一種過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs及其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及一種過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs及其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2 (Nrf2)是一種作用于二相代謝酶基因上游的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)上的轉(zhuǎn)錄因子，是多種細(xì)胞保護(hù)基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)者。二相代謝酶或稱二相抗氧化酶，主要有血紅素加氧酶(HO-1，即熱休克蛋白32)、醌氧化還原酶(NQOl)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等，二相代謝酶的表達(dá)主要通過(guò)Keapl-Nrf2-ARE通路調(diào)控。ARE位于幾乎所有二相酶基因的5'啟動(dòng)區(qū)，多種不同類別的物質(zhì)能通過(guò)ARE來(lái)誘導(dǎo)二相酶基因的轉(zhuǎn)錄。正常狀態(tài)下Nrf2與其分子伴侶Keapl結(jié)合于胞漿中，處于功能抑制狀態(tài)，并由Keapl將其帶入泛素化途徑進(jìn)行降解，因此在細(xì)胞中的半衰期很短。在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2從Keapl中解離以穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與ARE結(jié)合，最終導(dǎo)致其下游的二相代謝酶的轉(zhuǎn)錄。Nrf2作為細(xì)胞防御系統(tǒng)中最重要的保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)Nrf2的活化和核轉(zhuǎn)位通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和抗炎癥作用。近年來(lái)研宄發(fā)現(xiàn)，Nrf2具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用，對(duì)減輕多種組織損傷發(fā)揮重要作用。另外，Nrf2是Fas誘導(dǎo)凋亡的抑制物，過(guò)表達(dá)Nrf2可以保護(hù)細(xì)胞免于Fas誘導(dǎo)的凋亡，Nrf2還可以通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)GSH水平來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)死亡信號(hào)的敏感性，減輕組織的缺血再灌注損傷。
[0003]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)存在于多種組織之中，例如可在骨髓、脂肪、肌肉、羊水、角膜基質(zhì)和臍帶組織、胎盤提取不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞最先被發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)外臨床試驗(yàn)多用第三方捐贈(zèng)的骨髓來(lái)源，主要缺點(diǎn)是不易獲取，且獲取的過(guò)程對(duì)健康捐贈(zèng)者有侵入性操作。臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞活性好，生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，而且來(lái)源豐富，臍帶分娩后一般予以丟棄，可變廢為寶，并且利用臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)倫理問(wèn)題，對(duì)捐贈(zèng)者無(wú)害。目前全球范圍內(nèi)登記的間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的臨床試驗(yàn)超過(guò)200多項(xiàng)。一些臨床試驗(yàn)初步結(jié)果顯示MSCs對(duì)多種疾病如心肌梗塞、急性呼吸窘迫綜合癥acute respiratory distress syndrome (ARDS)、骨髓移植后發(fā)生的移植物抗宿主病graft-versus-host disease (GVHD)等都有一定的治療效果，但其療效受MSCs在體內(nèi)存活時(shí)間的限制。
[0004]MSCs是良好的載體，經(jīng)過(guò)基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞可能具有較好的應(yīng)用前景。經(jīng)過(guò)基因修飾后，MSCs的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用可得到增強(qiáng)，細(xì)胞活力和在體內(nèi)的生存時(shí)間也得到增強(qiáng)。大多數(shù)臨床前、臨床研宄所用的基因修飾的MSCs均由病毒載體對(duì)MSCs進(jìn)行修飾。病毒載體因其轉(zhuǎn)染效率而被廣泛運(yùn)用，常見的類型有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。腺病毒是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，治療劑量的腺病毒載體修飾的MSCs需要大量的腺病毒，其經(jīng)濟(jì)效益比難以達(dá)到滿意。逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體修飾可將感興趣的基因插入MSCs基因組中，穩(wěn)定表達(dá)并可以隨著細(xì)胞分裂傳給子代，具有大量擴(kuò)增的潛力。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006](I)、PCR 技術(shù)擴(kuò)增人源 Nrf2 基因開放閱讀框(open reading frame, ORF)；
[0007]⑵、將步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，雙酶切后與骨架質(zhì)粒PLV-CMV-Xba1-BamH1-GFP連接，構(gòu)建了 Nrf2慢病毒重組載體；轉(zhuǎn)化后挑選單克隆，搖菌，取菌液行PCR擴(kuò)增確定陽(yáng)性克??；
[0008](3)、將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，確定無(wú)突變后大量擴(kuò)增；
[0009](4)、將步驟(2)獲得的Nrf2慢病毒重組載體與輔助質(zhì)粒按質(zhì)量比10:5:5:5的比例共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分兩次收獲293FT細(xì)胞培養(yǎng)上清，將兩次獲得的上清混合，過(guò)濾上清，即獲得病毒；所述的輔助質(zhì)粒分別為pCMSCV、PMDG和PMO II，它們與骨架質(zhì)粒構(gòu)成四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)。
[0010](5)、將步驟(4)獲得的病毒感染第3?5代hUC-MSCs細(xì)胞，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs。
[0011]優(yōu)選，步驟⑴的PCR反應(yīng)體系為:50uL反應(yīng)體系包含25uL 2XTaq plus PCRMaster Mix，正向和反向引物各luL，cDNA模板luL，無(wú)酶水22uL ;PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性940C 3min，變性94°C 30s，退火54°C 30s，延伸72°C 2.5min，從變性自延伸結(jié)束一共35個(gè)循環(huán)，72攝氏度5min。
[0012]優(yōu)選，步驟(4)中所述的共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，具體共轉(zhuǎn)染步驟為:在培養(yǎng)皿內(nèi)接種合適密度的293FT細(xì)胞，要求轉(zhuǎn)染前達(dá)到80%以上，將步驟(2)獲得的Nrf2慢病毒重組載體、pCMSCV、PMDG, PMO II按質(zhì)量比10:5:5:5的比例稀釋于Opt1-MEM中，另外吸取Lipo2000進(jìn)行稀釋，室溫靜置后將兩者混合，輕輕混勻，靜置；分別加入培養(yǎng)皿中，輕輕混勻；轉(zhuǎn)染6h后更換成含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，分別在24h及48h后收獲293FT細(xì)胞培養(yǎng)上清，將兩次獲得的上清混合，0.45uM PVDF膜過(guò)濾器過(guò)濾上清，獲得導(dǎo)入重組質(zhì)粒包裝成Nrf2重組慢病毒，分裝凍存于-80°C冰箱或直接用于感染細(xì)胞。
[0013]優(yōu)選，步驟(5)中所述的感染第3?5代hUC-MSCs細(xì)胞，具體感染步驟為:感染前一天接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，至第二天感染時(shí)密度約為30%，感染前半小時(shí)，加入感染增敏劑，感染時(shí)將病毒液和培養(yǎng)基1:1稀釋，過(guò)濾后以此病毒液將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液置換出來(lái)，6小時(shí)換一次病毒液，共感染3次。
[0014]臨床上間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)一般取10代以內(nèi)，本發(fā)明選取第3?5代的hUC-MSCs作為感染慢病毒對(duì)象，以期獲得較為初代的細(xì)胞達(dá)到治療目的。
[0015]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種通過(guò)上述方法制備的過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs ο
[0016]本發(fā)明的過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs增加了細(xì)胞活力，且在缺氧及氧化應(yīng)激條件下具有更強(qiáng)的抗凋亡特性，因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的是過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs在作為臨床前研宄MSCs的良好工具細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的第四個(gè)目的是過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs在制備增進(jìn)臨床前實(shí)驗(yàn)MSCs移植的藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的293FT細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研宄院細(xì)胞資源中心。
[0019]本發(fā)明的hUC-MSCs細(xì)胞購(gòu)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心。
[0020]本發(fā)明的輔助質(zhì)粒pCMSCV、PMDG和PMO II及四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)自廣州永諾生物科技公司。
[0021 ] 本發(fā)明通過(guò)在人間充質(zhì)干細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Nrf 2基因，增加其細(xì)胞活力，兼具在缺氧的條件下具有更強(qiáng)的抗凋亡特性；在體外獲得治療水平數(shù)量的Nrf2-MSCs，可作為臨床前研宄MSCs的良好工具細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
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[0022]圖1是過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs⑶和對(duì)照組(A)經(jīng)過(guò)15h缺氧后細(xì)胞活力情況；
[0023]圖2是過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs及其對(duì)照組經(jīng)過(guò)15h缺氧后用western-blot檢測(cè)凋亡標(biāo)志物caspase3變化情況；
[0024]圖3是NCB1-Blast比對(duì)功能預(yù)測(cè)PCR產(chǎn)物；
[0025]圖4是PCR反應(yīng)結(jié)果及重組質(zhì)粒建立，其中，A是PCR獲得的人源Nrf20RF，B是重組載體陽(yáng)性克隆菌液PCR產(chǎn)物；
[0026]圖5是重組載體陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果；
[0027]圖6是穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Nrf2基因的細(xì)胞株MSCs (B)及其不含插入基因的空載對(duì)照組(A)，因其骨架質(zhì)粒均帶有GFP，故我們可以從圖中可見慢病毒感染效率可。
[0028]圖7是過(guò)表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證，采用western-blot的方法檢測(cè)到在MSCs中成功過(guò)表達(dá)Nrf-2o
【具體實(shí)施方式】
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[0029]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0030]實(shí)施例1:
[0031]1、PCR技術(shù)擴(kuò)增人源Nrf2(來(lái)源于人胚腎細(xì)胞)開放閱讀框(open readingframe, ORF)
[0032]1.1引物設(shè)計(jì)
[0033]在NCBI上找到Nrf2的Gene ID:4780，在其ORF起始密碼子(atg)前方尋找正向引物，反向引物在終止密碼子(tag)后尋找，然后將其反向互補(bǔ)得到反向引物。分別在正向引物和反向引物前面加上XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物序列如下:
[0034]正向引物Fw: CGATTCTAGATTCCTGCTTTATAGCGTGCAAA
[0035]反向引物Rv:ATATGGATCCTCACATCACAGTAGGAGCTT
[0036]經(jīng)過(guò)NCB1-Blast比對(duì)功能預(yù)測(cè)所設(shè)計(jì)的引物PCR產(chǎn)物特異性較好，只有一種產(chǎn)物即Nrf20RF片段，如圖3所示。
[0037]1.2PCR 擴(kuò)增
[0038]模板:以293FT 為模板，TRIZOL法(試劑采用 life technologies TRIZOL regent，貨號(hào):15596-018)提取RNA，利用Roche公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):4379012001)反轉(zhuǎn)錄為cDNA再以此為模板按以上條件和步驟做PCR。
[0039]ORF的全長(zhǎng)擴(kuò)增利用德國(guó)DBI公司的2XTaq plus PCR Master Mix為基礎(chǔ)反應(yīng)體系(DBI,公司，貨號(hào):DB-2032)，50uL 反應(yīng)體系包含 25uL 2 X Taq plus PCR Master Mix，正向和反向引物各luL，cDNA模板luL，無(wú)酶水22uL。
[0040]PCR反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)