器件及其在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種器件及其在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途,該器件具有聚多巴胺層?羧甲基殼聚糖層?多肽層的結(jié)構(gòu)，其能夠調(diào)控人多能干細(xì)胞的行為,可用于細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)。
【專利說明】
器件及其在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途
[0001 ] 本申請(qǐng)要求中國專利申請(qǐng)CN201410850755.0的優(yōu)先權(quán)（申請(qǐng)日：2014年12月31日， 發(fā)明名稱:器件及其在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途）。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及可用于細(xì)胞培養(yǎng)的器件及該器件在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途。具體涉及 一種具有聚多巴胺層_羧甲基殼聚糖層-多肽層結(jié)構(gòu)的器件及其在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Hyman pluripotent stem cells，hiPSCs)具有和人胚胎干細(xì) 胞(Hyman embryonic stem cells,hESCs)幾乎同樣的形態(tài)、擴(kuò)增能力、表面抗原、基因表達(dá) 譜和甲基化位點(diǎn)等特征。hiPSCs克服了 hESCs存在的倫理道德困惑，增加了干細(xì)胞自體移植 治療的可行性，并解決了細(xì)胞數(shù)量有限的問題。
[0004] 通常人多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)需借助于鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblasts，mEFs)滋養(yǎng)層或Matrigel c^mEFs培養(yǎng)體系因其操作過程繁瑣，現(xiàn)逐漸被其它培 養(yǎng)體系取代。Matrigel是從￡^5(￡即611^61:11-11〇1111-5￥31'111)小鼠肉瘤中得到的可溶性基底膜 提取物，其能夠在培養(yǎng)基底表面形成一層充當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)的薄膜，使人多能干細(xì)胞能夠在 其構(gòu)建的體外微環(huán)境中獲得理想的貼壁和自我更新效果（Xu，C.，et al ?、Feeder_free growth of undifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、 10、971-4)。但是1&廿1861培養(yǎng)體系為異種來源且無法保證不同批次產(chǎn)品間的一致性，加之 其成分的不明確性，使其不適于人多能干細(xì)胞的大規(guī)模體外擴(kuò)增，限制其在臨床治療中的 應(yīng)用。所以許多科學(xué)家致力于構(gòu)建可替代Matrigel的、成分明確的人多能干細(xì)胞體外培養(yǎng) 體系。
[0005] 首先，研究者相繼發(fā)現(xiàn)纖連蛋白，玻連蛋白和層粘連蛋白等蛋白及層粘連蛋白的 某些特定部分，均可實(shí)現(xiàn)人多能干細(xì)胞的體外自我更新。但是，受限于昂貴的費(fèi)用和物理吸 附導(dǎo)致的批次不一致，蛋白等生物制品難以廣泛應(yīng)用于人多能干細(xì)胞科研和臨床中。因此， 近些年研究者成功開發(fā)出了，少數(shù)幾種支持人多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)和定向分化的人工合成 表面，其在成本和批次穩(wěn)定性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。Villa-Diaz等在聚苯乙烯表面形成 PMEDSAH甲基丙烯酸酯類衍生物涂層，外加條件培養(yǎng)基或化學(xué)成分明確的"StemPro"培養(yǎng)基 可以實(shí)現(xiàn) H9hESCs 干性維持（Villa-Diaz LG et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28: 581-3)〇
[0006] Melkoymian等通過在培養(yǎng)板表面形成聚丙稀酸層，并在其表面接枝能夠促進(jìn) hESCs貼壁和增殖的多肽，實(shí)驗(yàn)證實(shí)hESCs在來源于骨涎蛋白（Bone Sialoprotein，BSP)的 Ac-KGGNGEPRGDTYRAY或來源于玻連蛋白（Vitronectin，VN)的Ac-KGGPQVTRGDVFTMP多肽功 能化修飾表面均能夠?qū)崿F(xiàn)10代左右的干性維持（Melkoymian Z et al. Synthetic peptide-aerylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28: 606-10)。
[0007] 但是，這些人工合成表面制備過程復(fù)雜，含生物惰性成分，不利于人多能干細(xì)胞的 自我更新和大量擴(kuò)增。因此，希望利用體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境成分來構(gòu)建一種簡單，穩(wěn)定，有效的 成分明確人多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明人針對(duì)上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有聚多巴胺層-羧甲基殼聚 糖層-VN多肽層的器件能夠調(diào)控人多能干細(xì)胞的行為，從而完成了本發(fā)明。
[0009] 即，本發(fā)明如下。
[0010] 1 ?-種器件，其包括：
[0011] 基底，
[0012] 連接于所述基底上的聚多巴胺層，
[0013] 連接于所述聚多巴胺層上的羧甲基殼聚糖層，以及
[0014] 連接于所述羧甲基殼聚糖層上的多肽層；
[0015] 其中，所述多肽層包含下述多肽A或其變體多肽；
[0016] 多肽A:由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的多肽，
[0017]變體多肽是指：
[0018] (1)由在多肽A的氨基酸序列中發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添 加而得的氨基酸序列組成、且具有與多肽A等同的功能的多肽，
[0019] (2)由與多肽A的氨基酸序列具有70%以上氨基酸同源性的氨基酸序列組成、且具 有與多肽A等同的功能的多肽，或者
[0020] (3)由在嚴(yán)格條件下與編碼多肽A的氨基酸序列的核酸雜交的核酸編碼、且具有與 多肽A等同的功能的多肽。
[0021] 2.根據(jù)項(xiàng)1所述的器件，其中，所述多肽層中所述多肽A的分布密度是1~200iig/ cm2。
[0022] 3.根據(jù)項(xiàng)1所述的器件，其中，"與多肽A等同的功能"是指能夠調(diào)控人多能干細(xì)胞 的行為，所述人多能干細(xì)胞是人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或人胚胎干細(xì)胞，調(diào)控人多能干細(xì)胞的行 為是指：
[0023] (1)誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞，
[0024] (2)使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或
[0025] (3)使人多能干細(xì)胞長期自我更新。
[0026] 4.根據(jù)項(xiàng)1所述的器件，其中，所述多肽A的變體多肽是VB多肽。
[0027] 5.根據(jù)項(xiàng)1所述的器件，其中，所述多肽層還包含具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化 的功能的化合物B。
[0028] 6.根據(jù)項(xiàng)5所述的器件，其中，所述多肽層中所述化合物B的分布密度是1~200yg/ cm2。
[0029] 7.根據(jù)項(xiàng)5所述的器件，其中，所述化合物B是BFP-1。
[0030] 8.根據(jù)項(xiàng)1~7中任一項(xiàng)所述的器件在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途，其中，所述細(xì)胞體 外實(shí)驗(yàn)包括：
[0031 ] (1)誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞，
[0032] (2)使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或
[0033] (3)使人多能干細(xì)胞長期自我更新。
[0034] 9.根據(jù)項(xiàng)5~7中任一項(xiàng)所述的器件在促使人多能干細(xì)胞定向分化中的用途。
[0035] 10.-種促使人多能干細(xì)胞定向分化的方法，該方法包括：
[0036] 步驟B:使用定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基在權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的器件表面培養(yǎng)人多 能干細(xì)胞。
[0037] 11.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，該方法還包括：
[0038] 步驟A:在所述步驟B之前，使用能夠維持人多能干細(xì)胞自我更新的培養(yǎng)基培養(yǎng)人 多能干細(xì)胞。
[0039] 12.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中，該方法是促使人多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化 的方法，所述定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有巰基乙醇，地塞米松和維生素C以及胎牛血清的aMEM 培養(yǎng)基。
[0040] 13.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中，該方法是促使人多能干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞定向 分化的方法，所述定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基是添加有神經(jīng)生長因子NGF和rmNoggin的N2B27培養(yǎng)液。
[0041] 14.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中，該方法是促使人多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化 的方法，先用含bFGF的MEF-CM培養(yǎng)基培養(yǎng)人多能干細(xì)胞2-3天，誘導(dǎo)第一天時(shí)換為RPMI+B27 培養(yǎng)基，并加入Activin A培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)第二天加入BMP 4和bFGF連續(xù)四天不換液，然后換 為含有50ng/ml VEGF165的RPMI+B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0042] 15.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中，該方法是促使人多能干細(xì)胞向牙相關(guān)上皮細(xì)胞定 向分化的方法，所述定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有N2，BMP-4和RA的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0043] 16.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中，該方法是促使人多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的 方法，先用添加 Activin A的RPMI/B27誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人多能干細(xì)胞3天，再用添加 BMP2和 FGF4的RPMI/B27誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，然后用添加 Activin A的RPMI/B27誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 天，再用添加 HGF和KGF的RPMI/B27誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，然后用添加 SingleQuots (不含EGF) 和Oncostatin-M的Hepatocyte Culture Media誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)8天。
[0044] 發(fā)明的效果
[0045] 1.構(gòu)成所述器件的材料均具有優(yōu)良的生物相容性，構(gòu)建了一種化學(xué)成分明確、無 外源物質(zhì)、安全的調(diào)控人多能干細(xì)胞命運(yùn)的體系。
[0046] 2.接枝不同的功能多肽可以賦予體系不同的生物學(xué)功能。
[0047] 3.聚多巴胺層-羧甲基殼聚糖層-多肽層的結(jié)構(gòu)可以設(shè)置在多種基底材料表面(細(xì) 胞培養(yǎng)板，種植體等）。這種設(shè)置可以在常規(guī)條件下進(jìn)行，步驟相對(duì)簡單易行，不需要特殊設(shè) 備和高溫高壓等條件，更符合GMP的要求。而且，制備過程避免了使用對(duì)生物體有毒性的化 學(xué)物質(zhì)，工藝過程更為環(huán)保。
[0048] 4.該體系制備過程均為化學(xué)反應(yīng)，相較于Matrigel和蛋白質(zhì)的物理吸附，具有更 優(yōu)越的批次穩(wěn)定性。
[0049] 5.采用不同的定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即可促使人多能干細(xì)胞向不同類型的細(xì)胞定向分 化。
【附圖說明】
[0050] 圖1說明了 PS表面相繼經(jīng)PDA/CMC/VN修飾后的表征。（a)PS表面經(jīng)PDA-CMC-VN修飾 接觸角變化；（b)XPS結(jié)果；（c)AFM研究PS表面在PDA-CMC-VN修飾過程中的表面形貌變化。掃 面范圍 lwn X lym(上圖）和5_ X 5wn(下圖）；（d)PS，PS-PDA，PS-PDA-CMC和PS-PDA-CMC-VN的 C元素高分辨率XPS圖譜。
[0051 ] 圖2(a)利用FITC-VN多肽比較PDA-VN和PDA-CMC-VN表面多肽接枝量，及對(duì)HlhESCs 和hNF-ClhiPSCs在表面生長四天后細(xì)胞數(shù)量的影響。（b)VN多肽濃度對(duì)HlhESCs和hNF-ClhiPSCs貼壁和生長的影響。（c)消化方式和Y-27632對(duì)培養(yǎng)在PDA-CMC-VN和Matrigel表面 的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs第四天細(xì)胞數(shù)量的影響。
[0052]圖3說明了人尿液細(xì)胞重編程過程及多能性鑒定。（a)重編程前人尿液細(xì)胞形態(tài)； (b)重編程第8天有胚胎干細(xì)胞樣人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆出現(xiàn)在PDA-CMC-VN表面；（c)重編 程第18天表面出現(xiàn)典型的胚胎干細(xì)胞樣人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克?。唬╠)培養(yǎng)在PDA-CMC-VN表 面的第16代roUE0304hiPSCs克隆形貌；（e)人尿液細(xì)胞在PDA-CMC-VN修飾的6孔板上重編程 至18天時(shí)進(jìn)行AP染色；（f)細(xì)胞核型分析(g)RT-PCR分析細(xì)胞0ct-4，Sox-2，Nanog和Rex-1干 性基因表達(dá)；（h)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)至P16的roUE0304hiPSCs表面標(biāo)志 物0ct-4，SSEA-3和Tra-160表達(dá)；（i)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物Oct-4和SSEA-3表達(dá)。標(biāo) 尺，l〇〇_;(j)定量RT-PCR分析PDUE0304hiPSCs形成的擬胚體的三胚層標(biāo)志基因表達(dá)；（k) TOUE0304hiPSCs在TOA-CMC-VN表面培養(yǎng)至第16代后在N0D/SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，對(duì)畸 胎瘤進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。標(biāo)尺，200mi。
[0053]圖4 PDA-CMC-VN表面支持人多能干細(xì)胞長期自我更新。（a)4個(gè)人多能干細(xì)胞系 (HlhESCs，H9hESCs, hNF-ClhiPSCs 和 UMC-ClhiPSCs)在 PDA-CMC-VN 表面連續(xù)傳代至 P20 時(shí)的 核型分析；（b)利用流式細(xì)胞術(shù)(左圖）和免疫熒光(右圖）檢測(cè)4個(gè)人多能干細(xì)胞系多能性標(biāo) 志物0(^-4,33￡4-3 &11(11'瓜-160表達(dá)情況；（(3-(1)利用石英晶體微天平檢測(cè)1111^3〇8和11即-ClhiPSCs在材料和Matrigel表面培養(yǎng)20代后的端粒酶活性。
[0054] 圖5證實(shí)HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在PDA-CMC-VN表面連續(xù)傳代至P20后維持多向分 化能力。（a-b)利用RT-PCR分析細(xì)胞形成的擬胚體是否表達(dá)三胚層標(biāo)志基因；（c)細(xì)胞樣品 注入N0D/SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。標(biāo)尺，200mi。
[0055] 圖6顯示了H9hESCs在PDA-CMC-VN表面定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。（a) 在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)的第15代H9hESCs(上圖）消化為單細(xì)胞后，接種至AggreWell?800板 (中圖）以形成均一的擬胚體(下圖ha^ghESCs在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)至第14天后形成 神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)。（c)這些神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)繼續(xù)誘導(dǎo)7天后出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞。（d-e)免疫 熒光檢測(cè)Sox-1(紅)/Nestin(綠)和MAP-2(綠)/TUJ-l(綠)分別鑒定誘導(dǎo)形成的神經(jīng)前體細(xì) 胞(d)和神經(jīng)元細(xì)胞(e)。（f)在TOA-CMC-VN表面培養(yǎng)的H9hESCs誘導(dǎo)16后形成跳動(dòng)的心肌細(xì) 胞。（g)心肌標(biāo)記物a-actinin(綠)和0-myosin(綠）。細(xì)胞核經(jīng)DAPI(藍(lán))染色。白色標(biāo)尺，100 Mi;黑色標(biāo)尺，200M1。
[0056] 圖7顯示了 PS-PDA-CMC-VN/BFP-1多肽混合接枝的材料表面熒光多肽定性和定量 表征結(jié)果(a-b)。圖7c為H9hESCs和UMC-ClhiPSCs在不同PDA-CMC-VN/BFP-1表面成骨誘導(dǎo)28 天后的茜素紅定性染色和定量測(cè)定結(jié)果。
[0057]圖8顯示了VB多肽可以替代VN多肽用于人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)。（a)多肽濃度對(duì)培養(yǎng) 在PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面HIhECSs和hNF-ClhiPSC第四天細(xì)胞量的影響；（b)HIhECSs 和hNF-ClhiPSC在PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面的96h生長曲線。（c)HlhECSs和hNF-ClhiPSC以單細(xì)胞或克隆接種至PDA-CMC-VB和H)A-CMC-VN表面生長至第四天的細(xì)胞量；（d) 在6250-100000細(xì)胞? cm2接種密度范圍內(nèi)，HlhECSs和hNF-ClhiPSC在roA-CMC-VB和H)A-CMC-VN表面的貼壁24h的細(xì)胞量.上述實(shí)驗(yàn)均以Matrigel為對(duì)照。*代表p〈0.05，#代表p〈 0.01〇
[0058]圖9顯示了PDA-CMC-VB表面支持多個(gè)人多能干細(xì)胞系長期自我更新。（a)5個(gè)人多 能干細(xì)胞系（HlhESCs，H9hESCs，hNF-ClhiPSCs，UMC-ClhiPSCs和ipsN004hiPSCs)在H)A-CMC-VB表面連續(xù)傳代至P20時(shí)的細(xì)胞形貌和核型分析；（b)利用流式細(xì)胞術(shù)(左圖）和免疫熒 光（右圖）檢測(cè)5個(gè)人多能干細(xì)胞系多能性標(biāo)志物Oct-4，SSEA-3and Tra-160表達(dá)情況;標(biāo) 尺，lOOunio
[0059] 圖10證實(shí)HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在TOA-CMC-VB表面連續(xù)傳代至P20后維持多向 分化能力。（a-b)利用RT-PCR分析細(xì)胞形成的擬胚體是否表達(dá)三胚層標(biāo)志基因；（c)細(xì)胞樣 品注入N0D/SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。標(biāo)尺，200mi。
[0060] 圖11顯示了H9hESCs，iPSN004hiPSCs和VBUE hiPSCs3個(gè)人多能干細(xì)胞系均能夠在 PDA-CMC-VB表面定向分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞和心肌細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)Sox-1 (紅)/Nestin(綠），MAP_2(綠)/TUJ_l (綠)和a-actinin(綠)和0-myosin(綠)分別鑒定誘導(dǎo) 形成的神經(jīng)前體細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞和心肌細(xì)胞。細(xì)胞核經(jīng)DAPI (藍(lán))染色。標(biāo)尺，50mi。
[0061]發(fā)明的【具體實(shí)施方式】
[0062] 本說明書中提及的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義， 如有沖突以本說明書中的定義為準(zhǔn)。
[0063] 碰
[0064] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種器件（以下也稱作本發(fā)明的器件），其包括：
[0065] 基底，
[0066]連接于所述基底上的聚多巴胺層，
[0067]連接于所述聚多巴胺層上的羧甲基殼聚糖層，以及
[0068] 連接于所述羧甲基殼聚糖層上的多肽層；
[0069] 其中，所述多肽層包含下述多肽A或其變體多肽；
[0070] 多肽A:由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的多肽，
[0071] 變體多肽是指：
[0072] (1)由在多肽A的氨基酸序列中發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添 加而得的氨基酸序列組成、且具有與多肽A等同的功能的多肽，
[0073] (2)由與多肽A的氨基酸序列具有70%以上氨基酸同源性的氨基酸序列組成、且具 有與多肽A等同的功能的多肽，或者
[0074] (3)由在嚴(yán)格條件下與編碼多肽A的氨基酸序列的核酸雜交的核酸編碼、且具有與 多妝A等同的功能的多妝。
[0075] 本發(fā)明的器件可用于細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞培養(yǎng)。在本說明書中，細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)是 指：（1)誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞，（2)使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或(3)使人多能 干細(xì)胞長期自我更新。
[0076] 1 ?基底
[0077] 對(duì)于用作本發(fā)明的器件的基底的材料沒有特殊限制，可以使用通常用作細(xì)胞培養(yǎng) 表面的基底的那些材料，例如聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、玻璃等。作為基底，例如可以使用 細(xì)胞培養(yǎng)板，也可以使用種植體(鈦或聚醚醚酮制）。
[0078] 2.聚多巴胺層
[0079]多巴胺(Dopamine，DA)在體內(nèi)是一種生物神經(jīng)遞質(zhì)，將基底材料浸沒在含多巴胺 的緩沖液中，多巴胺會(huì)通過氧化聚合沉積到基底材料表面，從而在基底材料表面形成聚多 巴胺層。
[0080] 對(duì)于構(gòu)成所述聚多巴胺層的聚多巴胺(P〇lyd〇pamine，roA)的分子量沒有特殊限 制。聚多巴胺的分子量可以采用常規(guī)方法進(jìn)行控制，例如0.01~l〇〇g/L多巴胺溶液5~90°C 反應(yīng)1分鐘~72小時(shí)。
[0081] 3.羧甲基殼聚糖層
[0082] 羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)是殼聚糖最重要的衍生物之一，與 細(xì)胞外基質(zhì)成分糖胺聚糖(GAG)有相似之處，具有良好的生物相容性。
[0083]本發(fā)明人通過多肽熒光素標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，PDA層上能夠接枝VN多肽，但所得器件不 能促使細(xì)胞貼壁。
[0084]令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在設(shè)置CMC層作為PDA層與VN多肽層的橋梁的情況 下，所得器件被賦予了調(diào)控人多能干細(xì)胞行為的功能。本發(fā)明中使用的羧甲基殼聚糖，通過 凝膠滲透色譜儀和參照《中國人民共和國藥典》方法，測(cè)得的重均分子量可以為1000~20萬 g/mo 1，優(yōu)選1萬~10萬g/mol，更優(yōu)選6~8萬g/mo 1。例如實(shí)施例中制備的roA-CMC-VN器件的 CMC層中的羧甲基殼聚糖的重均分子量為83550g/mol。
[0085] 羧甲基殼聚糖含有氨基和羧基，其中的氨基可與聚多巴胺形成化學(xué)結(jié)合。羧甲基 殼聚糖與聚多巴胺的化學(xué)結(jié)合可利用本技術(shù)領(lǐng)域已知的化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，例如邁克爾加成 和席夫堿反應(yīng)。例如，可以將一定量的0.1重量％~30重量％溶液加至聚多巴胺層基 底上，5~60°C反應(yīng)lh~72h，即可得到聚多巴胺-CMC基底層。
[0086] 4.多肽層
[0087] 所述多肽層應(yīng)包含下述多肽A或其變體，視需要也可以包含其他成分(多肽、蛋白 質(zhì)、核酸、小分子化合物等），只要本發(fā)明的器件能夠發(fā)揮調(diào)控人多能干細(xì)胞行為的功能即 可。
[0088]所述多肽A是由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的多肽，稱作VN多肽，其氨基酸序 列為SEQ ID NO: 1 iKGGPQVTRGDVFTMPJN多肽來自于玻連蛋白（Vitronectin，VN)，有報(bào)道 稱，通過在培養(yǎng)板表面形成聚丙烯酸層，并在其表面接枝來源于骨涎蛋白（Bone Sialoprotein，BSP)的 Ac-KGGNGEPRGDTYRAY 和 N 端乙?；脑?VN 多肽，能夠?qū)崿F(xiàn) hESCs 的 10 代左右的干性維持（Melkoumian Z et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2010；28:606-10.)〇
[0089]本發(fā)明的研究表明，在PDA層直接接枝該VN多肽，所得器件不能促使細(xì)胞貼壁，但 在設(shè)置CMC層作為PDA層與VN多肽層的橋梁的情況下，所得器件被賦予了調(diào)控人多能干細(xì)胞 行為的功能。
[0090] 所述多肽A的變體包括：
[0091] (1)由在多肽A的氨基酸序列中發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添 加而得的氨基酸序列組成、且具有與多肽A等同的功能的多肽。
[0092] 本說明書中，多肽A相對(duì)于變體多肽而言，在此是指上述多肽A。
[0093] 本說明書中，"與多肽A等同的功能"是指，將本發(fā)明的器件中的多肽A用多肽A的變 體多肽替換時(shí)，具有下述功能中的任意一項(xiàng)、任意兩項(xiàng)或全部：
[0094] (i)誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞，
[0095] (ii)使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或 [0096] (i i i)使人多能干細(xì)胞長期自我更新。
[0097]所述變體多肽中，氨基酸取代可以是保守取代，即將特定的氨基酸殘基替換為具 有相似物理化學(xué)特征的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基團(tuán)氨基酸殘基之間 的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala間的相互取代）、極性殘基之間的取代(例如Lys和Arg、Glu 和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。在本說明書中，"一個(gè)或多個(gè)氨基酸"指通過人工合成 方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸，例如1~20個(gè)氨基酸、優(yōu)選1~15個(gè)氨 基酸、更優(yōu)選1~1 〇個(gè)氨基酸、更優(yōu)選1~8個(gè)氨基酸、更優(yōu)選1~2個(gè)氨基酸、更優(yōu)選1個(gè)氨基 酸。
[0098]所述變體多肽是否具有與多肽A等同的功能可以這樣來確定:將本發(fā)明的器件中 的多肽A用其變體多肽替換，并考察所得器件是否具有上述(i)~（iii)的功能中的任意一 項(xiàng)、任意兩項(xiàng)或全部。
[0099]所述多肽A的變體還包括：
[0100] (2)由與多肽A的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu) 選95%以上、更優(yōu)選97%以上、更優(yōu)選98%以上、更優(yōu)選99%以上的氨基酸同源性的氨基酸 序列組成、且具有與多肽A等同的功能的多肽。
[0101]兩個(gè)氨基酸序列的同源性％可通過目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定?；蛘邇蓚€(gè)多肽序列的 同源性百分比可以通過使用以Needleman，S.B?及Wunsch，C.D. (J.Mol .Bol ? ,48:443-453， 1970)的算法為基礎(chǔ)的、可從威斯康星州大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程 序進(jìn)行序列信息比較來決定。GAP程序優(yōu)選的默認(rèn)參數(shù)包括：（l)Henikoff，S.以及 Henikoff，J.G. (Proc.Natl .Acad. Sci.USA,89:10915-10919,1992)所記載的得分/矩陣、 bloswii62; (2)-個(gè)空位扣12分；（3)連續(xù)空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。也可使用 該領(lǐng)域技術(shù)人員使用的進(jìn)行序列比較的其它程序。關(guān)于同源性百分比，例如 :Altschul等 (Nucl .Acids.Res .，25，p. 3389-3402，1997)中記載的可用BLAST程序?qū)π蛄行畔⑦M(jìn)行比較 和確定。該程序可于網(wǎng)絡(luò)上在NantionalCenter for Biotechnology Information(NCBI) 或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)網(wǎng)站使用。在相同站點(diǎn)，對(duì)利用BLAST程序進(jìn)行同源性檢 索的各種條件(參數(shù))進(jìn)行了詳細(xì)記載，可對(duì)部分設(shè)定進(jìn)行適當(dāng)變更，但檢索通常用默認(rèn)值 進(jìn)行。此外，兩個(gè)氨基酸序列的同源性％也可用遺傳信息處理軟件GENETYX Ver. 7(GENETYX 制)等程序或FASTA算法等來確定。此時(shí)，也可用默認(rèn)值檢索。
[0102]所述多肽A的變體還包括：
[0103] (3)由在嚴(yán)格條件下與編碼多肽A的氨基酸序列的核酸雜交的核酸編碼、且具有與 多肽A等同的功能的多肽。
[0104] 本說明書中，"嚴(yán)格條件"是指形成所謂的特異性雜合體并且不形成非特異性雜合 體的條件。嚴(yán)格條件的實(shí)例包括如下的條件，在該條件下，高度同源的DNA彼此雜交，例如， 不低于80%同源的、優(yōu)選不低于90%同源的、更優(yōu)選不低于95%同源的、仍更優(yōu)選不低于 97%同源的、特別優(yōu)選不低于99%同源的DNA彼此雜交，并且同源性比上述低的DNA彼此不 雜交，或者典型Southern雜交的洗滌條件，即，在對(duì)應(yīng)于1 x SSC，0.1%SDS在60°C、優(yōu)選0.1 x SSC，0.1%SDS在60°C、更優(yōu)選0.1 x SSC，0.1%SDS在68°C的鹽濃度和溫度下洗滌1次、優(yōu) 選2或3次的條件。
[0105] 作為多肽A ( VN多肽）的變體，可以列舉出VB多肽，VB多肽氨基酸序列為 KGGPQVTRGDTYRAY(該多肽可以乙?；?，即Ac-KGGPQVTRGDTYRAY)。VB多肽是本發(fā)明人等設(shè)計(jì) 的人工多肽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有與VN多肽等同的功能，且在性能方面不弱于VN多肽。
[0106] 對(duì)于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的器件的功能而言，所述多肽A或其變體的分布密度應(yīng)為一定值 以上，例如為lyg/cm2以上，優(yōu)選為1 Oyg/cm2以上，更優(yōu)選為20yg/cm2以上，更優(yōu)選為30yg/ cm 2以上，更優(yōu)選為40iig/cm2以上。此外，對(duì)于所述多肽A或其變體的分布密度的上限沒有特 殊限制，從可操作性的角度考慮，可以是例如200yg/cm 2以下或150yg/cm2以下或100yg/cm2 以下或80iig/cm2以下或60iig/cm2以下。
[0107] 羧甲基殼聚糖含有氨基和羧基，其中的羧基可與多肽進(jìn)行接枝。羧甲基殼聚糖與 多肽的接枝可利用本技術(shù)領(lǐng)域已知的化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，例如聚多巴胺-羧甲基殼聚糖表面 浸入活化劑溶液(例如，20mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺和20mg/ml 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙 基碳二亞胺鹽酸鹽，pH = 5.6嗎啉乙磺酸緩沖液）中室溫反應(yīng)10~lOOOmin后，與0.1~ lOOmMVN多肽溶液4 °C過夜反應(yīng)，即可通過邁克爾加成和席夫堿反應(yīng)得到聚多巴胺-羧甲基 殼聚糖-VN多肽修飾的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)表面。
[0108] 此外，作為使多肽A或其變體的分布密度達(dá)到lyg/cm2以上的方法，多肽A的反應(yīng)溶 液濃度需在〇.25mM以上，優(yōu)選為ImM以上。
[0109] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽層還可包含具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化 的功能的化合物B，結(jié)合特定的培養(yǎng)基，可在成分明確條件下實(shí)現(xiàn)人多能干細(xì)胞體外定向誘 導(dǎo)分化。所述化合物B可以是多肽、蛋白質(zhì)、核酸或小分子化合物。對(duì)于所述化合物B和特定 培養(yǎng)基沒有特殊限制，只要其具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能即可。本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以根據(jù)定向分化的需要，選擇適宜的化合物B和定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基。例如：
[0110] (1)多肽層接枝BFP-1多肽，結(jié)合含有e-巰基乙醇，地塞米松和維生素C的aMEM培養(yǎng) 基，可定向誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞成骨向分化；
[0111] (2)多肽層接枝神經(jīng)生長因子NGF，結(jié)合添加100ng/ml rmNoggin的N2B27培養(yǎng)液， 可定向誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞為神經(jīng)前體細(xì)胞。進(jìn)一步，將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有神經(jīng)因子、 BDNF、⑶NF、CNTF、IGF1和cAMP的N2B27培養(yǎng)液中可定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞;或者將神經(jīng)前體 細(xì)胞接在聚左旋鳥氨酸基質(zhì)上，配合含有 DEME/F12培養(yǎng)液，可定向誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞。
[0112] 因此，本發(fā)明還提供一種促使人多能干細(xì)胞定向分化的方法，該方法包括步驟B: 使用定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基在本發(fā)明的器件表面培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。通過使用定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基在 本發(fā)明的器件表面培養(yǎng)人多能干細(xì)胞，可以促使人多能干細(xì)胞定向分化。這里，定向誘導(dǎo)培 養(yǎng)基是指具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分化的功能的培養(yǎng)基。何種定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠促進(jìn) 人多能干細(xì)胞向何種類型的細(xì)胞定向分化是本技術(shù)領(lǐng)域已知的。例如:含有巰基乙醇，地 塞米松和維生素C以及胎牛血清的aMEM培養(yǎng)基用于人多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;含有N2， BMP-4和RA的DMEM/F12培養(yǎng)基可促使人多能干細(xì)胞向牙相關(guān)上皮細(xì)胞定向分化等。
[0113]優(yōu)選地，上述促使人多能干細(xì)胞定向分化的方法，還可以包括步驟A:在所述步驟B 之前，使用能夠維持人多能干細(xì)胞自我更新的培養(yǎng)基培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。通過使用能夠維 持人多能干細(xì)胞自我更新的培養(yǎng)基培養(yǎng)人多能干細(xì)胞，能夠使人多能干細(xì)胞增殖。
[0114]使用定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人多能干細(xì)胞使其定向分化、以及使用能夠維持人多能 干細(xì)胞自我更新的培養(yǎng)基培養(yǎng)人多能干細(xì)胞使其增殖的常規(guī)的操作方式及培養(yǎng)條件是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本發(fā)明的促使人多能干細(xì)胞定向分化的方法中，除了使用本發(fā)明的 器件作為培養(yǎng)表面以外，可以適宜地采用這些常規(guī)的操作方式及培養(yǎng)條件。
[0115]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)定向分化的需要，選擇適宜的化合物B和定向誘導(dǎo)培養(yǎng) 基。列舉如下：
[0116] (1)多肽層接枝BFP-1多肽，結(jié)合含有巰基乙醇，地塞米松和維生素C的aMEM培養(yǎng) 基，可定向誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞成骨向分化；
[0117] (2)多肽層接枝神經(jīng)生長因子NGF，結(jié)合添加100ng/ml rmNoggin的N2B27培養(yǎng)液， 可定向誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞為神經(jīng)前體細(xì)胞。進(jìn)一步，將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有神經(jīng)因子、 BDNF、⑶NF、CNTF、IGF1和cAMP的N2B27培養(yǎng)液中可定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞;或者將神經(jīng)前體 細(xì)胞接在聚左旋鳥氨酸基質(zhì)上，配合含有 DEME/F12培養(yǎng)液，可定向誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞。
[0118] (3)本發(fā)明表面培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞，用含bFGF的MEF-CM培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3天。誘導(dǎo) 第一天時(shí)換為RPMI+B27培養(yǎng)基，并加入Activin A培養(yǎng)24h。第二天加入BMP 4和bFGF連續(xù)四 天不換液。隨后，換為含有50ng/ml VEGF165的RPMI+B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)可定向分化為心肌 細(xì)胞。
[0119] (4)本發(fā)明表面培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞，結(jié)合含有N2，BMP-4和RA的DMEM/F12培養(yǎng)基， 可定向誘導(dǎo)為牙相關(guān)上皮細(xì)胞。
[0120] (5)本發(fā)明表面培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞，在不同時(shí)期使用含有不同化合物的培養(yǎng)基 進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可定向誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞：第一階段，配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，RPMI/B27 (minus insulin)，添加細(xì)胞因子Activin A，培養(yǎng)3天;第二階段，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI/B27(complete with Insulin)，添加細(xì)胞因子BMP2和FGF4，培養(yǎng)4天；第三階段，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI/B27 (complete with Insulin)，添加細(xì)胞因子HGF和KGF，培養(yǎng)6天；第四階段，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 Hepatocyte Culture Media添加SingleQuots(without EGF)，并添加細(xì)胞因子 Oncostatin-M 培養(yǎng)8 天。
[0121] 對(duì)于所述化合物B的分布密度沒有特殊限制，只要能夠發(fā)揮促進(jìn)人多能干細(xì)胞定 向分化的功能即可，優(yōu)選至少為lyg/cm2以上，優(yōu)選為10yg/cm 2以上，更優(yōu)選為20yg/cm2以 上，更優(yōu)選為30yg/cm2以上，更優(yōu)選為40iig/cm 2以上。
[0122] 作為在羧甲基殼聚糖上接枝化合物B的方法，可以采用與接枝多肽A的方法相同的 方法。
[0123] 所述多肽可以適宜采用（1)化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來獲 得，其中化學(xué)合成更為簡便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者 半合成該多肽來進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽 可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽 固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。
[0124] 此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊(cè)子 TO2004/011653號(hào)所述的方法。即，可以這樣來生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的 氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出：具 有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處 理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0125] 特別是，多肽的化學(xué)合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，可以容易地委托專業(yè)的多肽合成公 司來合成所述多肽。
[0126] 器件的用途
[0127] 本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的器件在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途。
[0128] 在本說明書中，細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)是指下述(1)~(3)中的任意一項(xiàng)、任意兩項(xiàng)或全部：
[0129] (1)誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞，
[0130] (2)使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或
[0131] (3)使人多能干細(xì)胞長期自我更新。
[0132] 在本說明書中，人多能干細(xì)胞是指人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Hyman pluripotent stem cel Is, hiPSCs)和人胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cel Is, hESCs)。
[0133] 在本說明書中，人多能干細(xì)胞貼壁是指人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞能 夠貼附于經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)板表面，一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。
[0134] 在本說明書中，人多能干細(xì)胞自我更新是指人多能干細(xì)胞能夠通過對(duì)稱分裂產(chǎn)生 兩個(gè)與原細(xì)胞相同的細(xì)胞。在本說明書中，人多能干細(xì)胞長期自我更新是指人多能干細(xì)胞 在體外微環(huán)境體系中連續(xù)傳代培養(yǎng)超過20代仍維持多能性。
[0135] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的器件包含上述化合物B的情況下，本發(fā)明的 器件還可以用于促使人多能干細(xì)胞定向分化。
[0136] 在本說明書中，人多能干細(xì)胞定向分化是指人多能干細(xì)胞在相關(guān)因子的作用下， 細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生差異的過程。 實(shí)施例
[0137] 以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
[0138] 實(shí)施例1 PDA-CMC-VN器件的制備及表征
[0139] 以下制備的PDA-CMC-VN器件依次具備基底(細(xì)胞培養(yǎng)板表面）、聚多巴胺層、羧甲 基殼聚糖層和VN多肽層。
[0140] 將24克羧甲基殼聚糖加入含800ml純水的藍(lán)口瓶中，利用恒溫?cái)嚢杵髟?0°C和150 轉(zhuǎn)/分鐘條件下過夜攪拌，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CMC溶液。在經(jīng)中速濾紙粗濾后，于超凈工 作臺(tái)內(nèi)先后經(jīng)〇 ? 45wii和0 ? 22mi濾膜過濾后獲得無菌CMC溶液。將0 ? 2424克三羥甲基氨基甲 燒鹽酸鹽置入含200ml純水的燒杯中，用滴管攪拌均勻，然后用lmol/L鹽酸將溶液PH調(diào)為 8.5。將0.4克多巴胺粉末加入該緩沖液中，用滴管攪拌均勻。在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)0.22mi濾膜 過濾后，以每孔5ml體積加入康寧6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，封口膜封閉后置于37°C恒溫?fù)u床(70 轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)16h。在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)無菌純水沖洗3次后每孔加入5ml純水，Paraf i lm封口 膜封閉后超聲5min，再于超凈間內(nèi)用純水沖洗一次后每孔加入CMC溶液5ml，封口膜封閉后 置于37°C恒溫?fù)u床反應(yīng)70轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)24h。然后，超凈臺(tái)內(nèi)無菌純水沖洗3次，干燥后紫外 照射lh。
[0141] 在超凈工作臺(tái)將5mg VN多肽溶于3.1ml DPBS緩沖液中，獲得ImM VN多肽溶液。將 19.52克嗎啉乙磺酸溶于1000ml純水中，用玻璃棒攪拌均勻，然后用飽和氫氧化鈉溶液將pH 調(diào)至5.6.將0.8g N-羥基琥珀酰亞胺和0.8克1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 分別溶于20ml嗎啉乙磺酸緩沖液后混勻，在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)0.22mi濾膜過濾后，以每孔3ml 體積加入康寧6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中室溫反應(yīng)40min，無菌純水沖洗3次后每孔加入lml VN多肽 溶液，封口膜封閉后4°C過夜，再用無菌純水沖洗3次，得到聚多巴胺-羧甲基殼聚糖-VN多肽 修飾的細(xì)胞培養(yǎng)板。利用X射線光電子能譜(XPS)，接觸角和原子力顯微鏡(AFM)研究，細(xì)胞 培養(yǎng)板表面經(jīng)PDA-CMC-VN涂層修飾后的化學(xué)和形貌變化。
[0142] 另外，我們利用FITC熒光蛋白標(biāo)記的VN多肽(FITC-KGGPQVTRGDVFTMP)，對(duì)表面接 枝的VN多肽進(jìn)行定量研究。首先，避光條件下用乙腈與純水的1:1混合液配置0.2mM和2mM濃 度的FITC-VN溶液，然后在康寧96孔板中分別加入2ul 0.2mM，5ul0.2mM，lul 2mM，2ul 2mM， 4ul 2mM，8ul 2mM，16ul 2mM(每組4孔)后，在避光條件下自然干燥后，用全波長酶標(biāo)儀以激 發(fā)光488nm，吸收光538nm測(cè)量熒光值，建立熒光-密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，配置ImM FITC-VN溶 液，利用上述方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，純水清洗3次后在相同條件下測(cè)量熒光 值。
[0143] 如圖la所示，修飾之前，PS呈現(xiàn)典型的水接觸角值(86.36± 1.67°)，經(jīng)HM/CMC/VN 修飾后表面接觸角分別降低至61.54± 1.70°，41.48±7.16°和30.88±3.52°。我們利用原 子力顯微鏡測(cè)量了PS表面分別經(jīng)PDA/CMC/VN多肽修飾后的表面形貌變化。我們選擇了 lMi X lwii和5wnX 5wii兩個(gè)掃面范圍，AFM測(cè)量結(jié)果分別如圖lb所示。lwnX lwii結(jié)果顯示，PS未修 飾前的表面比較平滑(Ra = 4.83nm)，聚多巴胺修飾后，我們能夠在這些基體的表面見到典 型的聚多巴胺顆粒，Ra值也分別增加至5. Olnm，進(jìn)一步修飾CMC和VN多肽，我們發(fā)現(xiàn)表面的 Ra值均呈下降趨勢(shì)，并最終獲得非常平滑的表面(Ra = 2.20nm)。當(dāng)AFM掃面范圍擴(kuò)大至5mi X5wii時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了類似的AFM測(cè)量結(jié)果。該修飾過程進(jìn)一步利用XPS進(jìn)行表征（見圖lc-d)， 新出現(xiàn)的N元素峰證實(shí)PDA層的形成，Na元素峰和"C-N"鍵的出現(xiàn)說明CMC成功與PDA層共價(jià) 結(jié)合。最后，接枝VN多肽后，其所含肽鍵使得"C-N"含量增高。上述表征結(jié)果說明我們開發(fā)的 PDA-CMC-VN表面能夠共價(jià)結(jié)合至PS培養(yǎng)板表面。
[0144] 另外，我們測(cè)得？3-?04-011^11'(^柯_飾12孔板表面的熒光強(qiáng)度為399.695± 73.65291，根據(jù)96孔板標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果可知，表面VN多肽的接枝密度51.75 ± 9.53ug/cm2。
[0145] 實(shí)施例2 PDA-CMC-VN器件使人多能干細(xì)胞貼壁
[0146] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0147] H1和H9人胚胎干細(xì)胞由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院購買自WiCell研究所 后贈(zèng)送。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(人皮膚細(xì)胞來源的hNF-Cl，以及人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的UMC- Cl)均由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院以慢病毒重編程方法獲得后贈(zèng)送。這些人多能 干細(xì)胞系培養(yǎng)在鋪有Matrigel(BD Biosciences，Canada)的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基使用的是成 分明確的mTeSR?l (StemCel 1 Technologies，Canada)。細(xì)胞培養(yǎng)在條件為37°C，100 %濕度 and 5%C02的培養(yǎng)箱中。Matrigel用DMEM/F12在冰上以1:80稀釋后，以lml每孔體積加入6 孔板37 °C孵育lh以上。細(xì)胞每天換液，并每隔3-4天經(jīng)0.5mMEDTA37 °C消化4-5min以1:3比例 傳代。
[0148] PDA-CMC-VN修飾支持人多能干細(xì)胞在不同基體表面生長
[0149] 如上所述，制備接枝ImM VN多肽的PDA/VN和HM-CMC/VN修飾6孔培養(yǎng)板，同時(shí)利用 FITC標(biāo)記的熒光多肽進(jìn)行定量研究。用0.25%胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies, Canada)將hNF-ClhiPSCs消化為單細(xì)胞，然后以23500細(xì)胞/cm-2密度接種至H)A/VN和PDA-CMC-VN修飾6孔板中，并以預(yù)鋪有Matrigel的培養(yǎng)板作為對(duì)照。每天更換新鮮培養(yǎng)基至第四 天，利用CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Dojindo，Japan)測(cè)量每孔細(xì)胞數(shù)。每組含三個(gè)平行孔，每孔 吸光度值測(cè)量三次。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0150] 1.實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行。將CCK8試劑以1:10比例加入至mTeSRl培養(yǎng)基中，均勻 混合后每孔加入lml。
[0151] 2.置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)后，每孔吸取200ul轉(zhuǎn)至96孔板中，然后用全波長酶標(biāo) 儀(Model 680，Bio-Rad,Hercules，CA)測(cè)量吸光度值。
[0152] 另外，Matrigel上培養(yǎng)的hNF-Cl人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞經(jīng)EDTA消化后，以1:3比例傳至 PDA-CMC-VN修飾的不同基體（PS，玻璃，PDMS和T i )表面。培養(yǎng)4天后，用倒置顯微鏡 (01ympusCKX31SF, Japan)和正置金相顯微鏡（01ympusBX51M, Japan)觀察材料表面細(xì)胞形 貌。同時(shí)，收集細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量〇ct-4表達(dá)情況。細(xì)胞貼壁研究
[0153] 選擇H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-ClhiPSC，研究多肽濃度，消化方法和ROCK抑制劑Y-27632對(duì)人多能干細(xì)胞貼壁的影響。首先，PDA/CMC修飾6孔板經(jīng)NHS/EDC活化后，每孔加入 11111不同濃度的￥~多肽(0.251111，0.511^，0.751111 &11(111111)后4°(：過夜反應(yīng)。第二天，接枝多肽 后的培養(yǎng)板用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗三次，然后Matrigel上培養(yǎng)的HlhESC和hNF-Cl人誘導(dǎo)多 功能細(xì)胞經(jīng)〇. 25 % Trypsin/EDTA消化為單細(xì)胞，再以23500個(gè)細(xì)胞每平方厘米密度接種。同 時(shí)，以相同密度傳至Matrigel上作為對(duì)照。每天更換新鮮的培養(yǎng)基至第四天，然后用CCK8試 劑盒測(cè)量各孔細(xì)胞數(shù)。
[0154] 如前所述，以每孔lml體積將ImM VN加入活化后的TOA/CMC修飾培養(yǎng)板，制備PDA-CMC-VN表面用于后續(xù)人多能干細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-Cl人誘導(dǎo)多功能細(xì)胞 分別以單細(xì)胞或者克隆的形式(23500個(gè)細(xì)胞每平方厘米)接種至PDA-CMC-VN和Matrigel表 面，研究傳代方式對(duì)人多能干細(xì)胞貼壁和增殖的影響。同時(shí)，ROCK抑制劑Y-27632的作用也 進(jìn)行了研究，即一組添加5mM Y-27632,另一組不添加。每天更換新鮮的培養(yǎng)基至第四天，然 后用CCK8試劑盒測(cè)量各孔細(xì)胞數(shù)。
[0155] 上述實(shí)驗(yàn)每組包含3個(gè)平行孔，每孔CCK8試劑吸光度值測(cè)量3次。
[0156] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0157] 如圖2a所示，雖然熒光多肽實(shí)驗(yàn)證實(shí)有大量的VN多肽成功接枝到聚多巴胺表面， 但是沒有發(fā)現(xiàn)貼壁的H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-ClhiPSC，說明這種直接接枝的方式不可行。于 是，我們引入同時(shí)含有氨基和羧基的羧甲基殼聚糖，先共價(jià)接枝至聚多巴胺表面，然后通過 經(jīng)典的NHS/EDC反應(yīng)活化表面暴露的羧基，從而接枝VN多肽。有趣的是，雖然CMC的參入減少 了 VN多肽的接枝量，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)H1人胚胎干細(xì)胞和hNF-ClhiPSC均能夠很好地貼壁和生長 在PDA-CMC-VN修飾的培養(yǎng)板表面。
[0158] 選擇HlhESCs和hNF-ClhiPSCs，研究多肽濃度、消化方式和ROCK抑制劑Y-27632對(duì) PDA-CMC-VN修飾培養(yǎng)板表面人多能干細(xì)胞貼壁和增殖的影響。如圖2b所示，隨著VN多肽濃 度的增加，PDA-CMC-VN表面含有更多的VN多肽，hNF-ClhiPSCs的細(xì)胞數(shù)也隨著逐漸增加，但 HlhESCs的細(xì)胞數(shù)沒有顯著變化，且兩者均顯著低于Matrigel對(duì)照組(p〈0.01)。該結(jié)果說 明，要想實(shí)現(xiàn)hPSCs在TOA-CMC-VN表面的長期培養(yǎng)和擴(kuò)增，多肽的分布密度應(yīng)為一定以上。 我們進(jìn)一步研究了 H)TA消化方式和ROCK抑制劑Y-27632對(duì)hPSCs貼壁和生長的促進(jìn)作用。無 論是以單細(xì)胞或者克隆方式消化，Y-27632的加入均能夠顯著增加在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)4 天的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs的細(xì)胞數(shù)量(p〈0.05)。然而，在Matrigel表面，單細(xì)胞或者克 隆，Y-27632的促進(jìn)作用對(duì)于HlhESCs比較顯著，而對(duì)于hNF-ClhiPSCs則不明顯。此外，無論 是否增加Y-27632，在TOA-CMC-VN表面生長四天后，我們發(fā)現(xiàn)以克隆形式接種的HlhESCs和 hNF-ClhiPSCs的細(xì)胞數(shù)，明顯多于以單細(xì)胞接種者(p〈0.05)。我們驚喜的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合EDTA消 化方式和Y-27632，hNF-ClhiPSCs在PDA-CMC-VN表面生長四天后的細(xì)胞數(shù)與Matrigel相近。
[0159] 實(shí)施例3 PDA-CMC-VN器件誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞
[0160] 人尿液細(xì)胞重編程為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究 院進(jìn)行。首先，我們成功從一名男性帕金森患者尿液中，純化獲得尿液細(xì)胞。然后利用電穿 孔儀（AmaxaNucleofector 11，Lonza，Switzerland)按照操作手冊(cè)，將同時(shí)編碼0ct_4 (P0U5Fl)，Sox-2，SV40LT，Klf-4的非整合型附著體載體和MicroRNA MIR302-367轉(zhuǎn)進(jìn) 150萬 尿液上皮細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至3孔TOA-CMC-VN修飾6孔板中，用添加有丁酸鈉的E7培 養(yǎng)基(Stem Cell)培養(yǎng)，隔天換液。在轉(zhuǎn)染后的第14天，將培養(yǎng)基換成mTeSRUStem Cell)， 繼續(xù)培養(yǎng)至第18天后挑取克隆。在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)至第16代后，利用核型、流式細(xì)胞 術(shù)、免疫熒光、體外擬胚體和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)所獲得的roUE0304hiPSCs的多能性進(jìn)行鑒定。
[0161] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:重編程至第8天即有少量胚胎干細(xì)胞樣人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞克隆，出現(xiàn)在 PDA-CMC-VN表面(見圖3b)。繼續(xù)誘導(dǎo)至第18天，表面有許多典型的胚胎干細(xì)胞樣人誘導(dǎo)多 能干細(xì)胞克隆，我們挑取一個(gè)克隆至Matrigel表面(見圖3c，e)。如圖3d示，在PDA-CMC-VN表 面培養(yǎng)至P16的PDUE0304hiPSCs呈現(xiàn)典型的未分化克隆形貌，且核型完整（見圖3f)。定量 RT-PCR證實(shí)細(xì)胞表達(dá)干性基因Oct-4，Nanog和Sox-2，而不表達(dá)分化基因Rex-1 (見圖3g)。流 式和免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)〇(^-4,33￡4-3&11(11> &-160等全能型標(biāo)志物（見圖311-i)。此外，體外擬胚體和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PDUE0304hiPSCs具備三胚層分化能力（見圖 3 j-k)。這些結(jié)果證實(shí)，我們開發(fā)的PDA-CMC-VN器件能夠支持人體細(xì)胞重編程。據(jù)我們所知， 該實(shí)驗(yàn)是首次報(bào)道多肽修飾表面能夠在成分明確條件下，將人體細(xì)胞重編程為人誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞，勢(shì)必將促進(jìn)人工合成表面在人多能干細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0162] 實(shí)施例4 PDA-CMC-VN器件使人多能干細(xì)胞長期自我更新
[0163] 人多能干細(xì)胞系長期自我更新
[0164] 培養(yǎng)在Matrigel上的人胚胎干細(xì)胞（H1，H9)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（hNF-Cl， GZC2F6和UMC-C1)，經(jīng)0.5mM EDTA 37°C條件下消化4分鐘后，用含有5_ Y-27632的 mTeSR?l培養(yǎng)基將克隆吹打下來，并以1:3傳至PDA-CMC-VN修飾的6孔板中。第二天，更換為 不含Y-27632的培養(yǎng)基并每天換液。同時(shí)，每天用倒置顯微鏡(01ympusCKX41，Japan)觀察細(xì) 胞的形態(tài)，如發(fā)現(xiàn)有分化或異常的克隆，標(biāo)記后在生物安全柜內(nèi)用負(fù)壓吸引器(YX932D， China)吸除。根據(jù)克隆的大小和密度，細(xì)胞每隔3-5天經(jīng)EDTA消化后傳代至新的PDA-CMC-VN 修飾6孔板中。
[0165] 定量RT-PCR檢測(cè)
[0166] 細(xì)胞用TRiZol提取RNA，繼而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA，最后定量檢測(cè)Oct-4， Nanog，Sox-2和Rex-1的表達(dá)量，以ACTB作為對(duì)照基因，各基因引物見序列見表1。
[0167] 表1.干性檢測(cè)基因引物序列
[0169] 免疫熒光檢測(cè)
[0170] 人胚胎干細(xì)胞(HI，H9)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(hNF-Cl和UMC-C1)在H)A-CMC-VN表 面連續(xù)傳至P20時(shí)，利用免疫熒光檢測(cè)多能性標(biāo)記物Oct-4和SSEA-3表達(dá)情況。免疫熒光實(shí) 驗(yàn)在12孔板中進(jìn)行，具體檢測(cè)步驟介紹如下：
[0171] 1)吸盡人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基，用DPBS洗一次，加入lml 4%多聚甲酵室溫
[0172] 固定30分鐘。
[0173] 2)吸去固定液，DPBS洗3次，每次在搖床上輕搖2min;
[0174] 3)加入lml 0.2%!>^〇111100(51811^，]\^88〇虹1，1]5八）室溫通透30111111，然后0?85 洗三次，每次在搖床上輕搖2min;
[0175] 4)再利用 1ml 3%BSA(Aladdin，Shanghai，China)溶液室溫封閉2小時(shí)；
[0176] 5)用 3%BSA與0.2%Triton-X100 的等比例混合液，以1:50 配制一抗(]?〇1186 411衍-0ct_3/4IgG to Hyman(sc-5279);Mouse Anti-SSEA_3IgM to Hyman(abl6286))，每孔加 200ul，然后再覆蓋上比孔略小的封口膜，把培養(yǎng)板放到有水的針盒(濕盒)里4°C過夜；
[0177] 6)第二天用彎的針尖挑走封口膜，吸走一抗，PBS洗三次，每次在搖床上輕搖5min;
[0178] 7)以下避光操作。用DPBS以 1: 500比例稀釋二抗（Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488IgG(Molecular Probes，Invitrogen,USA)和Goat Anti-mouse Alexa Fluor 488IgM (Molecular Probes，Invitrogen,USA))，然后每孔加入400ul反應(yīng)lh;
[0179] 8)DPBS洗三次，每次在搖床上輕搖5min。用DPBS以1:5000比例稀釋DAPI后，每孔加 入500ul室溫染色5min;
[0180] 9)DPBS洗一次后加入新DPBS,利用尼康Eclipse E800顯微鏡或者蔡司 Axi〇vert200M倒置共聚焦顯微鏡觀察和拍照。DAPI和綠色熒光標(biāo)記抗體的激發(fā)波長分別是 405nm和488nm。
[0181]流式細(xì)胞術(shù)分析
[0182] 2個(gè)人胚胎干細(xì)胞系（H1，H9)和2個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（hNF-Cl和UMC-C1))在 PDA-CMC-VN表面連續(xù)傳至P20時(shí)，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其多能性標(biāo)記物Oct-4，SSEA-3和 Tra-160陽性表達(dá)率。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：
[0183] 1)待處理細(xì)胞通過0.25%胰酶/EDTA(Stem Cell Technologies,Canada)培養(yǎng)箱 內(nèi)消化4分鐘，加入含血清培養(yǎng)基終止并吹打成單細(xì)胞;2)200g離心5分鐘，用lml流式緩沖 液(含2%FBS的DPBS)重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，加入200ul 1 %多聚甲醛37°C固定5分 鐘后200g離心5分鐘。
[0184] 3)用流式緩沖液重懸細(xì)胞，200g離心后加入200ul冰上預(yù)冷的90%甲醇，置冰上通 透30分鐘。200g離心5分鐘后，流式緩沖液洗2次。
[0185] 4)用流式緩沖液按 1:100比例稀釋Oct-3/4-抗(01550，StemCell Technologies, Canada)。以100ul-抗溶液重懸細(xì)胞，并在培養(yǎng)箱中孵育SOminJOOg離心5分鐘，用流式緩 沖液洗1次。步驟3-4適于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物Oct-4檢測(cè)，細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA-3和Tra-160無需 此操作；
[0186] 5)以下避光操作。用流式緩沖液按1:500比例稀釋Oct-4二抗，以200ul體積重懸并 在培養(yǎng)箱中孵育30min。同時(shí)，用流式緩沖液按1:100比例稀釋SSEA-3(60061PE，StemCell Technologies，Canada)和Tra-160(60064PE，StemCe 11 Technologies，Canada)直標(biāo)抗體， 以lOOul溶液重懸細(xì)胞，并在培養(yǎng)箱中孵育30min。孵育結(jié)束后，200g離心5分鐘。
[0187] 6)流式緩沖液洗1次后，用600ul流式緩沖液洗重懸細(xì)胞。過濾后，用BD FACS Ca 1 ibur System(LSRFortessa，USA)檢測(cè)并通過F1 owj〇軟件分析干性因子表達(dá)情況。
[0188] 4.4核型
[0189] 5個(gè)人多能干細(xì)胞系在PDA-CMC-VN修飾6孔板上傳過20代后，回傳至預(yù)鋪有 Matrigel的10cm培養(yǎng)皿進(jìn)行核型檢測(cè)。待細(xì)胞生長到75%-85%密度，按50yg ? mr1濃度加 入秋水仙素（Dahui Biotech, China)并在培養(yǎng)箱內(nèi)處理lhdPBS潤洗2遍后，用0.25 % Trypsin/EDTA消化為單細(xì)胞。200g離心5分鐘后棄上清，用8ml 37°C預(yù)熱的0.075mol/LKCl 溶液重懸細(xì)胞，然后置于37°C水浴中反應(yīng)20分鐘。然后，加入2ml新鮮配制的卡諾固定液（甲 醇:冰醋酸3:1)并繼續(xù)處理10分鐘。細(xì)胞固定完成后，200g離心5分鐘，用冰浴過的固定液重 懸細(xì)胞并制片。最后用BX51顯微鏡(Olympus Japan)觀察染色體的排列。
[0190] 擬胚體形成實(shí)驗(yàn)
[0191] 在？04-011(^^上傳過20代的1111^508和11嚦-(：1111?508，當(dāng)生長至培養(yǎng)板約70%面 積時(shí)，用lmg ? ml^Dispase消化7分鐘。DMEM/F12培養(yǎng)基清洗3次后，加入EB培養(yǎng)基(DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基含20 %牛血清白蛋白，2mM L-glutaMax，1 % (wt/vo 1)NEAA，0. lmMP-巰基乙醇） 并將細(xì)胞克隆機(jī)械刮脫，然后轉(zhuǎn)至低黏附6孔培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)8天。根據(jù)細(xì)胞情況添加培 養(yǎng)基或2-3天換液。然后將擬胚體轉(zhuǎn)至PDA-CMC-VN貼壁培養(yǎng)8天，并隔天換液。最后用Trizol 裂解細(xì)胞，提取總RNA后，熒光定量PCR檢測(cè)三胚層標(biāo)志性基因的表達(dá)情況（引物見表2)，與 未分化的人多能干細(xì)胞進(jìn)行比較。
[0192] 表2.擬胚體三胚層鑒定引物序列
[0195] 畸胎瘤生成檢測(cè)
[0196] 在PDA-CMC-VN上傳過20代的HlhESC和hNF-ClhiPSC回傳至Matrigel上培養(yǎng)，以用 于畸胎瘤生成實(shí)驗(yàn)。將待注射細(xì)胞經(jīng)Dispase消化后，用1:80稀釋的Matrigel重懸，然后以 一百萬細(xì)胞量立即對(duì)N0D-SCID小鼠進(jìn)行皮下注射，并做好標(biāo)記。當(dāng)有畸胎瘤形成并成長至 直徑lcm時(shí)，處死小鼠，約6-8周后，一般即會(huì)有畸胎瘤長出。取出畸胎瘤，切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡觀察尋找三個(gè)胚層典型的細(xì)胞。
[0197] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0198] 選擇2個(gè)人胚胎干細(xì)胞系H1和H9,以及2個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系hNF-Cl和UMC-C1， 在roA-CMC-VN表面連續(xù)傳代超過20代，以判斷該表面是否能夠支持人多能干細(xì)胞的長期自 我更新。在TOA-CMC-VN表面培養(yǎng)的4個(gè)人多能干細(xì)胞系，在傳至P20時(shí)均保持完整的核型(見 圖4a)。流式結(jié)果顯示，對(duì)于這4個(gè)人多能干細(xì)胞系，細(xì)胞多能性標(biāo)志物Oct-4，SSEA-3和Tra-160的陽性表達(dá)率均分別超過99.4%，82.6%和96.4% (見圖4b，左圖）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一 步證實(shí)這些細(xì)胞克隆均高表達(dá)多能性標(biāo)志物〇ct-4和SSEA-3(見圖4b，右圖）。
[0199] 我們通過擬胚體形成和畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在 PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)超過20代后仍保持多能性。PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs，經(jīng)懸浮和貼壁培養(yǎng)各8天后提取細(xì)胞總RNA，q_PCR結(jié)果證實(shí)HlhESCs和hNF-ClhiPSCs在H)A-CMC-VN表面形成的擬胚體均表達(dá)三胚層基因（見圖5a-b)。此外，這些細(xì)胞 在注射入裸鼠皮下6-8周后形成了畸胎瘤，且包含來源于三胚層的組織(見圖5c)。這些結(jié)果 證實(shí)長期培養(yǎng)在PDA-CMC-VN表面的HlhESCs和hNF-ClhiPSCs仍保持多向分化能力。
[0200] 實(shí)施例5 PDA-CMC-VN器件支持人多能干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞和心肌樣細(xì)胞定向分 化
[0201] H9hESCs在roA-CMC-VN表面連續(xù)傳代至第 15時(shí)，利用STEMdiff neural system (Stem Cell Technologies,Canada)，并按照說明書步驟進(jìn)行神經(jīng)向誘導(dǎo)分化;另外，我們 參照文南犬報(bào)道的方法(Yang，L.etal .Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.Nature、2008、453、524_528.)進(jìn) 行了 H9hESCs向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)，除第0，1和4天所用培養(yǎng)基如下所示之外，所有實(shí)驗(yàn)方 法與文獻(xiàn)報(bào)道相同：第0天培養(yǎng)基：Stempr〇-34SFM10640medium，Glutamin(100X), transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml) ,BMP4(0 ? 05ng/ml) ,Y27632( lOug/ml)。第1天培養(yǎng)基： Stempr〇-34SFM 10640medium,Glutamin(100X),bFGF(6ng/ml),Activin A(2.5ng/ml), ascorbic acid(50ug/ml) ,BMP4( lOng/ml)。第4天培養(yǎng)基：Stempr〇-34SFM 10640medium, Glutamin(10OX),transferrin(0.15mg/ml),1-thioglycerol(6.5ul/ml in 500ml medium,3ul/ml of backbone),ascorbic acid(50ug/ml),Y27632(lOug/ml),SB431542 (10nM)〇
[0202]定向分化形成的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，通過免疫熒光染色 檢測(cè)是否表達(dá)相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。所選用的神經(jīng)特異性抗體為S0X-1(R&D AF3369，USA)， Nestin(R&D MAB1259，USA)，MAP-2(Millpore AB5622，USA)和厶11衍-0-1\113111111111(1'耵-1，Sigma-Aldrich T3952，USA);心肌細(xì)胞特異性抗體為a-actinin(Abcam AB9465，United Kingdom)和0_myosin(R&D MAB4470，USA)〇 [0203]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0204] 在PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)的第15代H9hESCs，利用AggreWell?800板形成均一的擬胚 體（圖6a)，，并在成分明確條件下分別分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。H9hESCs在神經(jīng)誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中誘導(dǎo)至第14天后形成神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)（圖6b)，且陽性表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記物Sox-1和 Nestin(圖6d)，說明成功誘導(dǎo)成為神經(jīng)前體細(xì)胞。與此同時(shí)，我們挑取神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)在 神經(jīng)玫瑰花環(huán)選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天出現(xiàn)典型的神經(jīng)元形貌（圖6c)，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證 實(shí)陽性表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2和TUJ-1 (圖6e)，說明成功分化為神經(jīng)元細(xì)胞。此外， H9hESCs形成的擬胚體在H)A-CMC-VN表面誘導(dǎo)16后形成跳動(dòng)的心肌細(xì)胞（圖6f)，且這些細(xì) 胞表達(dá)心肌標(biāo)記物a-actinin和0-11^〇8；[11。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明？0纟-0110'\^表面支持11￡308在 成分明確條件下定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。
[0205] 實(shí)施例6實(shí)施例6PDA-CMC-VN ? BFP-1器件促進(jìn)人多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化
[0206] PDA-CMC-VN ? BFP-1器件的制備和表征
[0207] TOA-CMC修飾細(xì)胞培養(yǎng)板的制備如前所述，在超凈工作臺(tái)將5mg VN多肽溶于3.1ml PBS緩沖液中，獲得ImM。將5mg BFP-1多肽溶于3.0ml PBS緩沖液中，獲得ImM BFP-1多肽溶 液。將已制備的VN和BFP-1多肽溶液按照體積比10:0，7:3和5:5混合，得到VN1Q/BFP-1 Q(簡稱 VN)、VN7/BFP-13(簡稱7 : 3)和VN5/BFP-15 (簡稱5 : 5)三組多肽混合液。然后利用如前所述 NHS/EDC活化方法得到PDA-CMC-VN/BFP-1多肽混合修飾的細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0208] 我們利用FITC熒光蛋白標(biāo)記的VN多肽以及用羅丹明標(biāo)記的BFP-1多肽（Rho-KGGQGFSYPYKAVFSTQ)對(duì)表面接枝的VN和BFP-1多肽進(jìn)行多肽接枝情況的定量研究。首先，避 光條件下用無菌的PBS溶液分別配置0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1. OmM以及1.2mM濃度梯度 的FI TC-VN和Rho-BFP-1多肽溶液，然后在康寧24孔板中分別加入200u 1的多肽梯度液(每組 3個(gè)副孔）。用全波長酶標(biāo)儀以激發(fā)光488nm，吸收光525nm測(cè)量VN多肽熒光值，以激發(fā)光 532nm，吸收光582nm測(cè)定BFP-1多肽熒光值，建立熒光-密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，配置VN1Q/BFP-1〇(簡稱VN)、VN7/BFP-1 3(簡稱7:3)和VN5/BFP-15(簡稱5:5)三組熒光多肽混合液。利用上述 方法接枝至活化后的PS-PDA-CMC表面，純水清洗3次后在相同條件下測(cè)量熒光值。
[0209] 人多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化
[0210] 在 Matrigel 表面培養(yǎng)的 H9hESCs(代數(shù)為 30-50 代）及UMC-ClhiPSCs(代數(shù)為 30-45 代），用Acutase酶消化成單細(xì)胞，然后接種至材料表面(VN組，7:3組及5: 5組）。在mTESRl中 加入ROCK抑制劑(Y-27632)促進(jìn)單細(xì)胞貼壁。12h后大部分的細(xì)胞已完全貼壁，此時(shí)更換為 不含ROCK抑制劑(Y-27632)的mTESRl培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1天后，更換mTESRl培養(yǎng)基為成骨誘 導(dǎo)培養(yǎng)基(a-MEM培養(yǎng)基含10%的FBS，5μg/ml的維生素C(AA)，10mM的甘油磷酸鈉(0-GP) 及10_ 8M的地塞米松），每2天更換培養(yǎng)基至28天。在培養(yǎng)到第28天的細(xì)胞培養(yǎng)板中，冰roS沖 洗三遍后加入4%的多聚甲醛固定30min。每孔加入lml 2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)茜素紅水溶液(pH = 4.2)反應(yīng)20min，蒸餾水多次沖洗后通過倒置光相差顯微鏡下拍攝鈣結(jié)節(jié)的染色情況。然 后，在每孔中加入500ul的1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)十六烷基吡啶溶液，反應(yīng)完全后每孔吸取100ul的上 清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，每組做3個(gè)副孔，在全波長酶標(biāo)儀中用490nm的波長測(cè)定吸光度， 從而定量鈣結(jié)節(jié)的形成量。
[0211] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0212] 不同多肽混合接枝的表面，熒光強(qiáng)度都較為均勻，證實(shí)我們構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)較為 均一的材料表面（圖7a)。定量測(cè)量結(jié)果顯示（圖7b)，從VN組，到7:3組及5:5組，綠色熒光強(qiáng) 度逐漸降低(代表VN多肽的接枝量逐漸降低），紅色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(代表BFP-1多肽的接 枝量逐漸增加），說明多肽按照預(yù)設(shè)的比例接枝在材料表面，熒光定量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)多 肽的混合接枝比例。
[0213]圖7c顯示了成骨誘導(dǎo)28天后，各組的茜素紅定性染色和定量測(cè)定結(jié)果。通過28天 的成骨誘導(dǎo)，VN組，7:3組和5: 5組表面培養(yǎng)的H9hESCs及UMC-ClhiPSCs均有鈣結(jié)節(jié)形成，且 隨著BFP-1成骨多肽的含量增加，鈣結(jié)節(jié)的形成量逐漸增加。定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，成骨多 肽的確對(duì)干細(xì)胞的成骨起到促進(jìn)的作用，但是不同的細(xì)胞系表現(xiàn)有一定的差異，H9hESCs較 UMC-ClhiPSCs成骨效果更好。
[0214] 實(shí)施例7 PDA-CMC-VB多肽器件支持人多能干細(xì)胞長期自我更新
[0215]將上述PDA-CMC-VN器件中的VN多肽換成我們課題組設(shè)計(jì)和篩選的VB多肽，其他實(shí) 驗(yàn)條件不變，重復(fù)上述實(shí)施例1~5。
[0216] 圖8顯示了在EDTA消化和添加ROCK抑制劑Y-27632條件下，PDA-CMC-VB和PDA-CMC- VN表面在支持HlhECSs和hNF-ClhiPSC貼壁和增殖方面的性能類似。首先，VB除在0.125mM濃 度條件下HlhECSs培養(yǎng)至第四天的細(xì)胞量少于VN外(p〈0.05)，其它接枝多肽濃度(0.25mM， 0.5mM，ImM)時(shí)，PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面培養(yǎng)四天的HlhECSs和hNF-ClhiPSC細(xì)胞量相 近(圖8a)。另外，我們也看到，隨著多肽濃度的升高，第四天材料表面的細(xì)胞量也逐漸增加， 說明較高的多肽濃度是必需的，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)VB和VN的濃度均為ImM。然后，96h生長曲線實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，HlhECSs和hNF-ClhiPSC在PDA-CMC-VB和PDA-CMC-VN表面的增殖速度幾乎相同（圖 8b)。為了進(jìn)一步比較VB和VN的促人多能干細(xì)胞貼壁性能，我們研究了消化方式和細(xì)胞接種 密度的影響。圖8c顯示，在單細(xì)胞接種條件下，hNF-ClhiPSC在PDA-CMC-VB表面生長至第四 天的細(xì)胞量顯著高于H)A-CMC-VN表面(p〈0.01)，說明VB多肽較VN多肽更適合hiPSC單細(xì)胞 培養(yǎng)。在6250-100000細(xì)胞? cm2接種密度范圍內(nèi)，HlhECSs和hNF-ClhiPSC在roA-CMC-VB和 PDA-CMC-VN表面的貼壁24h的細(xì)胞量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖8d)。這些結(jié)果說明我們?cè)O(shè)計(jì)和篩 選獲得的VB多肽可以替代VN多肽用于人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0217] 然后，圖9和圖10說明5個(gè)人多能干細(xì)胞系（HlhESCsjghESCsJNF-ClhiPSCsJMC-ClhiPSCs 和 ipsN004hiPSCs) 在 HM-CMC-VB 表面連續(xù)傳代 20 代后仍維持多能性。圖 11顯示 H9hESCs，iPSN004hiPSCs和VBUE hiPSCs三個(gè)人多能干細(xì)胞系均能夠在roA-CMC-VB表面定 向分化為神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。
[0218]還需要說明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中 作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用 于其它技術(shù)方案;并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案 的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來構(gòu)成其它技術(shù)方案。本 發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本 說明書中。
[0219] 以上通過【具體實(shí)施方式】和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理 解的是，這些并非意圖對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，本發(fā)明的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書確定。
[0220] 工業(yè)實(shí)用性
[0221 ]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種可用于細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的器件。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種器件，其包括： 基底， 連接于所述基底上的聚多巴胺層， 連接于所述聚多巴胺層上的羧甲基殼聚糖層，以及 連接于所述羧甲基殼聚糖層上的多肽層； 其中，所述多肽層包含下述多肽A或其變體多肽； 多肽A:由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的多肽， 變體多肽是指： (1) 由在多肽A的氨基酸序列中發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而 得的氨基酸序列組成、且具有與多肽A等同的功能的多肽， (2) 由與多肽A的氨基酸序列具有70%以上氨基酸同源性的氨基酸序列組成、且具有與 多肽A等同的功能的多肽，或者 (3) 由在嚴(yán)格條件下與編碼多肽A的氨基酸序列的核酸雜交的核酸編碼、且具有與多肽 A等同的功能的多妝。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的器件，其中，所述多肽層中所述多肽A的分布密度是1~200yg/ cm2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的器件，其中，"與多肽A等同的功能"是指能夠調(diào)控人多能干細(xì) 胞的行為，所述人多能干細(xì)胞是人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或人胚胎干細(xì)胞，調(diào)控人多能干細(xì)胞的 行為是指： (1) 誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞， (2) 使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或 (3) 使人多能干細(xì)胞長期自我更新。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的器件，其中，所述多肽A的變體多肽是VB多肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的器件，其中，所述多肽層還包含具有促進(jìn)人多能干細(xì)胞定向分 化的功能的化合物B。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的器件，其中，所述多肽層中所述化合物B的分布密度是1~200μ g/cm2 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的器件，其中，所述化合物Β是BFP-1多肽。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的器件在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中的用途，其中，所述細(xì)胞 體外實(shí)驗(yàn)包括： (1) 誘導(dǎo)人體細(xì)胞重編程為人多能干細(xì)胞， (2) 使人多能干細(xì)胞貼壁，和/或 (3) 使人多能干細(xì)胞長期自我更新。9. 根據(jù)權(quán)利要求5~7中任一項(xiàng)所述的器件在促使人多能干細(xì)胞定向分化中的用途。10. -種促使人多能干細(xì)胞定向分化的方法，該方法包括： 步驟B:使用定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基在權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的器件表面培養(yǎng)人多能干 細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK105820951SQ201510903953
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月9日
【發(fā)明人】魏世成, 周平, 張曉紅, 李永亮, 王夢(mèng)珂
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院