用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【專利摘要】一種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，包含有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基，其中：腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有：MS、BA、IBA，在MS、BA和IBA組成的腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基上，對(duì)蘋果矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的效果好，因此實(shí)現(xiàn)了蘋果矮化砧木離體葉片高頻率不定芽再生。
【專利說明】用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng) 方法
[0001] 一、技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，尤其是一種用于蘋果抗寒矮化砧木 離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
[0002] 二、【背景技術(shù)】 離體葉片再生不定芽技術(shù)是在細(xì)胞水平進(jìn)行誘變育種、體細(xì)胞變異篩選、嵌合體分離 的基礎(chǔ)，也是利用植物遺傳工程進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，同時(shí)也是在材料較少時(shí)實(shí)現(xiàn)植 物快速克隆的基礎(chǔ)。因此用于果樹離體葉片的產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法是植物繁殖 方法，被廣泛地應(yīng)用在植物的種質(zhì)創(chuàng)新及新品種選育中。植物葉片培養(yǎng)第一個(gè)獲得成功的 是1953年Steeves和Susex培養(yǎng)紫箕葉獲得了再生不定植株。之后，由于培養(yǎng)基成分的不斷 研究和完善，越來越多的植物種獲得了葉片培養(yǎng)成功。特別是植物遺傳工程的發(fā)展，使葉片 培養(yǎng)研究越來越受到植物育種研究者們的重視，因?yàn)橹参镞z傳轉(zhuǎn)化操作的成功應(yīng)用依賴于 離體葉片不定芽再生體系的建立。到現(xiàn)在，植物葉片培養(yǎng)已走過了半個(gè)多世紀(jì)，獲得不定芽 再生成功的植物種類也在日益增多，但由于不同物種基因型及遺傳背景的復(fù)雜性，至今研 究者們還不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所有植物種的葉片培養(yǎng)再生。即使已成功的物種，由于不同類型和不 同品種其基因型的差異，其再生的難易和所需的培養(yǎng)基條件也存在較大差異。特別是一些 果樹的品種其離體葉片再生非常困難，因此現(xiàn)有的組培技術(shù)都是對(duì)特定物種的類型或品種 是適宜的，換一個(gè)品種或類型可能就是不適宜的或說不是最佳的。如蘋果砧木'M26'、 'MM106'建立了高效離體葉片不定芽再生體系并利用這個(gè)再生體系獲得了轉(zhuǎn)基因植株，我 國(guó)吉林農(nóng)科院選育的蘋果抗寒矮化砧木'GM256'也獲得了不定芽再生成功，但同樣是吉林 農(nóng)科院選育出的綜合性狀優(yōu)于'GM256'的另一個(gè)抗寒矮化砧木'GM310'的葉片培養(yǎng)再生困 難。利用培養(yǎng)'GM256'的葉片培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，不能成功誘導(dǎo)'GM310'葉片產(chǎn)生不定芽。利 用已報(bào)道的蘋果屬其他種的葉片培養(yǎng)方法來培養(yǎng)'GM310'也未能成功。表明現(xiàn)有的培養(yǎng)條 件都不適宜'GM310'的葉片培養(yǎng)，需要研究開發(fā)一種適宜'GM310'葉片培養(yǎng)的培養(yǎng)基，為更 好的開發(fā)利用具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蘋果優(yōu)良砧木'GM310'奠定基礎(chǔ)。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的技術(shù)客體是一種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法， 本發(fā)明的技術(shù)客體是一種用于蘋果抗寒矮化砧木葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基。
[0004] 為了克服上述技術(shù)缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉 片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，因此獲得了蘋果抗寒矮化砧木離體葉片高頻率不定芽 再生成功。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種用于果樹離體葉片產(chǎn)生不定芽 的培養(yǎng)基，包含有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基，其中：腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS、BA、 IBAo
[0006] 由于設(shè)計(jì)了MS、BA和IBA，在MS、BA和IBA組成的腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基上，果樹離 體葉片的產(chǎn)生不定芽的效果好，因此實(shí)現(xiàn)了果樹離體葉片的產(chǎn)生不定芽的育苗。
[0007] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，按照離體葉片產(chǎn)生不定芽的不同階段，還包含有綠苗增殖培養(yǎng)基、 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幼苗生根培養(yǎng)基； 其中：腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS、BA、IBA，綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含 有:WPM、BA、IBA、GA3、蔗糖，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:1^、102、嫩4、山梨糖醇，幼 苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS(MS1)、IBA、蔗糖。
[0008] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L鹿糖。
[0009] 綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0010] 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10g/L~50g/L山梨糖醇。
[0011] 幼苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0012] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基組成：
改良MS即MSI:對(duì)MS中無機(jī)成分的大量元素進(jìn)行改良，其他成分不變，改良如下： 大量元素 工作濃度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 KH2P04 170 MgS04 · 7H20 370 CaCl2 · 2H20 440， WPM培養(yǎng)基組成：
植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì):6 -芐基氨基嘌呤(BA)，噻苯隆(TDZ)，吲哚丁煙酸（IBA)，萘乙煙 酸(NAA)，赤霉素(GA3)， 碳源:蔗糖，山梨糖醇， 無離子水， 瓊脂粉。
[0013] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，一種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，其 步驟是： 選擇品種編號(hào)為'GM310 '的蘋果抗寒矮化砧木為技術(shù)客體并且建立'GM310 '的離體葉 片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法。
[0014] a、腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng):從果園種植的抗寒矮化蘋果砧木'GM310'的小樹上剪取當(dāng) 年生半木質(zhì)化枝條，剪掉葉片后把枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植體先用 洗衣粉水清洗，而后放自來水流水沖洗30分鐘以上，把材料取出放入超凈臺(tái)上的無菌燒杯 內(nèi)，加入次氯煙酸鈉其中有效氯為5%的溶液，殺菌8分鐘，期間搖動(dòng)3~5次，倒出次氯煙酸鈉 用無菌水洗4~6次，把芽段接種到裝有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)和無菌試 管苗建立的技術(shù)目的； b、 綠苗培養(yǎng)：?jiǎn)?dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)獲得的綠苗即無菌苗，轉(zhuǎn)移到綠苗增殖培養(yǎng)基： WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上進(jìn) 行增殖快繁，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)綠苗培養(yǎng)和試管苗增殖的技術(shù)目的； c、 不定芽培養(yǎng):試管苗繼代增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至4-5周時(shí)，取健壯綠苗頂端剛展開幼嫩葉 片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切3-6刀，至少一邊的葉緣不切斷，保持葉片是一個(gè) 帶多個(gè)切口的完整葉片，把切好的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10g/L~50g/L山梨糖醇;在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn) 不定芽培養(yǎng)和離體葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的技術(shù)目的； d、 幼苗生根培養(yǎng):切取生長(zhǎng)高度在1.5厘米以上的試管苗轉(zhuǎn)移到幼苗生根培養(yǎng)基:改 良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先連續(xù)暗培養(yǎng) 7天，然后轉(zhuǎn)到16小時(shí)光周期培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)幼苗培養(yǎng)和試管苗生根 的技術(shù)目的。
[0015] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，所有培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)pH值到5.8，然后在121°C，1個(gè)大氣壓下高 壓滅菌20分鐘，培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為25 ± 2°C，光照周期為16小時(shí)/天。
[0016] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，MS(Murashige and
Skoog)培養(yǎng)基組成： 改良MS即MSI:對(duì)MS中無機(jī)成分的大量元素進(jìn)行改良，其他成分不變，改良如下：
大量元素 工作濃度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 KH2P04 170 MgS04 · 7H20 370 CaCl2 · 2H20 440 WPM培養(yǎng)基組成：
植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì):6 -芐基氨基嘌呤(BA)，噻苯隆(TDZ)，吲哚丁煙酸（IBA)，萘乙煙 酸(NAA)，赤霉素(GA3)。
[0017] 碳源:鹿糖，山梨糖醇 無離子水 瓊脂粉。
[0018] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了，蘋果優(yōu)良抗寒矮化砧木'GM310'的離體葉片不定芽再生。
[0019] 本發(fā)明的技術(shù)效果在于:對(duì)蘋果砧木'GM310'葉片不定芽再生很困難這一問題，能 有效克服葉片不定芽不能再生和再生率低的問題，成功獲得高頻率葉片不定芽再生。并獲 得了不定芽繼代繁殖后綠苗的生根。本專利技術(shù)可用于砧木的無性繁殖、植物的細(xì)胞工程 及基因工程的遺傳改良等，我們實(shí)驗(yàn)室在建立蘋果抗寒矮化砧木'GM256'快繁技術(shù)體系的 基礎(chǔ)上，又建立了綜合性狀優(yōu)于'GM256'的另一蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的試管苗。在 'GM310'試管苗繁殖中，我們發(fā)現(xiàn)這一砧木的增殖和生根培養(yǎng)基都和'GM256'不同，和以前 報(bào)道的其他蘋果砧木的試管苗快繁的培養(yǎng)基也不同，增殖和生根都比較困難。取其離體葉 片進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，不定芽再生困難，表現(xiàn)在用已報(bào)道的蘋果品種及其砧木葉片培養(yǎng)的培 養(yǎng)基都未能誘導(dǎo)'GM310'葉片獲得再生不定芽。這一結(jié)果說明已報(bào)道的培養(yǎng)基中的某些成 分可能不適宜'GM310'葉片的培養(yǎng)。本專利的發(fā)明目的就是解決我國(guó)自選蘋果優(yōu)良砧木 'GM310'葉片培養(yǎng)不定芽再生困難的問題，建立'GM310'葉片不定芽再生技術(shù)體系，為這一 優(yōu)良砧木的無性快繁提供技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為利用基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)這一砧木進(jìn) 行遺傳改良提供基礎(chǔ)，葉片不定芽再生率高，為85%，有效解決了蘋果矮化砧木' GM310 '難再 生的難題。
[0020] 在本技術(shù)方案中，改良MS是指MSI。
[0021] 在本技術(shù)方案中，腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基中MS、BA和IBA為重要技術(shù)特征，在用于果 樹離體葉片的產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的技術(shù)領(lǐng)域中，具有新穎性、創(chuàng)造性和實(shí)用 性，在本技術(shù)方案中的術(shù)語(yǔ)都是可以用本技術(shù)領(lǐng)域中的專利文獻(xiàn)進(jìn)行解釋和理解。
[0022] 四、【附圖說明】 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技 術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明 的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù) 這些附圖獲得其他的附圖。
[0023]圖1為本發(fā)明的蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的試管苗的建立和增殖的效果圖： 其中:A:腋芽萌發(fā);B:在WPM上增殖；C :在MSI上增殖;D:在MS上增殖 圖2為本發(fā)明的蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的葉片不定芽再生和試管苗生根的效果圖： 其中：A:培養(yǎng)基MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L 山梨 糖醇上誘導(dǎo)不定芽再生;B:培養(yǎng)基MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~ 50 g/L蔗糖上誘導(dǎo)不定芽再生;C:培養(yǎng)基MS + 3~7 mg/L BA + 0.1~0.5 mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L鹿糖上誘導(dǎo)不定芽再生。
[0024] 五、【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明 的進(jìn)一步限定。一種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，第一個(gè)實(shí)施 例，其步驟是： 選擇品種編號(hào)為'GM310 '的蘋果抗寒矮化砧木為技術(shù)客體并且建立'GM310 '的離體葉 片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法。
[0025] a、腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng):從果園種植的蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的小樹上剪取當(dāng) 年生半木質(zhì)化枝條，剪掉葉片后把枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植體先用 洗衣粉水清洗，而后放自來水流水沖洗30分鐘以上，把材料取出放入超凈臺(tái)上的無菌燒杯 內(nèi)，加入次氯煙酸鈉其中有效氯為5%的溶液，殺菌8分鐘，期間搖動(dòng)3次，倒出次氯煙酸鈉用 無菌水洗4次，把芽段接種到裝有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)和無菌試管苗 建立的技術(shù)目的； b、 綠苗培養(yǎng)：?jiǎn)?dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)獲得的綠苗即無菌苗，轉(zhuǎn)移到綠苗增殖培養(yǎng)基： WPM + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + O.lmg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上進(jìn)行增殖快繁，把 培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)綠苗培養(yǎng)和試管苗增殖的技術(shù)目的； c、 不定芽培養(yǎng):試管苗繼代增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至4周時(shí)，取健壯綠苗頂端剛展開幼嫩葉 片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切3刀，至少一邊的葉緣不切斷，保持葉片是一個(gè)帶 多個(gè)切口的完整葉片，把切好的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 0.1 mg/L TDZ + 0.1mg/L NAA + 10 g/Lg/L山梨糖醇;在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)離體葉片不 定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的技術(shù)目的； d、 幼苗生根培養(yǎng):切取生長(zhǎng)高度在1.5厘米的試管苗轉(zhuǎn)移到幼苗生根培養(yǎng)基:改良MS (MSI) + 0.1 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先連續(xù)暗培養(yǎng)7天，然 后轉(zhuǎn)到16小時(shí)光周期培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)幼苗培養(yǎng)和試管苗生根的技術(shù) 目的。
[0026]在本實(shí)施例中，所有培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)pH值到5.8,然后在121°C，1個(gè)大氣壓下高 壓滅菌20分鐘，培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為25 ± 2°C，光照周期為16小時(shí)/天。
[0027] 在本實(shí)施例中，基本培養(yǎng)基 MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基組成：
改良MS即MSI:對(duì)MS中無機(jī)成分的大量元素進(jìn)行改良，其他成分不變，改良如下：大量元素 工作濃度(mg/L)NH4N03 825KN03 950KH2P04 170MgS04 · 7H20 370CaCl2 · 2H20 440WPM培養(yǎng)基組成：
植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：6 -芐基氨基嘌呤(BA)，噻苯隆(TDZ)，吲哚丁煙酸（IBA)，萘乙煙 酸(NAA)，赤霉素 (GA3)。
[0028] 碳源:鹿糖，山梨糖醇 無離子水 瓊脂粉。
[0029] -種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，第二個(gè)實(shí)施例，其 步驟是： 選擇品種編號(hào)為'GM310 '的蘋果抗寒矮化砧木為技術(shù)客體并且建立'GM310 '的離體葉 片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法。
[0030] a、腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng):從果園種植的蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的小樹上剪取當(dāng) 年生半木質(zhì)化枝條，剪掉葉片后把枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植體先用 洗衣粉水清洗，而后放自來水流水沖洗30分鐘以上，把材料取出放入超凈臺(tái)上的無菌燒杯 內(nèi)，加入次氯煙酸鈉其中有效氯為5%的溶液，殺菌8分鐘，期間搖動(dòng)5次，倒出次氯煙酸鈉用 無菌水洗6次，把芽段接種到裝有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)和無菌試管苗 建立的技術(shù)目的； b、 綠苗培養(yǎng)：?jiǎn)?dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)獲得的綠苗即無菌苗，轉(zhuǎn)移到綠苗增殖培養(yǎng)基： WPM + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA +0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上進(jìn)行增殖快繁，把培 養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)綠苗培養(yǎng)和試管苗增殖的技術(shù)目的； c、 不定芽培養(yǎng):試管苗繼代增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至5周時(shí)，取健壯綠苗頂端剛展開幼嫩葉 片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切6刀，至少一邊的葉緣不切斷，保持葉片是一個(gè)帶 多個(gè)切口的完整葉片，把切好的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 4 mg/L TDZ + 0.5mg/L NAA + 10 50 g/L山梨糖醇;在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)離體葉片不定 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的技術(shù)目的； d、 幼苗生根培養(yǎng):切取生長(zhǎng)高度在1.9厘米的試管苗轉(zhuǎn)移到幼苗生根培養(yǎng)基:改良MS (MSI) + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先連續(xù)暗培養(yǎng)7天，然后 轉(zhuǎn)到16小時(shí)光周期培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)幼苗培養(yǎng)和試管苗生根的技術(shù)目 的。
[0031] -種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，第三個(gè)實(shí)施例，其 步驟是： 選擇品種編號(hào)為'GM310 '的蘋果抗寒矮化砧木為技術(shù)客體并且建立'GM310 '的離體葉 片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法。
[0032] a、腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng):從果園種植的蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的小樹上剪取當(dāng) 年生半木質(zhì)化枝條，剪掉葉片后把枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植體先用 洗衣粉水清洗，而后放自來水流水沖洗30分鐘以上，把材料取出放入超凈臺(tái)上的無菌燒杯 內(nèi)，加入次氯煙酸鈉其中有效氯為5%的溶液，殺菌8分鐘，期間搖動(dòng)3~5次，倒出次氯煙酸鈉 用無菌水洗4~6次，把芽段接種到裝有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)和無菌試 管苗建立的技術(shù)目的； b、 綠苗培養(yǎng)：?jiǎn)?dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)獲得的綠苗即無菌苗，轉(zhuǎn)移到綠苗增殖培養(yǎng)基： WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上進(jìn) 行增殖快繁，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)綠苗培養(yǎng)和試管苗增殖的技術(shù)目的； c、 不定芽培養(yǎng):試管苗繼代增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至4~5周時(shí)，取健壯綠苗頂端剛展開幼嫩 葉片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切3~6刀，至少一邊的葉緣不切斷，保持葉片是一 個(gè)帶多個(gè)切口的完整葉片，把切好的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為： MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L山梨糖醇;在培養(yǎng)室中培養(yǎng) 實(shí)現(xiàn)離體葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的技術(shù)目的； d、 幼苗生根培養(yǎng):切取生長(zhǎng)高度在1.5厘米以上的試管苗轉(zhuǎn)移到幼苗生根培養(yǎng)基:改 良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先連續(xù)暗培養(yǎng) 7天，然后轉(zhuǎn)到16小時(shí)光周期培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)幼苗培養(yǎng)和試管苗生根 的技術(shù)目的。
[0033] -種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，第四個(gè)實(shí)施例，其 步驟是： 選擇品種編號(hào)為'GM310 '的蘋果抗寒矮化砧木為技術(shù)客體并且建立'GM310 '的離體葉 片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法。
[0034] a、腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng):從果園種植的蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的小樹上剪取當(dāng) 年生半木質(zhì)化枝條，剪掉葉片后把枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植體先用 洗衣粉水清洗，而后放自來水流水沖洗30分鐘以上，把材料取出放入超凈臺(tái)上的無菌燒杯 內(nèi)，加入次氯煙酸鈉其中有效氯為5%的溶液，殺菌8分鐘，期間搖動(dòng)4次，倒出次氯煙酸鈉用 無菌水洗5次，把芽段接種到裝有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)和無菌試管苗 建立的技術(shù)目的； b、 綠苗培養(yǎng)：?jiǎn)?dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)獲得的綠苗即無菌苗，轉(zhuǎn)移到綠苗增殖培養(yǎng)基： WPM + 0.75 mg/L BA + 0.25 mg/L IBA + 0.25mg/L GA3 + 30 g/L蔗糖上進(jìn)行增殖快繁， 把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)綠苗培養(yǎng)和試管苗增殖的技術(shù)目的； c、 不定芽培養(yǎng):試管苗繼代增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至5周時(shí)，取健壯綠苗頂端剛展開幼嫩葉 片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切4刀，至少一邊的葉緣不切斷，保持葉片是一個(gè)帶 多個(gè)切口的完整葉片，把切好的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 0.28 mg/L TDZ + 0.35mg/L NAA + 30 g/L山梨糖醇;在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)離體葉片不定 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的技術(shù)目的； d、 幼苗生根培養(yǎng):切取生長(zhǎng)高度在1.7厘米的試管苗轉(zhuǎn)移到幼苗生根培養(yǎng)基：改良MS (MSI) + 1.1 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先連續(xù)暗培養(yǎng)7天，然 后轉(zhuǎn)到16小時(shí)光周期培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)幼苗培養(yǎng)和試管苗生根的技術(shù) 目的。
[0035] -種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基。第一個(gè)實(shí)施例，按照 離體葉片的產(chǎn)生不定芽的不同階段，包含有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基、綠苗增殖培養(yǎng)基、不定芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幼苗生根培養(yǎng)基;其中： 腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0036] 綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:WPM + 0.5 mg/L BA + 0.01 mg/L IBA + O.lmg/ L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0037] 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 0.1mg/L TDZ + 0.1mg/L NAA + 10 g/L 山梨糖醇。
[0038] 幼苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:改良MS(MSl) + 0.1mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0039] 蘋果抗寒矮化砧木'GM310'的離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果：蘋果抗寒 矮化砧木' GM310 '的芽段成功獲得了腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)的綠芽梢（圖1，A)，說明培養(yǎng)基MS、BA和 IBA對(duì)' GM310 '的腋芽的啟動(dòng)培養(yǎng)是有效的。
[0040] 腋芽萌發(fā)獲得的無菌綠苗轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明在培養(yǎng)基 WPM、BA、IBA、GA3、蔗糖上生長(zhǎng)最好，表現(xiàn)為苗既有增殖生長(zhǎng)又有伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，且葉色綠 (圖1，B);但在添加相同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的改良MS(MS1)上增殖較差，苗表現(xiàn)老化，葉色也 較黃（圖1，C);在MS培養(yǎng)基上雖然有增殖，但苗不伸長(zhǎng)，且表現(xiàn)黃化（圖1，D)，也不是理想的 增殖培養(yǎng)基。
[0041 ]葉片產(chǎn)生不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS、TDZ、NAA、山梨糖醇（圖2，A)，不定芽再 生率為85%。而在培養(yǎng)基MS、TDZ、NAA、蔗糖（圖2，B)和培養(yǎng)基MS、BA、NAA、蔗糖（圖 2，C)上，不定芽再生率都在15%以下。
[0042]健康綠苗經(jīng)生根誘導(dǎo)培養(yǎng)20天，生根率在85%以上（圖2，D)，說明所選用生根培養(yǎng) 基能A:培養(yǎng)基MS、TDZ、NAA、山梨糖醇上誘導(dǎo)不定芽再生;B:培養(yǎng)基MS、TDZ、NAA、蔗糖 上誘導(dǎo)不定芽再生;C:培養(yǎng)基MS、BA、NAA、蔗糖上誘導(dǎo)不定芽再生有效誘導(dǎo)'GM310'試 管苗的生根。
[0043] -種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基。第二個(gè)實(shí)施例，按照 離體葉片的產(chǎn)生不定芽的不同階段，包含有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基、綠苗增殖培養(yǎng)基、不定芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幼苗生根培養(yǎng)基;其中： 腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0044] 綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:WPM + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IBA +0.5mg/L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0045] 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 4 mg/L TDZ + 0.5mg/L NAA + 50 g/L 山梨糖醇。
[0046] 幼苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:改良MS(MSl) + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0047] 一種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基。第三個(gè)實(shí)施例，按照 離體葉片的產(chǎn)生不定芽的不同階段，包含有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基、綠苗增殖培養(yǎng)基、不定芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幼苗生根培養(yǎng)基;其中： 腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0048] 綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.1~0.5mg/L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0049] 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/L~50 g/L山梨糖醇。
[0050] 幼苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有：改良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L蔗 糖。
[0051] -種用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基。第四個(gè)實(shí)施例，按照 離體葉片的產(chǎn)生不定芽的不同階段，包含有腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基、綠苗增殖培養(yǎng)基、不定芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幼苗生根培養(yǎng)基;其中： 腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L蔗 糖。
[0052] 綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:WPM + 0.75 mg/L BA + 0.21mg/L IBA + 0.3mg/ L GA3 + 30 g/L鹿糖。
[0053] 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 0.21 mg/L TDZ + 0.3mg/L NAA + 30 g/ Lg/L山梨糖醇。
[0054] 幼苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:改良MS(MSl) + l.lmg/L IBA + 20 g/L蔗糖。
[0055] 本發(fā)明具有下特點(diǎn)： 1、由于設(shè)計(jì)了MS、BA和IBA，在MS、BA和IBA組成的腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基，對(duì)果樹離體 葉片的產(chǎn)生不定芽的效果好，因此實(shí)現(xiàn)了果樹離體葉片的產(chǎn)生不定芽的育苗。
[0056] 2、由于設(shè)計(jì)了綠苗增殖培養(yǎng)基、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幼苗生根培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了對(duì)萌 發(fā)啟動(dòng)腋芽的后續(xù)培育，提高了育苗率。
[0057] 3、由于設(shè)計(jì)了基本培養(yǎng)基和碳源，通過1^、1?1、13(1^1)、山梨糖醇對(duì)果樹離體葉 片細(xì)胞的誘導(dǎo)，激發(fā)了果樹離體葉片體細(xì)胞的不定芽分化能力。
[0058] 4、由于設(shè)計(jì)了對(duì)結(jié)構(gòu)形狀進(jìn)行了數(shù)值范圍的限定，使數(shù)值范圍為本發(fā)明的技術(shù)方 案中的技術(shù)特征，不是通過公式計(jì)算或通過有限次試驗(yàn)得出的技術(shù)特征，試驗(yàn)表明該數(shù)值 范圍的技術(shù)特征取得了很好的技術(shù)效果。
[0059] 5、由于設(shè)計(jì)了本發(fā)明的技術(shù)特征，在技術(shù)特征的單獨(dú)和相互之間的集合的作用， 通過試驗(yàn)表明，本發(fā)明的各項(xiàng)性能指標(biāo)為現(xiàn)有的各項(xiàng)性能指標(biāo)的至少為1.7倍，通過評(píng)估具 有很好的市場(chǎng)價(jià)值。
[0060] 還有其它的與腋芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基中MS、BA和IBA的相同或相近似的其它技術(shù)特 征都是本發(fā)明的實(shí)施例之一，并且以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為 滿足專利法、專利實(shí)施細(xì)則和審查指南的要求，不再對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有 可能的組合的實(shí)施例都進(jìn)行描述。
[0061] 因此在用于蘋果抗寒矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng) 域內(nèi)，凡是包含有內(nèi)層1設(shè)置為化學(xué)肥料與植物秸桿或植物葉體的高壓形成的混合體的技 術(shù)內(nèi)容都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0062] 上述實(shí)施例只是本發(fā)明所提供的用于蘋果矮化砧木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng) 基和培養(yǎng)方法的一種實(shí)現(xiàn)形式，根據(jù)本發(fā)明所提供的方案的其他變形，增加或者減少其中 的成份或步驟，或者將本發(fā)明用于其他的與本發(fā)明接近的技術(shù)領(lǐng)域，均屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，其特征是:包含有蔽芽 萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基，其中：蔽芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS、BA、IBA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，其特 征是:按照離體葉片產(chǎn)生不定芽的不同階段，還包含有綠苗增殖培養(yǎng)基、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 和幼苗生根培養(yǎng)基， 其中：蔽芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS、BA、IBA，綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含 有:WPM、BA、IBA、GA3、薦糖，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS、TDZ、NAA、山梨糖醇，幼 苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS(MS1)、IBA、薦糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，其特 征是:蔽芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L薦 糖， 綠苗增殖培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01~0.5 mg/L IBA + 0.^ 0.5mg/L GA3 + 30 g/L薦糖 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:MS + 0.1~4 mg/L TDZ + 0.1~0.5mg/L NAA + 10 g/l~50 g/L山梨糖醇； 幼苗生根培養(yǎng)基設(shè)置為包含有:改良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L薦糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，其特 征是:MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基組成：5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，其特 征是:改良MS即MS1:對(duì)MS中無機(jī)成分的大量元素進(jìn)行改良，其他成分不變，改良如下： 大量元素 工作濃度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 K 出 P04 170 MgS04 ? 7肥O 370 CaCl2 ? 2肥O 440O6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)基，其特 征是:WPM培養(yǎng)基組成：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：6 -芐基氨基嚷嶺(BA )，嚷苯?。═DZ )，嗎I噪下煙酸（I BA )，糞乙煙 酸(NAA)，赤霉素(GA3)， 碳源:薦糖，山梨糖醇， 無離子水， 瓊脂粉。7. -種用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，其步驟是： 選擇編號(hào)為'GM310'的蘋果抗寒矮化化木為技術(shù)客體并且建立'GM310'的離體葉片產(chǎn) 生不定芽的培養(yǎng)方法， a、蔽芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng):從果園種植的蘋果抗寒矮化化木'GM310'的小樹上剪取當(dāng)年生 半木質(zhì)化枝條，剪掉葉片后把枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成一芽一段的芽段，芽段外植體先用洗衣 粉水清洗，而后放自來水流水沖洗30分鐘W上，把材料取出放入超凈臺(tái)上的無菌燒杯內(nèi)，加 入次氯煙酸鋼其中有效氯為5%的溶液，殺菌8分鐘，期間搖動(dòng)3~5次，倒出次氯煙酸鋼用無 菌水洗4~6次，把芽段接種到裝有蔽芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)基:MS + 2 mg/L BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L薦糖的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)蔽芽萌發(fā)啟動(dòng)培養(yǎng)和無菌試管苗 建立的技術(shù)目的； b、綠苗培養(yǎng)：?jiǎn)?dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)獲得的綠苗即無菌苗，轉(zhuǎn)移到綠苗增殖培養(yǎng)基： WPM + 0.5~1.0 mg/L BA + 0.01 ~0.5 mg/L IBA + 0.1 ~0.5mg/L GA3 + 30 g/L薦糖上進(jìn) 行增殖快繁，把培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)綠苗培養(yǎng)和試管苗增殖的技術(shù)目的； C、不定芽培養(yǎng):試管苗繼代增殖培養(yǎng)基生長(zhǎng)至4~5周時(shí)，取健壯綠苗頂端剛展開幼嫩葉 片，用無菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切3~6刀，至少一邊的葉緣不切斷，保持葉片是一個(gè) 帶多個(gè)切口的完整葉片，把切好的葉片接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS + 0.^4 mg/L TDZ + 0.^0.5mg/L NAA + 10 g/l~50 g/L山梨糖醇;在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí) 現(xiàn)離體葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的技術(shù)目的； d、幼苗生根培養(yǎng):切取生長(zhǎng)高度在1.5厘米W上的試管苗轉(zhuǎn)移到幼苗生根培養(yǎng)基：改 良MS(MSl) + 0.1~2 mg/L IBA + 20 g/L薦糖上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先連續(xù)暗培養(yǎng) 7天，然后轉(zhuǎn)到16小時(shí)光周期培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)幼苗培養(yǎng)和試管苗生根 的技術(shù)目的。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于果樹離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，其特征是:所有培 養(yǎng)基在滅菌前調(diào)抑值到5.8,然后在12rC，l個(gè)大氣壓下高壓滅菌20分鐘，培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度 為25 ± 2°C，光照周期為16小時(shí)/天。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，其 據(jù)佈是：MS(Murashiee and Skooe)睹萊其紐成：改良MS即MSI:對(duì)MS中無機(jī)成分的大量元素進(jìn)行改良，其他成分不變，改良如下： 大量元素 工作濃度(mg/L) NH4N03 825 KN03 950 K 出 P04 170 MgS04 ? 7肥O 370 CaCl2 ? 2肥O 440 WPM驚棠其細(xì)成.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：6 -芐基氨基嘴吟（BA )，曜苯?。═DZ )，呀噪T煙酸（I BA )，蒙己煙 酸(NAA)，赤霉素(GA3)， 碳源:薦糖，山梨糖醇， 無離子水， 瓊脂粉。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于蘋果抗寒矮化化木離體葉片產(chǎn)生不定芽的培養(yǎng)方法，其 特征是:蘋果優(yōu)良抗寒矮化化木' GM310 '。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105900836SQ201610252781
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】孫清榮, 孫洪雁, 陶吉寒, 辛力, 李林光
【申請(qǐng)人】山東省果樹研究所