，這種刺激活性是對(duì)成年人，尤其是有生長缺陷的成年患者進(jìn)行替代治療所必需的。實(shí)施例6在C57BL/6J-ob/ob小鼠中研究真正20千道爾頓人生長激素的身體組分改善活性。
以500μg/小鼠/天的劑量將實(shí)施例1制備的真正20千道爾頓人生長激素或22千道爾頓人生長激素(Genotropin，SumitomoPharmaceutical Co.，Ltd.，)在背部皮下注射到6周齡雌性C57BL/6J-ob/ob小鼠體內(nèi)，共給藥10天。給對(duì)照動(dòng)物注射鹽水。在試驗(yàn)的最后一天稱體重之后將每只動(dòng)物無痛苦處死，冷凍干燥，然后加水制成勻漿，得到總共200ml的勻漿液。用該勻漿完成下面的檢測。1.身體含水量的檢測將上面所說的勻漿的一部分冷凍干燥，測出其干重量，從其測量結(jié)果推斷出總的干體重。根據(jù)前面得的體重和如此測得的干體之間的差計(jì)算出每只動(dòng)物的身體含水量。2.身體蛋白質(zhì)的測定用1N NaOH溶液將1ml上面所說的勻漿稀釋100倍，將得到的懸液用1N HCl溶液中和。為了去除脂肪，將該懸液1ml與1ml的CHCL3混合10分鐘，將混合物靜止10分鐘，得到無脂肪的水層。采用Lowry方法和標(biāo)準(zhǔn)BSA檢測該水層的蛋白質(zhì)濃度，并從檢測結(jié)果計(jì)算出身體總蛋白質(zhì)。3.脂肪的測量將200μl的250mg/ml KCl溶液和7.5ml甲醇加到5ml的上面所說的勻漿中，并振蕩該混合物。然后加入3.75ml CHCL3，利用振蕩器將該混合物振蕩10分鐘。將該混合物靜止10分鐘，然后加入另外的3.75ml CHCL3并振蕩30秒，然后加入3.75ml的20mg/mlKCl溶液再振蕩30秒。將得到的混合物以3000g離心10分鐘，然后將CHCl3層移到帶螺絲冒蓋的試管中并在40℃氮?dú)饬飨聺饪s之。接著，加入CHCl3∶甲醇(＝2∶1)溶液制得8ml混合物，加入1.6ml的8.8mg/ml KCl溶液，將得到的混合物振蕩10分鐘。然后以3000g將混合物離心10分鐘并將CHCl3層移到已經(jīng)稱重的玻璃試管中，在氮?dú)饬飨聺饪s以測定脂肪含量。從測量結(jié)果計(jì)算出整個(gè)軀體的脂肪含量。
結(jié)果顯示用真正20千道爾頓人生長激素和22千道爾頓人生長激素可同樣使軀體蛋白質(zhì)增加。
此外，計(jì)算如上測得的身體水分、身體蛋白質(zhì)和身體脂肪總含量，并計(jì)算出身體脂肪占總體重的百分?jǐn)?shù)。將投用生長激素前后得到的值進(jìn)行比較。
以7只小鼠為一組完成該試驗(yàn)。
結(jié)果顯示圖4中。已經(jīng)證明真正20千道爾頓人生長激素的體脂肪降低刺激活性相當(dāng)于或者高于22千道爾頓人生長激素，表明真正20千道爾頓人生長激素具有的改善身體組分的顯著作用，相當(dāng)于或者高于22千道爾頓人生長激素。這些結(jié)果證明真正20千道爾頓人生長激素基本上具有等同于22千道爾頓人生長激素的身體組分改善活性，這種活性對(duì)成年人，尤其是有生長缺陷的成年患者進(jìn)行替代治療所必需的。實(shí)施例7在切除垂體的大鼠中研究真正20千道爾頓人生長激素的血清IGF-I濃度提高活性。
切除4周齡雄性SicSD大鼠的垂體，將這些動(dòng)物喂養(yǎng)至6周齡，然后在動(dòng)物的頸后部皮下注射10或50μg/大鼠/天劑量的實(shí)施例1中生產(chǎn)的真正20千道爾頓人生長激素或22千道爾頓人生長激素(Genotropin，Sumitomo Pharmaceutical Co.，Ltd.，)，共注射10天。給對(duì)照組動(dòng)物注射鹽水。最后一次注射生長激素(或者鹽水)之后3小時(shí)從背靜脈取血，用Somatomedin-C EIKEN II(Eiken Chemical Co.，Ltd.)檢測血清IGF-I含量。
用每組6只切除垂體的大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。
結(jié)果顯示于圖5中。使用真正20千道爾頓人生長激素增加血清IGF-I含量相同于使用22千道爾頓人生長激素。因此可以證明真正20千道爾頓人生長激素基本上具有等同于22千道爾頓人生長激素的IGF-I濃度提高活性，這種活性是對(duì)成年人，尤其是有生長缺陷的成年患者進(jìn)行替代治療所必需的。實(shí)施例8在C57BL/6J-ob/ob小鼠中研究真正20千道爾頓人生長激素的葡萄糖耐受性。以500μg/小鼠/天的劑量將實(shí)施例1制備的真正20千道爾頓人生長激素或22千道爾頓人生長激素(Genotropin，Sumitomo Pharmaceutical Co.，Ltd.，)在背部皮下注射到6周齡雌性C57BL/6J-ob/ob小鼠體內(nèi)，共給藥3或10天。給對(duì)照組動(dòng)物注射鹽水。在最后一次注射生長激素(或鹽水)之后的那一天，于背部皮下注射2μg的地塞米松-21-磷酸鹽。停食6小時(shí)之后，給小鼠腹腔內(nèi)注射葡萄糖(1g/kg體重)。注射之前(0分鐘)和葡萄糖注射后30、60和90分鐘從眼窩的血管叢取血，采用New BloodSugar Test(Boehringer Mannheim)檢測血液葡萄糖濃度。以6只小鼠為一組完成試驗(yàn)。
結(jié)果顯示于圖6中。給動(dòng)物投用22千道爾頓人生長激素后，觀察到葡萄糖耐受性；就是說，葡萄糖注射后血液葡萄糖濃度保持在高于對(duì)照組動(dòng)物的水平以上。相反，如果使用20千道爾頓人生長激素，葡萄糖注射后30分鐘血液葡萄糖濃度與對(duì)照動(dòng)物相同，從而表明，沒有葡萄糖耐受性。此外，使用20千道爾頓人生長激素，其空腹的血液葡萄糖濃度正常，而此時(shí)對(duì)于投用22千道爾頓人生長激素的動(dòng)物已經(jīng)觀察到血液葡萄糖濃度增加。這些結(jié)果證明22千道爾頓人生長激素是致糖尿病的，而20千道爾頓人生長激素是不致糖尿病的。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)藥組合物，它含有作為有效成分的真正20千道爾頓人生長激素和藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醫(yī)藥組合物，其中真正20千道爾頓人生長激素具有SEQ ID NO1或者SEQ ID NO2的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醫(yī)藥組合物，用于改善成年人的身體組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所說的醫(yī)藥組合物，用于有生長激素缺陷的成年患者。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醫(yī)藥組合物，用于刺激成年人的脂解作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所說的醫(yī)藥組合物，用于有生長激素缺陷的型成年患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醫(yī)藥組合物，用于提高成年人的血清胰島素樣生長因子I水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所說的醫(yī)藥組合物，用于有生長激素缺陷的成年患者。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所說的醫(yī)藥組合物，作于成年人的替代治療。
10.一種生長激素替代治療方法，其特征在于給有生長激素缺陷的患者投用有效量的真正20千道爾頓人生長激素。
11.一種用于改善成年人身體組分的方法，其特征在于給成年人投用有效量的真正20千道爾頓人生長激素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所說的方法，其中成年人是生長激素缺陷患者。
13.一種用于刺激成年人脂解作用的方法，其特征在于給成人使用有效量的真正20千道爾頓人生長激素。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所說的方法，其中成年人是有生長激素缺陷的患者。
15.一種用于提高成年人的血清胰島素樣生長因子I的方法，其特征在于給成年人使用有效量的真正20千道爾頓人生長激素。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所說的方法，其中成年人是有生長激素缺陷的患者。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)所說的方法，其中真正20千道爾頓人生長激素具有SEQ ID NO1或者SEQ ID NO2的氨基酸序列。
18.真正20千道爾頓人生長激素用于制造藥物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中該藥物是用于改善成年人的身體組分。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其用于有生長激素缺陷的成年患者。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中該藥物用于刺激成人體內(nèi)脂解作用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中該藥物用于有生長激素缺陷的成年患者。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中該藥物用于提高成年人的血清胰島素樣生長因子I水平。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中該藥物用于有生長激素缺陷的成年患者。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中該藥物是用于成年人的替代治療。
26.根據(jù)權(quán)利要求18-25中任一項(xiàng)所說的真正20千道爾頓人生長激素的應(yīng)用，其中真正20千道爾頓人生長激素具有SEQ ID NO1或者SEQ ID NO2的氨基酸序列。
全文摘要
給成年人投用有效量的分子量為20000道爾頓的真正人生長激素可以改善身體組分，刺激脂解，提高血清胰島素樣生長因子I或者用于人生長激素缺陷患者的替代治療。
文檔編號(hào)C07K14/61GK1145808SQ9611098
公開日1997年3月26日 申請(qǐng)日期1996年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月29日
發(fā)明者淺田典明, 池田美和, 本城勝, 堀込和利, 神岡健 申請(qǐng)人:三井東壓化學(xué)株式會(huì)社