一種動物雙歧桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物雙歧桿菌，其中，所述動物雙歧桿菌屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.9273。本發(fā)明還公開了所述的動物雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用不包括治療人體或動物體的疾病。本發(fā)明提供的動物雙歧桿菌能夠增加腸道中梭菌屬Cluster I亞屬產(chǎn)丁酸梭菌、雙歧桿菌和乳桿菌中的至少一種有益菌的數(shù)量，并且能夠降低腸道中擬桿菌和/或大腸桿菌的數(shù)量，因此可以有效的增加腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量，保證機(jī)體的健康。
CGMCC No. 9273
2014.06.05
【專利說明】一種動物雙歧桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis)及其應(yīng)用，具體地，涉及一種動物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis)，該動物雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道菌群以及在制備調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物和/或 食品中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人體腸道內(nèi)的微生物中，超過99 %都是細(xì)菌，存活著數(shù)量大約有100兆個， 500-1000個不同的種類。這些數(shù)目龐大的細(xì)菌大致可以分為三個大類：有益菌、有害菌和 中性菌。
[0003] 有益菌，也稱之為益生菌，主要是各種雙歧桿菌、乳酸桿菌等，是人體健康不可缺 少的要素，可以合成各種維生素，參與食物的消化，促進(jìn)腸道蠕動，抑制致病菌群的生長，分 解有害、有毒物質(zhì)等。有害菌，數(shù)量一旦失控大量生長，就會引發(fā)多種疾病，產(chǎn)生致癌物等有 害物質(zhì)，或者影響免疫系統(tǒng)的功能。中性菌，即具有雙重作用的細(xì)菌，如大腸桿菌、腸球菌 等，在正常情況下對健康有益，一旦增殖失控，或從腸道轉(zhuǎn)移到身體其他部位，就可能引發(fā) 許多問題。
[0004] 人體的健康與腸道內(nèi)的益生菌群結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。腸道菌群在長期的進(jìn)化過程中， 通過個體的適應(yīng)和自然選擇，菌群中不同種類之間，菌群與宿主之間，菌群、宿主與環(huán)境之 間，始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)中，形成一個互相依存，相互制約的系統(tǒng)，因此，人體在正常情況 下，菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，對宿主表現(xiàn)為不致病。有研究指出，體魄強(qiáng)健的人腸道內(nèi)有益菌的 比例達(dá)到70 %，普通人則是25 %，便秘人群減少到15 %，而癌癥病人腸道內(nèi)的益生菌的比 例只有10%。
[0005] 因此，通過調(diào)節(jié)人體腸道菌群以使有益菌保持在較高的水平上，能夠使人們更加 健康的生活。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能的動物雙歧桿菌。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種動物雙歧桿菌，其中，所述動物雙 歧桿菌屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis),保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9273。
[0008] 第二方面，本發(fā)明還提供了如上所述的動物雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用， 其中，所述應(yīng)用不包括治療人體或動物體的疾病。
[0009] 本發(fā)明提供的動物雙歧桿菌能夠增加腸道中梭菌屬Cluster I亞屬產(chǎn)丁酸梭菌、 雙歧桿菌屬和乳桿菌屬中的至少一種有益菌的數(shù)量，并且能夠降低腸道中擬桿菌和/或大 腸桿菌的數(shù)量，因此可以有效的增加腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量，保證機(jī)體的健康。
[0010] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0011] 生物保藏
[0012] 本發(fā)明的動物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis)，于 2014年6月5日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮 寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 9273。

【具體實施方式】
[0013] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0014] -方面，本發(fā)明提供了一種動物雙歧桿菌，其中，所述動物雙歧桿菌屬于動物雙歧 桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis),保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9273。
[0015] 本發(fā)明的動物雙歧桿菌分離自健康人群個體的糞便樣品。
[0016] 本發(fā)明提供的動物雙歧桿菌經(jīng)過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量動物雙歧桿菌的活菌體，所 述培養(yǎng)的方法沒有特別的要求，只要是能使所述動物雙歧桿菌增殖即可，例如可以按照 10 7CFU/mL的接種量將所述動物雙歧桿菌的菌株接種于雙歧桿菌培養(yǎng)基中，并且在厭氧條 件下，在15-38°C的溫度下培養(yǎng)8-72小時后，得到培養(yǎng)液。所述雙歧桿菌的培養(yǎng)基可以為本 領(lǐng)域公知的各種適合雙歧桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，例如可以為乳汁和/或《乳酸菌--生物學(xué) 基礎(chǔ)及應(yīng)用》（楊潔彬，輕工業(yè)出版社，1996年出版）中所述的乳酸菌培養(yǎng)基（MRS)。
[0017] 本發(fā)明可以進(jìn)一步分離上述培養(yǎng)液中的動物雙歧桿菌的活菌體，所述分離的方法 沒有特別的限制，只要是能從培養(yǎng)液中富集菌體即可，例如可以通過離心和/或過濾的方 法實現(xiàn)，所述離心和所述過濾的條件可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件，本發(fā)明在此不再 贅述。
[0018] 第二方面，本發(fā)明還提供了如上所述的動物雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用， 其中，所述應(yīng)用不包括治療人體或動物體的疾病。
[0019] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的動物雙歧桿菌在基本不改變腸道菌群總數(shù)量 的情況下，能夠有效地提高腸道中有益菌，例如，16S rRNA Cluster I亞屬（產(chǎn)丁酸梭菌）、 雙歧桿菌屬和乳桿菌屬中的一種或多種的數(shù)量，降低腸道中有害菌，例如，擬桿菌的數(shù)量， 還能夠降低腸道中中性菌，例如，大腸桿菌的數(shù)量，而對于其它菌群，例如，奇異菌屬、柔嫩 梭菌群等的數(shù)量沒有顯著的影響。從而發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的動物雙歧桿菌能夠有效地調(diào)節(jié) 腸道菌群，保證機(jī)體健康。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，如上所述的，當(dāng)因腸道菌群失調(diào)而導(dǎo)致機(jī)體疾病時，使用本發(fā)明的動 物雙歧桿菌進(jìn)行該疾病的治療并不在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述應(yīng)用包括制備調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物和/或食品。
[0022] 本發(fā)明中，所述食品可以是任意類型的食品，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食 品也可以根據(jù)食用對象的不同而有所不同。所述食品中還可以含有常規(guī)的添加劑，例如香 料、礦物質(zhì)、維生素、穩(wěn)定劑、增稠劑、防腐劑等。另外，所述藥物可以根據(jù)給藥途徑的不同而 制備成不同的形式，例如，可以制備成散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等 形式，所述藥物中還可以包括藥學(xué)上可接受的佐劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同的劑型 選擇不同的佐劑，本發(fā)明在此不再詳細(xì)贅述。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，在所述藥物和/或食品中含有如上所述動物雙歧桿菌的活菌體和/ 或死菌體作為活性成分。優(yōu)選地，含有所述動物雙歧桿菌的活菌體或者活菌體和死菌體的 混合菌體作為活性成分。當(dāng)使用活菌體或死菌體的混合菌體作為活性成分時，活菌體的數(shù) 量優(yōu)選高于死菌體的數(shù)量。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，盡管將動物雙歧桿菌添加到所述藥物和/或食品中，并對個體進(jìn)行 給藥，即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，即起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，但優(yōu)選情況下，以每克所述藥 物和/或食品為基準(zhǔn)，所述動物雙歧桿菌的含量為l〇 6-l〇nCFU，優(yōu)選為108-101(iCFU。
[0025] CFU (Colony-Forming Units，菌落形成單位）指活菌個數(shù)。在活菌培養(yǎng)計數(shù)時，由 單個菌體或聚集成團(tuán)的多個菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落，稱為菌落形成單 位，以其表達(dá)活菌的數(shù)量，可以通過平板菌落計數(shù)法獲得。本發(fā)明中，當(dāng)雙歧桿菌的死菌體 的濃度以CFU/ml表示時，是指雙歧桿菌的活菌體死亡后得到相應(yīng)數(shù)量的死菌體，并將其溶 于緩沖液中配制成所需濃度。
[0026] 以下的實施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0027] 在下述制備例、實施例和對比例中：
[0028] (1)動物雙歧桿菌（以下簡稱A6)為本發(fā)明的動物雙歧桿菌（該菌株于2014年 6月5日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為 CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 9273)。
[0029] (2)DNA回收試劑盒，購自Zemo公司；SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒 (貨號RR420A)購自Takara公司；RNAlater購自上海浩然生物公司；
[0030] 雄性Wistar大鼠44只，體重230 ± 10g，購自北京維通利華有限公司。無菌墊料購 自中國軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院，實驗動物飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢 驗測試中心（北京）動物實驗室，動物房溫度20±2°C，濕度40-50%，12h光照交替。實驗 大鼠按照每籠5只飼養(yǎng)，自由攝入飼料，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周；將經(jīng)過適應(yīng)期的大鼠按 照體重隨機(jī)分為5組，每組11只，重新分組的過程中遵循就近調(diào)換的原則；
[0031] 無雙歧桿菌大鼠飼料購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。飼喂前經(jīng)輻射滅 菌。
[0032] (3)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液50倍TAE :稱取242g Tris加入57. lmL冰醋酸，100mL 0· 5M EDTA，調(diào)節(jié)pH = 8. 0,用超純水定容到1L。
[0033] (4)厭氧稀釋液：稱取Na2HP04 · 12H20 6. 0g，ΚΗ2Ρ044· 5g，半胱氨酸鹽酸鹽0· 5g，吐 溫-800. 5g加入800mL去離子水，充分?jǐn)嚢?，調(diào)pH到7. 4,再加去離子水定容到1L。
[0034] 以下所用的試劑、培養(yǎng)基組成以及實驗學(xué)方法等在沒有特別說明的情況下，均為 本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑、培養(yǎng)基組成以及實驗學(xué)方法。
[0035] 制備例
[0036] 本制備例用于說明本發(fā)明的動物雙歧桿菌A6的配制
[0037] 菌種以1體積％的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液于 6000g離心15min，棄上清液，菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌1次，相同轉(zhuǎn)速和時間離心，用 無菌生理鹽水稀釋進(jìn)行梯度稀釋，取1(Γ 6、1(Γ7和ΚΓ8三個梯度各lmL進(jìn)行平板培養(yǎng)，37°C厭 氧培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計數(shù)后，最終配制成1 X ΙΟ6、1 X 108和1 X 101(lCFU/mL的菌懸液，現(xiàn)配 現(xiàn)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，該制備的菌懸液中是包括一定數(shù)量的雙歧桿菌的死 菌體的。
[0038] 實施例1-3
[0039] 用于說明本發(fā)明的動物雙歧桿菌A6的調(diào)節(jié)腸道菌群的效果
[0040] (1)實驗動物的分組與劑量設(shè)置
[0041] 選取如上的3組動物，分別記為：低劑量組（L)、中劑量組（M)、高劑量組（H)。各 組的灌胃劑量分別為l〇 6CFU/kg大鼠體重（實施例1)、108CFU/kg大鼠體重（實施例2)和 10 1(lCFU/kg大鼠體重（實施例3)。將雙歧桿菌A6菌體培養(yǎng)液，每天定時按照5mL/kg體重 以灌胃的方式按照各自的劑量喂給大鼠，同時將6g日常飼料碾碎以灌胃方式喂給大鼠，灌 胃期為9天。灌胃期間大鼠自由攝食、飲水，每天監(jiān)測體重和攝食量。
[0042] (2)腸道中細(xì)菌基因組DNA樣品收集
[0043] 在灌胃動物雙歧桿菌A6前和灌胃9天后，用裝有無菌玻璃珠和3mL厭氧稀釋液的 離心管收集大鼠的新鮮糞便0. 5g，用漩渦振蕩器（型號MS2,購自德國IKA公司）均質(zhì)完全 后采用酚仿法提取糞便中的細(xì)菌基因組DNA。用1 %的瓊脂糖進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢 測。檢測結(jié)果顯示，所有糞便樣品中細(xì)菌組DNA均成功提出，且無明顯降解現(xiàn)象。
[0044] (3)糞便中腸道菌群含量的測定
[0045] 使用表1中的特異性引物分別對步驟（2)中獲得的糞便樣品細(xì)菌組DNA進(jìn)行實時 定量？0?實驗（實時定量？0?的反應(yīng)體系：1以1^的糞便基因組0嫩，0.4以1^的1(^1上下 游引物，10 μ L的SYBR Premix Ex Taq，0. 4 μ L的ROX，7. 8 μ L的無菌水；反應(yīng)程序如下：預(yù) 變性（95 °C反應(yīng)30s)，變性（95 °C反應(yīng)5s)，退火（表1中的退火溫度反應(yīng)30s)，延伸（72 °C 反應(yīng)30s)，PCR反應(yīng)40-45個循環(huán)），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃度為2 %的瓊脂糖凝膠電泳，用 無菌手術(shù)刀將單一的目標(biāo)條帶切下，放入干凈的5mL離心管中，使用Zemo膠回收試劑盒并 按照其說明書進(jìn)行DNA回收。
[0046] 切膠回收的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板利用Qubit Assays測定各自的DNA濃度后，10倍稀釋8 個梯度作為定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0047] 按照以上所述的定量PCR反應(yīng)體系和條件，分別以各自的表1中的特異性引物進(jìn) 行定量PCR反應(yīng)，以各梯度稀釋液中DNA的拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)， 制作表1中不同目標(biāo)細(xì)菌組的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算引物的擴(kuò)增效率，公式為：擴(kuò)增效率=1〇_ (1/ #w)-l。同時，以同樣的PCR體系和條件對和對比例1和2,以及實施例的高中低三個劑量 組的小鼠糞便樣品基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到Ct值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品中該菌 群的拷貝數(shù)濃度，根據(jù)取樣時糞便的質(zhì)量，換算成每克糞便樣品中含有該菌群的拷貝數(shù)對 數(shù)（lgDNA拷貝數(shù)/克糞便），結(jié)果如表2所示。
[0048] 表 1
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種動物雙歧桿菌，其特征在于，所述動物雙歧桿菌屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9273。
2. 權(quán)利要求1所述的動物雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用不包括 治療人體或動物體的疾病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中，所述調(diào)節(jié)腸道菌群包括降低腸道中擬桿菌和/或 大腸桿菌的數(shù)量，和/或增加腸道中梭菌屬Cluster I亞屬產(chǎn)丁酸梭菌、雙歧桿菌和乳桿菌 中的一種或多種的數(shù)量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包括制備調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物和/ 或食品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述藥物和/或食品含有所述動物雙歧桿菌的活 菌體和/或死菌體作為活性成分。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其中，以每克所述藥物和/或食品為基準(zhǔn)，所述動 物雙歧桿菌的含量為l〇6-l〇nCFU。
【文檔編號】A61P1/14GK104232515SQ201410403251
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】王希璠, 任發(fā)政, 郭慧媛, 趙亮 申請人:任發(fā)政