玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高溫、抗鹽能力的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及玉米ZmGolS2基因的應(yīng)用，具體涉及玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、 抗高溫、抗鹽能力的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)提高植物抗旱、抗熱、抗鹽的研宄多有報(bào)道，但多數(shù)轉(zhuǎn)基因 植物由于在正常條件下植物生長(zhǎng)受到抑制，因此到目前為止，仍未見(jiàn)相關(guān)基因應(yīng)用于商業(yè) 生產(chǎn)。通過(guò)調(diào)控棉籽糖代謝基因提高植物抗逆性的研宄報(bào)道極少。Himuro在2014年報(bào)道了 在二穗短柄草中超表達(dá)擬南芥AtGolS2基因提高了轉(zhuǎn)基因植株抗旱性（1)。Zhuo在2013年 報(bào)道了在煙草中超表達(dá)紫花苜蓿MfGolSl基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草中的肌醇半乳糖苷、棉子 糖含量并提高了抗寒、抗旱和抗鹽能力（2)。Sun在2013年報(bào)道了在擬南芥中表達(dá)TsGolS2 基因提高了轉(zhuǎn)基因植株抗鹽能力（3)。上述報(bào)道所用序列來(lái)自玉米以外其它物種，和本專(zhuān)利 所涉及的玉米ZmGolS2序列功能類(lèi)似但序列不同。
[0003] I. Himuroj Y. , Ishiyamaj K. , Mori, F. , Gondoj T. , Takahashij F. , Shinozakij K .,Kobayashij M.and AkashijR. (2014)Arabidopsis galactinol synthase AtGolS2 improves drought tolerance in the monocot model Brachypodium distachyon. J Plant Physiol, 171, 1127-1131.
[0004] 2. Zhuo, C. L，Wang，T.，Lu，S. Y.，Zhao, Y. Q.，Li，X. G. and Guo, Z. F. (2013) A cold responsive galactinol synthase gene from Medicago falcata(MfGolSl) is induced by myo-inositol and confers multiple tolerances to abiotic stresses. Physiol Plantarumj 149, 67-78.
[0005] 3. Sun，Z. B.，Qi，X. Y.，Wang，Z. L.，Li, P. H.，Wu，C. X.，Zhang，H. and Zhao, Y. X. (2013) Overexpression of TsG0LS2，a galactinol synthase, in Arabidopsis thaliana enhances tolerance to high salinity and osmotic stresses. Plant Physiol Bioch，69, 82-89.
[0006] 4. Li, Z. , Peng, J. , Wen, X. and Guoj H. (2013)Ethylene-insensitive3 is a senescence-associated gene that accelerates age-dependent leaf senescence by directly repressing miR164transcription in Arabidopsis. Plant Cell，25, 3311-3328.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過(guò)PCR方法克隆了玉米GRMZM5G872256基因（命名為ZmG0LS2)，將該基 因在擬南芥中超表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植物葉片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量，提高了植物 抗旱、抗熱、抗鹽能力。該基因超表達(dá)植株在正常條件下生長(zhǎng)正常，表現(xiàn)優(yōu)于已知抗逆基因 ZmDREB2A超表達(dá)植株。在干旱、高溫、高鹽脅迫條件下該基因生長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照，并和ZmDREB2A 超表達(dá)植株生長(zhǎng)類(lèi)似。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0009] 在植物中過(guò)量表達(dá)玉米ZmGolS2基因能夠提高肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量，提 高植物的抗旱、抗熱和抗鹽能力。過(guò)量表達(dá)玉米ZmGolS2基因?qū)χ参镌谡－h(huán)境條件下的 生長(zhǎng)沒(méi)有副作用。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為PCsGFP載體示意圖。
[0011] 圖2為ZmGolS2基因表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株鑒定不意圖，該圖顯不超表達(dá) ZmGolS2的擬南芥植株葉片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量顯著提高；(a)轉(zhuǎn)擬南芥用載體 示意圖；(b)ZmGolS2和ZmDREB2A基因在WT (野生型）和轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)水平分析；A : RT-PCR檢測(cè)ZmGolS2的表達(dá)水平。B: RT-PCR和Western檢測(cè)ZmDREB2A的表達(dá)水平；WT為 野生型，GFP為超表達(dá)GFP株系，G2-1, G2-2, G2-3為表達(dá)ZmGolS2基因植株，DR-5, DR-6， DR-9為表達(dá)ZmDREB2A植株；（c)超表達(dá)ZmGolS2和ZmDREB2A基因的擬南芥在正常生長(zhǎng)條 件下的生長(zhǎng)狀態(tài)；（d) HPLC檢測(cè)WT和各轉(zhuǎn)基因株系中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量；星號(hào) **表示與WT相比含量顯著升高。
[0012] 圖3為超表達(dá)ZmGolS2基因植株抗旱能力提高示意圖，該圖中（a)干旱脅迫前，干 旱脅迫2周，干旱脅迫后復(fù)水7天各個(gè)株系的表型；WT為野生型，GFP為超表達(dá)GFP株系， G2-1, G2-2，G2-3 為表達(dá) ZmGolS2 基因植株，DR-5，DR-6，DR-9 為表達(dá) ZmDREB2A 植株；(b)正 常生長(zhǎng)2周的各株系葉片失水率測(cè)定；將葉片從植株上剪下，放到玻璃紙上在室溫條件下 失水，每隔半小時(shí)稱(chēng)重；每個(gè)株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；星號(hào)*表示與WT相比失水率顯著降低 (p〈0. 05) ; (c)各株系干旱處理后存活率統(tǒng)計(jì)；每個(gè)株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；星號(hào)*表示與WT 相比差異顯著（P〈〇. 05)。
[0013] 圖4為超表達(dá)ZmGolS2基因植株抗熱能力提尚不意圖，該圖顯不超表達(dá)ZmGolS2 和ZmDREB2A基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗熱性；（a)各轉(zhuǎn)基因株系熱激前后表型觀 察；WT為野生型，GFP為超表達(dá)GFP株系，G2-1，G2-2, G2-3為表達(dá)ZmGolS2基因植株，DR-5， DR-6，DR-9為表達(dá)ZmDREB2A植株；(b)各株系存活率統(tǒng)計(jì)；每個(gè)株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；星號(hào) *表示與WT相比差異顯著（P〈0. 05)。
[0014] 圖5為超表達(dá)ZmGolS2基因植株抗鹽能力提尚不意圖，該圖中（a)鹽脅迫處理如 和處理后植株表型；WT為野生型，GFP為超表達(dá)GFP株系，G2-1，G2-2, G2-3為表達(dá)ZmGolS2 基因植株，DR-5，DR-6，DR-9為表達(dá)ZmDREB2A植株。鹽濃度為200mM NaCl ;(b)各株系鹽脅 迫后電導(dǎo)率測(cè)定；每個(gè)株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；星號(hào)*表示與WT相比差異顯著（P〈0. 05)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 1、發(fā)明人通過(guò)PCR方法克隆了玉米ZmGolS2基因的編碼區(qū)，構(gòu)建了該基因植物表 達(dá)載體。
[0016] 對(duì)水培的三葉期玉米幼苗進(jìn)行脫水處理。從脫水處理2小時(shí)的葉片提取RNA并將 其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0017] 以 cDNA 為模板，用上游引物 5 ' -CGGGATCCTGGCTCCCGAGCTGATGACAGCCAAG-3 ' 和下 游引物 5'-GCTCTAGACAAACACTCTAGCCCAATTCCTGACC-3'對(duì) ZmG0LS2 的編碼區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
[0018] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 Imin 20s， 35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸8min。
[0019] 將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用BamHI和XbaI酶切片段，后與pCsGFP載體（用于擬南芥 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，見(jiàn)圖1)連接。將PCsGFP上NcoI與BamHI酶切位點(diǎn)之間的GFP表達(dá)框替換為一 段短序列，然后將擴(kuò)增并酶切的ZmGolS20RF片段連在BamHI和XbaI位點(diǎn)之間，構(gòu)建超表達(dá) 擬南芥載體。載體有植物轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記潮霉素基因（見(jiàn)圖2a)。載體上的ZmGolS20RF片 段經(jīng)測(cè)序正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌Gv3101，用花序侵染法侵染擬南芥ColO野生型。TO代種子經(jīng) 過(guò)70%乙醇室溫lmin，20