%次氯酸鈉室溫5min消毒后，均勻涂布在MS平板上（含潮霉素 25mg/L)。4°C處理3天后轉(zhuǎn)移至22°C培養(yǎng)箱生長(zhǎng)。萌發(fā)約7-10天，轉(zhuǎn)基因植株的葉深綠， 根較長(zhǎng)；非轉(zhuǎn)化的植株葉淺綠，根短，不能長(zhǎng)期存活。將轉(zhuǎn)化體移入營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)直到收Tl 代種子。Tl代種子按上述方法篩選，收T2代種子（每個(gè)株系收多個(gè)單株）。每個(gè)T2代單 株種子分別篩選，種植，收集每個(gè)單株的T3代種子，篩選每個(gè)單株的T3代種子，后代不分離 的（均對(duì)潮霉素有抗性）進(jìn)行下一步鑒定。
[0020] ZmGolS2基因核苷酸序列：
[0021] ATGGCTCCCGAGCTGATGACAGCCAAGATGACCGCCAAAGCCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGAAGCCT GCCACGAGGGCGTACGTGACGTTCCTTGCGGGCGACGGCGACTACTGGAAGGGCGTGGTGGGGCTGGCCAAAGGCCT GCGCAAGGTCCGCTCGGCCTACCCCCTGGTGGTGGCGGTGCTGCCCGACGTGCCCGAGTCCCACCGCCGCATCCTCG TCTCGCAGGGCTGCGTCGTCCGCGAGATCGAGCCCGTGTACCCGCCTGAGAACCAGACGCAGTTCGCCATGGCGTAC TACGTCATCAACTACTCCAAGCTCCGCATCTGGGAGTTCGTGGAGTACGAGAGGATGGTGTACCTGGACGCGGACAT CCAGGTGTTCGAGAACATCGACGGCCTGTTCGAGCTCGAGAAGGGGTACTTCTACGCGGTGATGGACTGCTTCTGCG AGAAGACGTGGAGCCACACCCCGCAGTACAGGATCGGCTACTGCCAGCAGTGCCCGGACAAGGTGGCGTGGCCAGCG GCGACCGCCGAGCTGGGCCCTCCGCCGTCGCTCTACTTCAACGCCGGCATGTTCGTGCACGAGCCCAGCGTGGCCAC CGCCAAGGCGCTCCTCGACACCCTCCGCGTGACTCCGCCCACCCCCTTCGCAGAGCAGGACTTCCTGAACATGTTCT TCAGGGATCAGTACAGGCCGATCCCCAACGTGTACAACCTCGTGCTGGCCATGCTCTGGAGGCACCCCGAGAACGTG CAGCTGGAGAAGGTGAAGGTCGTGCACTACTGCGCGGCGGGGTCCAAGCCGTGGAGGTTCACGGGCAAGGAGGCGAA CATGGACAGGGAGGACATCAACGCCCTGGTGAACAAGTGGTGGGACATCTACAACGACGAGACGCTGGACTTGAAGG GCCTGCCCTCGCTCTCGCCCGACGACGACGACGAGGTGGAGGCGGTGGCCAAGAAGCCGCTTCGCGCGGCCCTGGCG GAGGCCGGCACGGTCAAGTACGTCACCGCGCCCTCGGCCGCGTGAo
[0022] ZmGo 1S2基因蛋白序列：
[0023] MAPELMTAKMTAKAAAAAAAVKPATRAYVTFLA ⑶⑶ YWKGWGLAKGLRKVRSAYPLWAVLPDVPES HRRILVSQGCVVREIEPVYPPENQTQFAMAYYVINYSKLRIWEFVEYERMVYLDADIQVFENIDGLFELEKGYFYAV MDCFCEKTWSHTPQYRIGYCQQCPDKVAWPAATAELGPPPSLYFNAGMFVHEPSVATAKALLDTLRVTPPTPFAEQD FLNMFFRDQYRPIPNVYNLVLAMLWRHPENVQLEKVKVVHYCAAGSKPWRFTGKEANMDREDINALVNKffffDIYNDE TLDLKGLPSLSPDDDDEVEAVAKKPLRAALAEAGTVKYVTAPSAA〇
[0024] 2、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在植物中超表達(dá)玉米ZmGolS2基因提高了植物葉片中肌醇半乳糖 苷和棉子糖的含量。
[0025] 通過(guò)RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)化的植株進(jìn)行基因表達(dá)水平鑒定。
[0026] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°0預(yù)變性51^11;94°0變性3〇8,60°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,24個(gè) 循環(huán)；72°C終延伸8min。
[0027] 對(duì)超表達(dá)玉米ZmGolS2擬南芥植株糖含量測(cè)定方法如下：將鑒定出的超表達(dá)玉米 ZmGo 1S2的擬南芥3個(gè)株系T3代純合種子與WT和超表達(dá)GFP種子先在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2 周，后移入營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)4周，每個(gè)株系采0. 5克葉片組織，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。液氮研磨至粉 末后加入5ml 80%乙醇（含200 μ g/ml乳糖），繼續(xù)研磨至勻漿。將勻漿倒入IOml離心管 中，再往研缽中加入2ml 80%乙醇（含200 μg/ml乳糖），清洗研缽，合并在離心管中。將 樣品置于80°C水浴鍋中加熱30min。室溫，12000*g離心20min。將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈的 離心管中。95°C加熱，將乙醇蒸發(fā)。將樣品在_80°C冰箱中凍存24小時(shí)。真空抽干。HPLC 級(jí)雙蒸水將樣品重懸。12000*g離心20min。上清凍存于-20°C冰箱中。測(cè)定前用0. 22ym 過(guò)濾。HPLC檢測(cè)器為waters2424ELSD，色譜柱為Waters Xbrige氨基柱。上樣量為5μ1。 在擬南芥中超表達(dá)玉米ZmGolS2基因提高了葉片中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量，如圖2d 所示。
[0028] 3、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在植物中超表達(dá)玉米ZmGolS2基因提高了植物抗旱、抗高溫、抗鹽 能力。
[0029] 轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期抗旱性檢測(cè)：稱取相同重量的營(yíng)養(yǎng)土于四孔小盆中，然后通過(guò) 底部吸水使土表完全濕潤(rùn)，稱量吸水后盆重。保持盆重量恒定。然后將MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的 幼苗移入盆中，每盆8株，每株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。正常生長(zhǎng)14天后，不澆水處理14天，觀 察表型并拍照，然后復(fù)水恢復(fù)7天，后統(tǒng)計(jì)存活率。
[0030] 轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期抗鹽性檢測(cè)：稱取相同重量的營(yíng)養(yǎng)土于四孔小盆中，然后通過(guò) 底部吸水使土表完全濕潤(rùn)，稱量吸水后盆重。保持盆重量恒定。然后將MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的 幼苗移入盆中，每盆8株，每株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。正常生長(zhǎng)14天后，每2天澆一次含有 200mM NaCl的自來(lái)水，每次充分吸水，共澆7次。14天后觀察表型并測(cè)定葉片電導(dǎo)率，電導(dǎo) 測(cè)定方法參考【背景技術(shù)】中的參考文獻(xiàn)4。
[0031] 轉(zhuǎn)基因擬南芥苗期抗熱性檢測(cè)：將MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（22°C，16/8光周期，相對(duì)濕度 60% ) 5天的擬南芥幼苗移入事先浸有4ml培養(yǎng)液的雙層Waterman濾紙上，22°C正常生長(zhǎng)2 天，然后45°C處理1小時(shí)。熱激處理后放置于22°C條件下（16/8光周期，相對(duì)濕度60% ) 恢復(fù)培養(yǎng)7天后測(cè)定存活率。
[0032] 在擬南芥中超表達(dá)玉米ZmGolS2基因提高了植物抗旱、抗高溫、抗鹽能力，參見(jiàn)圖 2-5 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 在植物中超表達(dá)玉米ZmGolS2基因或ZmGolS2基因的功能序列提高植物抗旱、抗高 溫、抗鹽能力的應(yīng)用。2. 在植物中超表達(dá)玉米ZmGolS2基因或ZmGolS2基因的功能序列提高植物中肌醇半乳 糖苷和棉子糖含量的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高溫、抗鹽能力的應(yīng)用。發(fā)明人通過(guò)超表達(dá)玉米GRMZM5G872256基因(命名為ZmGOLS2)提高植物葉片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量，提高植物抗旱、抗熱、抗鹽的方法。通過(guò)同源克隆，用PCR方法克隆了玉米ZmGolS2基因。構(gòu)建了用35S啟動(dòng)子調(diào)控該基因的表達(dá)載體。將該載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入植物擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株葉片肌醇半乳糖苷和棉子糖含量顯著提高，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、抗熱和抗鹽能力顯著提高。該基因超表達(dá)植株在正常條件下生長(zhǎng)正常，表現(xiàn)優(yōu)于已知抗逆基因ZmDREB2A超表達(dá)植株。在干旱、高溫、高鹽脅迫條件下該基因生長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照，并和ZmDREB2A超表達(dá)植株生長(zhǎng)類似。
【IPC分類】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公開(kāi)號(hào)】CN104946662
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510190988
【發(fā)明人】趙天永, 谷雷, 張玉民, 張明帥
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年4月21日