一種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及煙草去毒代謝途徑關(guān)鍵基因煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因NtGSTU17在煙 用農(nóng)藥脫毒及農(nóng)藥安全劑篩選上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GlutathioneTransferase，GSTs)是自然界多樣性最為豐富的 蛋白酶之一。GSTs具有多種催化活性：可以將還原性谷胱甘肽（GSH)共價偶聯(lián)到含有親電 子碳、氮、硫原子的非極性化合物上，從而使GSTs做為中心元件參與到藥物、農(nóng)藥及其它異 源物質(zhì)的去毒代謝過程；GSTs還可以催化還原一些氧化脅迫的代謝產(chǎn)物，如過氧化物等， 從而使得GSTs在防御病菌侵染和非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用。植物體內(nèi)的谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶研究始于Fear在1970年對玉米抗除草劑阿特拉津GSTs的研究，此后在高梁、甘蔗、 大豆、豌豆、煙草等作物體內(nèi)也相繼發(fā)現(xiàn)了GSTs活性?，F(xiàn)代的研究已表明GSTs是植物體 內(nèi)普遍存在的一個同工酶家族，分為phi(GSTF)、tau(GSTU)、theta(GSTT)、lambda(GSTL)、 DHAR、zeta(GSTZ)、DHCQD共7大類，其中phi類和tau類是植物所特有的GSTs蛋白。Tau 類GSTs是植物GSTs家族中多樣性最豐富的一類。用除草劑或過氧化氫處理水稻，水稻 GSTU17(0sGSTU17)在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯不同，說明該基因在響應(yīng)非生物脅迫信號 時具有不同的調(diào)控機(jī)制。大豆GSTU4(GmGSTU4)轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出對除草劑甲草胺和消草 醚的增強(qiáng)的耐受性，即GmGSTU4對這兩種除草劑較高的脫毒效率。
[0003] 農(nóng)藥安全劑是指可以顯著提高作物去毒途徑的酶的表達(dá)，如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，從 而降低農(nóng)藥在作物中的殘留毒性達(dá)到相對安全的一類農(nóng)用化學(xué)品。煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì) 作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占重要的地位，但其在生產(chǎn)實(shí)踐中生物病害、雜草等因素嚴(yán)重影響著煙 草的生產(chǎn)，給煙農(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此農(nóng)藥的施用在煙草生長階段非常普遍，開發(fā)、篩 選對煙草低毒尤其是在煙草中具有較高脫毒效率的農(nóng)藥安全劑對于降低農(nóng)藥殘留、提高煙 草品質(zhì)具有重要意義，并且對其它作物具有借鑒、參考乃至使用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于利用一種具有高去毒活性的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶來篩選煙用農(nóng)藥 安全劑，為煙草農(nóng)業(yè)提供參考。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] -種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所述。
[0007] -種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，編碼權(quán)利要求1所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋 白。
[0008] -種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其堿基序列如SEQIDN0 :2所示。
[0009] 所述煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因的特異性核酸片段是序列表中SEQIDN0 :2的第 16-238和274-630位核苷酸序列。
[0010] 所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因在煙用農(nóng)藥篩選中的應(yīng)用。
[0011] 所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因在農(nóng)藥脫毒中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明對栽培種煙草（NicotianatobacumL.)谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶基因NtGSTU17進(jìn)行了克隆，利用體外表達(dá)純化技術(shù)對該基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，并 對其活性進(jìn)行了分析，利用熒光實(shí)時定量PCR(RT-PCR)技術(shù)對該基因在不同農(nóng)藥處理下的 表達(dá)情況進(jìn)行分析，為在煙草中具有高脫毒效率的農(nóng)藥篩選提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為煙草GSTU17蛋白對CDNB的偶聯(lián)活性；
[0014] 圖2為不同農(nóng)藥處理下NtGSTU17的相對表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因NtGSTU17編碼蛋白質(zhì)具有較高的⑶NB偶聯(lián)活性，一般 認(rèn)為高CDNB偶聯(lián)活性意味著高的抗除草劑活性和去毒活性。在利用不同農(nóng)藥處理煙草幼 苗時，煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因NtGSTU17表現(xiàn)出不同的表達(dá)特性，說明煙草對不同農(nóng)藥的 抗性和脫毒效率不同。鑒于該基因表達(dá)蛋白所具有的去毒活性，其在去毒代謝反應(yīng)中可能 發(fā)揮重要作用，在篩選低毒、易清除農(nóng)藥及農(nóng)藥安全劑中具有一定的應(yīng)用價值和應(yīng)用前景， 有必要通過專利加以保護(hù)。
[0016] 本發(fā)明提供的基因來源于煙草（Nicotianatabacum)，命名為NtGSTU17,編碼一種 煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白，是如下（i)或（ii)的蛋白質(zhì)：
[0017] (i)序列表中的SEQIDNo:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0018] (ii)序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0019] 序列表中的SEQIDNo. 1序列由221個氨基酸殘基組成。所述取代、缺少或添加 的一至十個氨基酸殘基可以是上述氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對 氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺少或添加，以及對相對功能的檢測可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來 實(shí)現(xiàn)。
[0020] 本發(fā)明的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因NtGSTU17可以是CDNA序列，也可以是基因組 DNA序列，或者是與這些序列具有90 %以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如 序列表中SEQIDNo. 2所示的cDNA序列。
[0021] 利用同源克隆的方法，設(shè)計引物克隆了NtGSTU17的0RF全長序列（SEQIDNo. 2)， 其編碼的蛋白序列如序列表中的SEQIDNo:1所不，序列結(jié)果分析表明，該蛋白含有GST超 家族tau類蛋白的保守功能域。表達(dá)譜分析表明該基因在煙草各個組織中組成型表達(dá)。通 過重組表達(dá)純化，體外活性分析表明，該基因表達(dá)蛋白對GST家族通用底物CDNB具有較高 的偶聯(lián)活性（圖1)。
[0022] 基于上述研究，本發(fā)明利用real-timePCR(RT-PCR)技術(shù)，設(shè)計對NtGSTU17高特 異性的RT-PCR引物，發(fā)現(xiàn)該基因在低溫、干旱、病毒侵染等脅迫條件下上調(diào)表達(dá)，對不同農(nóng) 藥施用則表現(xiàn)出選擇性上調(diào)表達(dá)?？梢?，NtGSTU17在氧化應(yīng)激、去毒代謝中發(fā)揮重要功能， 其對農(nóng)藥的選擇性反映出部分農(nóng)藥可以通過去毒途徑進(jìn)行脫毒，說明利用NtGSTU17篩選 出可以進(jìn)入煙草去毒代謝途徑的煙用農(nóng)藥，即在篩選低毒、低殘留、高降解的煙用農(nóng)藥安全 劑方面具有潛在的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值。
[0023] 表1.NtGSTU17的特異RT-PCR引物信息
[0024]
[0025] 表 2.NtGSTU17 的RT-PCR操作程序
[0026]
[0027] 首先，根據(jù)NtGSTU17基因的核苷酸片段（序列表SEQIDNo:2)，以200bp左右為 擴(kuò)增長度設(shè)計多條RT-PCR引物，經(jīng)過驗證，選取特異性最好的一對引物作為RT-PCR擴(kuò)增引 物，引物信息如表1所示。
[0028] 具體篩選步驟如下：
[0029] (1)煙草種子播種于育苗缽中育苗，生長5 - 6周后，選取長勢一致的待用；
[0030] (2)將代森錳鋅（低毒殺菌劑）、甲基托布津（廣譜性內(nèi)吸低毒殺菌劑）、百草枯 (除草劑）按照使用說明的用量和方式施用到煙苗上，兩小時后取樣，每個處理最少取3株， 地上部取第三第四位葉混合，地下部取整個根部，清水洗凈、擦干，液氮冷凍備用；
[0031] (3)將液氮冷凍樣品用基因研磨儀粉碎，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20°C保存 備用。
[0032] (4)按照羅氏熒光定量試劑盒的操作說明進(jìn)行RT-PCR，選用栽培種煙草核糖體蛋 白L25基因作為內(nèi)參基因，PCR程序如表2所示。
[0033] (5)計算NtGSTU17的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示，代森錳鋅處理后，NtGSTU17基 因的表達(dá)量顯著上調(diào)，說明代森錳鋅在煙草植株中可能通過煙草的去毒代謝途徑被降解， 因此在煙用的同類農(nóng)藥中優(yōu)先選擇代森錳鋅有助于降低煙株中的農(nóng)藥殘留。
【主權(quán)項】
1. 一種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No :1所述。2. -種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，編碼權(quán)利要求1所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白。3. -種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO :2所示。4. 如權(quán)利要求2所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于：所述煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶基因的特異性核酸片段是序列表中SEQ ID NO :2的第16-238和274-630位核苷酸序 列。5. 如權(quán)利要求2或3或4所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因在煙用農(nóng)藥篩選中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求2或3或4所述的煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因在農(nóng)藥脫毒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ？ID？No：1所述。煙草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因<i>NtGSTU17</i>在去毒代謝中的作用，及其在煙用農(nóng)藥安全劑篩選中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）是生物體去毒代謝過程中普遍存在的關(guān)鍵酶，煙草<i>Nt</i>GSTU17蛋白具有較高的去毒活性，其編碼基因在煙草中組成型表達(dá)，并在某些農(nóng)藥處理后顯著上調(diào)表達(dá)，表明該基因在煙用農(nóng)藥脫毒及篩選方面具有應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N9/10, C12N15/54
【公開號】CN105039277
【申請?zhí)枴緾N201510577323
【發(fā)明人】周會娜, 翟妞, 陳千思, 劉萍萍, 陳霞, 毛李鴻, 鄭慶霞, 金立鋒, 林福呈
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年9月11日