專(zhuān)利名稱：氧化脅迫抗性的雙歧桿菌的制作方法
氧化脅迫抗性的雙歧桿菌本發(fā)明一般地涉及雙歧桿菌領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及雙歧桿菌領(lǐng)域，所述雙歧桿菌具有對(duì)H2O2改進(jìn)的抗性。益生菌因?yàn)樗鼈兇龠M(jìn)健康的性質(zhì)而被選擇。由于益生菌作為活的生物發(fā)揮它們的益處(Guarner, F.和 G. J. Schaafsma. 1998. " Probiotics " . Int. J. Food Microbiol. 39 237-238)，所述細(xì)菌應(yīng)該在胃腸道條件下存活。在工業(yè)應(yīng)用中，大規(guī)模的生產(chǎn)需要益生菌耐受食品加工和貯存的額外的能力。這些生產(chǎn)步驟以不同的脅迫為特征，所述脅迫危害所述細(xì)菌的良好存活。在它們中間，高或者低溫、高的滲透壓、氧化和濕度可能是關(guān)鍵的因素。特別地，已知益生菌的一些種類(lèi)具有對(duì)不利的溫度、氧或者噴霧干燥的耐受性。具有差的脅迫耐受性的此類(lèi)益生菌的突出的實(shí)例是例如雙歧桿菌，特別是長(zhǎng)雙歧桿菌(Simpson, P. J. , C. Stanton, G. F. Fitzgerald,和 R. P. Ross. 2005. " Intrinsic tolerance of Bifidobacterium species to heat and oxygen and survival following spraydrying and storage" . J. AppI. Microbiol. 99 :493-501)。特別地，雙歧桿菌的厭氧性質(zhì)需要定制的發(fā)酵條件來(lái)促進(jìn)大規(guī)模生產(chǎn)，并且通常需要額外的努力來(lái)保持在加工和貯存中細(xì)胞的活性。在細(xì)菌界中存在對(duì)氧的耐受性的非常大的區(qū)別。厭氧細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化了精巧的防御系統(tǒng)來(lái)保護(hù)它們自身免于活性氧類(lèi)別(ROS)引起的損害。然而，即使對(duì)于這些細(xì)菌，當(dāng)這些防御系統(tǒng)受到損傷時(shí)，氧可以是有毒性的。主要可以形成三種不同的活性氧類(lèi)別(ROS)，其取決于氧接受一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)電子從而分別形成⑴超氧化物自由基(02_)，(ii)過(guò)氧化氫(H2O2)或者(iii)輕基自由基(.OH.) (Imlay, J. A. , 2002, Advances in MicrobialPhysiology, Vol 4646:111-153·)。H2O2引起DNA損傷和蛋白質(zhì)的氧化。細(xì)菌可以使用一些酶來(lái)消除這種R0S，所述酶包括過(guò)氧化氫酶、NADH過(guò)氧化物酶和還原酶。為處理該問(wèn)題和增加食品生產(chǎn)中益生菌的存活率，目前使用了一些方法，其包括微囊化、保護(hù)劑的添加、不透氧的包裝以及生長(zhǎng)或者加工條件的改進(jìn)。然而，這些方法是復(fù)雜的并且施行起來(lái)是費(fèi)勁的，同時(shí)通常需要添加其他的化合物，所述化合物可能具有副作用并且其在最終產(chǎn)品中可能是不想要的。因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的這些問(wèn)題和為本領(lǐng)域提供益生性雙歧桿菌，并且提供增加組合物中存活的益生菌的數(shù)目的方法，所述益生性雙歧桿菌顯示出對(duì)氧化脅迫改進(jìn)的抗性和/或改進(jìn)的氧耐受性。通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求I的雙歧桿菌,根據(jù)權(quán)利要求2的組合物和根據(jù)權(quán)利要求8的用途解決了本發(fā)明的目的。本發(fā)明人應(yīng)用自然篩選方法并且已經(jīng)尋找到了雙歧桿菌菌株，其具有對(duì)活性氧類(lèi)別例如H2O2增加的抗性。一種典型的益生菌是長(zhǎng)雙歧桿菌。本發(fā)明人能鑒定和分離長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916，其允許實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916-通過(guò)自然篩選得到的長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705的衍生物-與現(xiàn)有技術(shù)的雙歧桿菌相比令人驚奇地顯示改進(jìn)的氧耐受性。通過(guò)自然篩選得到的菌株具有解決本發(fā)明的目的而沒(méi)有通過(guò)基因技術(shù)被修飾的優(yōu)點(diǎn)。特別 地，長(zhǎng)雙歧桿菌菌株NCC2916顯示對(duì)H2O2改進(jìn)的抗性。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916。按照布達(dá)佩斯條約將長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916保藏在CNCM中；巴斯德研究所，25 ；Ruedu Docteur Roux ;F_75724 Paris Cedex 15，保藏號(hào) CNCM 1-4053。本發(fā)明也涉及包含長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916的組合物。為了本發(fā)明的目的，如果組合物包含存活的或者非復(fù)制的長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916細(xì)胞、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916的任何細(xì)菌碎片、包含長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916培養(yǎng)物的任何級(jí)分、和/或用于培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916的培養(yǎng)基或者它的一部分,則該組合物被認(rèn)為包含長(zhǎng)雙歧桿菌 NCC2916。益生性雙歧桿菌，當(dāng)施用時(shí)賦予宿主健康益處。雙歧桿菌的健康益處是多方面的并且包括幫助消化、伴隨著變態(tài)反應(yīng)較低的發(fā)生率、腫瘤生長(zhǎng)的一些形式的預(yù)防和體重管理。因此，本發(fā)明的組合物和/或長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916可賦予受試者這些健康益處。本發(fā)明的組合物可以是任何組合物，但優(yōu)選地是食品、動(dòng)物食品或者藥物組合物。例如，組合物可以是營(yíng)養(yǎng)組合物、營(yíng)養(yǎng)藥品、飲料、食品添加劑或者藥物。優(yōu)選的，預(yù)期將組合物用于人、寵物或者家畜，而寵物或者家畜可以選自狗、貓、豚鼠、兔子、豬、牛、綿羊、山羊、馬和/或家禽。組合物可以包含至少一種糖類(lèi)來(lái)源、至少一種脂類(lèi)來(lái)源和/或至少一種蛋白質(zhì)來(lái)源。任何適合的膳食蛋白質(zhì)可以用作蛋白質(zhì)來(lái)源，例如動(dòng)物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)、植物蛋白(如大豆蛋白、小麥蛋白、稻蛋白和豌豆蛋白)、游離氨基酸的混合物、或者所述物質(zhì)的組合。特別優(yōu)選地是乳蛋白如酪蛋白和乳清以及大豆蛋白。蛋白質(zhì)可以是完整的或者水解的或者是完整的和水解的蛋白質(zhì)的混合物。期望供應(yīng)部分水解的蛋白質(zhì)(水解程度在2至20%之間)，例如用于被認(rèn)為處于發(fā)生牛奶變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)中的動(dòng)物。如果需要水解的蛋白質(zhì)，水解方法可以按照所希望的進(jìn)行并且其在本領(lǐng)域是已知的。例如，可以通過(guò)一個(gè)或者多個(gè)步驟中酶促水解乳清級(jí)分制備乳清蛋白水解產(chǎn)物。如果用作原料的乳清級(jí)分是基本上無(wú)乳糖的，發(fā)現(xiàn)在水解過(guò)程中此蛋白質(zhì)遭受更少的賴氨酸障礙。這使賴氨酸障礙的程度從按總賴氨酸重量計(jì)約15%減少到少于按賴氨酸重量計(jì)的約10%，例如按賴氨酸重量計(jì)的約7%，其大大改進(jìn)了蛋白質(zhì)來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。如果組合物包括脂肪來(lái)源，優(yōu)選地脂肪來(lái)源提供5%至40%的組合物的能量，例如提供20%至30%的能量。使用油菜籽油、玉米油和高油酸向日葵油的混合物可以得到適合的脂肪譜。糖類(lèi)來(lái)源優(yōu)選地提供40%至80%的組合物能量?？梢允褂萌魏芜m合的糖類(lèi)，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體、麥芽糖糊精和所述物質(zhì)的混合物。如果期望也可以加入膳食纖維。膳食纖維通過(guò)小腸時(shí)不被酶消化并且行使天然填充劑和緩瀉藥的功能。膳食纖維可以是可溶的或者不可溶的并且優(yōu)選地一般是兩種類(lèi)型的混合物。膳食纖維的適合來(lái)源包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、阿拉伯樹(shù)膠、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液酰乳糖和源于動(dòng)物乳的寡糖。優(yōu)選的纖維混合物是菊粉和更短鏈的低聚果糖的混合物。優(yōu)選地，如果纖維存在，纖維含量在2至40g/l消費(fèi)的組合物之間，更優(yōu)選地在4至10g/l消費(fèi)的組合物之間。組合物也可以包含礦物質(zhì)和微量營(yíng)養(yǎng)物，如根據(jù)政府機(jī)構(gòu)如USRDA推薦的微量兀素和維生素。例如，組合物可以包含每日劑量以下微量營(yíng)養(yǎng)物的ー種或者多種|丐、鎂、磷、鉄、鋅、銅、碘、硒、維生素C、維生素BI、維生素B6、維生素B2、煙酸、維生素B12、葉酸、生物素、維生素D、維生素E。如果期望，可以將ー種或者多種食品級(jí)乳化劑摻入到組合物中；例如ニこ酰酒石酸脂類(lèi)或甘油一酯和ニ酷、卵磷脂和甘油一酯和ニ酷。也可以包括相似的合適的鹽類(lèi)和穩(wěn)定劑。可預(yù)期組合物用于ロ服、腸胃外或者局部施用。ロ服應(yīng)用包括用于本發(fā)明目的的 腸道施用。組合物可以包含至少ー種其他類(lèi)型的其他食品級(jí)細(xì)菌?！笆称芳?jí)細(xì)菌”指的是使用的細(xì)菌并且一般認(rèn)為該細(xì)菌用于食品中是安全的。食品級(jí)細(xì)菌可以選自乳酸細(xì)菌和/或雙歧桿菌。優(yōu)選的是益生菌?！耙嫔敝傅氖俏⑸锛?xì)胞制劑或者微生物細(xì)胞組分，其對(duì)宿主的健康和幸福具有有益的效果(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al “Probiotics how should they be defined” Trends Food Sci. Technol. 1999 :10107-10)。組合物可以進(jìn)一歩的包含至少ー種益生元。“益生元”指的是食物物質(zhì)，預(yù)期其能促進(jìn)腸中益生菌的生長(zhǎng)。例如Glenn R. Gibson和Marcel B. Roberfroid, DietaryModulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept ofPrebiotics7J. Nutr. 1995125 :1401-1412中定義了益生元。益生元可選自寡糖并且任選地包含果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纖維。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)ー步地包含保護(hù)性的水膠體(如樹(shù)膠、蛋白質(zhì)、改性淀粉)、粘合劑、成膜劑、包膠劑/物質(zhì)、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、載體、填充劑、輔助化合物、分散劑、潤(rùn)濕劑、加工助劑(溶剤)、流動(dòng)劑、掩味劑、增重劑、成凝膠劑、凝膠形成劑、抗氧化劑和抗微生物劑。組合物也可以包含常規(guī)的藥物添加劑和佐劑、賦形劑和稀釋劑，其包括但不限于水、任何來(lái)源的明膠、植物膠、木質(zhì)素磺酸鹽、滑石、糖、淀粉、阿拉伯膠、植物油、聚亞烷基ニ醇、增香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、潤(rùn)濕劑、填充劑等等。在所有的情況下，將考慮它們對(duì)預(yù)期的接受者的適合性來(lái)選擇這種其他的成分。本發(fā)明的組合物可以包含根據(jù)本發(fā)明的任何數(shù)目的雙歧桿菌。原則上，到達(dá)腸并且能形成菌落的単一的雙歧桿菌足夠產(chǎn)生對(duì)宿主的有益效果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚理想的劑量將取決于待治療的受試者、例如它的健康狀況、性別、年齡或者體重。因此理想的使用劑量將是不同的，但是可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易的確定。然而，一般，優(yōu)選本發(fā)明的組合物包含每日劑量IO3至IO1tlCfu之間和/或IO3至101°之間細(xì)胞的長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916。它也可以在每克干重組合物中包含IO3至IO12Cfu之間和/或IO3至IO12之間細(xì)胞的長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916。本發(fā)明也涉及長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916在增加產(chǎn)品中活的益生菌，例如長(zhǎng)雙歧桿菌的數(shù)目中的用途。相似地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物在增加產(chǎn)品中活的益生菌，例如長(zhǎng)雙歧桿菌的數(shù)目中的用途。本發(fā)明的用途也用于在暴露與益生菌的脅迫后增加產(chǎn)品中益生菌，特別是雙歧桿菌的數(shù)目。脅迫可以是暴露至氧化類(lèi)別，例如在200ppm的濃度下，例如持續(xù)30秒至2小時(shí)。氧化類(lèi)別沒(méi)有特別的限制。非常常見(jiàn)的活性氧類(lèi)別包括例如·02_，超氧陰離子、H2O2,過(guò)氧化氫、· 0Η,輕基自由基、R00H,有機(jī)氫過(guò)氧化物、RO ·,燒氧基自由基、ROO ·,過(guò)氧自由基、HOCl，次氯酸、00Ν0-,過(guò)氧亞硝酸鹽和/或NO ·。優(yōu)選地，活性氧類(lèi)別選自H2O2, · O2—、· OH和它們的組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解他們可以自由組合本文描述的本發(fā)明的所有特征而不用背離公開(kāi)的本發(fā)明的范圍。特別地，為本發(fā)明用途描述的特征可以應(yīng)用到本發(fā)明的組合物中并且反之亦然。 本發(fā)明其他的優(yōu)點(diǎn)和特征在以下的實(shí)施例和附圖
中是顯而易見(jiàn)的。圖I顯示16小時(shí)過(guò)夜培養(yǎng)物在200ppm H2O2中4小時(shí)后的存活細(xì)胞計(jì)數(shù)。NCC2916(白色條形)和野生型NCC2705(黑色條形)。P-值指的是用野生型進(jìn)行的t_檢驗(yàn)。實(shí)施例I :NCC2916的鑒定和分離將約IO11Cfu的NCC2705在IOml 40ppm H2O2中重懸浮80分鐘。隨后將Iml體積的細(xì)胞懸浮液接種到MRS瓊脂上。將48小時(shí)內(nèi)可見(jiàn)的菌落在MRS肉湯中過(guò)夜(16小時(shí))傳代培養(yǎng)2次并且將其冷凍于_80°C以用于進(jìn)ー步的分析。為比較野生型細(xì)胞和新的變體NCC2916對(duì)H2O2的抗性，以相同的細(xì)胞密度解凍來(lái)自野生型和變體培養(yǎng)物的冷凍的細(xì)胞樣品(16小時(shí)過(guò)夜培養(yǎng)物)并且離心000g，2分鐘，在室溫下)Iml的整分試樣。將沉淀在IOml 200ppm H2O2溶液中重懸浮。4小時(shí)后用緩沖液稀釋并接種細(xì)胞懸浮液。48小時(shí)后測(cè)定菌落計(jì)數(shù)。該測(cè)試以一式三份進(jìn)行(圖I)。NCC2916的H2O2的耐受性在至少70代內(nèi)是穩(wěn)定的。
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2916。
2.組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求I的雙歧桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其特征在于所述組合物是食品、動(dòng)物食品或者藥物組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2至3的一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述組合物還包含至少一種益生J Li ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于所述益生元選自寡糖并且任選地包含果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纖維。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5的一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述組合物包含每日劑量在IO3至IOiciCfu之間和/或IO3至101°之間細(xì)胞的雙歧桿菌NCC2916。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5的一項(xiàng)的組合物，其特征在于所述組合物包含每克干重的食物組合物中IO3至IO12Cfu之間和/或IO3至IO12之間細(xì)胞的雙歧桿菌NCC2916。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的雙歧桿菌或者根據(jù)權(quán)利要求I至7的組合物的用途，用于增加產(chǎn)品中活的益生菌的數(shù)目。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，用于在產(chǎn)品中益生菌暴露于脅迫后增加益生菌的數(shù)目。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述脅迫是暴露于200ppm濃度下的氧化類(lèi)別30秒至2小時(shí)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述氧化類(lèi)別選自H202、·02_、· OH和它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及雙歧桿菌領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及具有對(duì)氧化脅迫改進(jìn)的抗性的雙歧桿菌領(lǐng)域。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出一種雙歧桿菌，其顯示例如改進(jìn)的H202抗性。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102741392SQ201080030061
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者B·博格, C·拉克魯瓦, E·雷佐尼科, F·C·阿里戈尼, F·格拉特龐什, V·莫澤蒂 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司