專(zhuān)利名稱(chēng)：一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法，更具體地涉及一種含有4種乳酸 菌的酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法。屬于微生物制品的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌是人類(lèi)最早發(fā)現(xiàn)的生理性細(xì)菌，是能在健康人腸道內(nèi)定植的益生菌。母 乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道內(nèi)該菌占總菌群的92%以上，現(xiàn)在已確認(rèn)雙歧桿菌的數(shù)量和品質(zhì)是人 體健康的重要標(biāo)志之一。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道雙歧桿菌具有多種生理活性功能，可作為宿主氮 的來(lái)源之一，同時(shí)，具有合成維生素、潤(rùn)腸通便、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、降低膽固醇和甘油三 酯、抑癌作用以及抗衰老作用等功能。隨著科技研究水平的提高和乳品加工業(yè)的快速發(fā)展，雙歧桿菌在酸奶中的應(yīng)用越 來(lái)越廣泛。人們?cè)谑秤眠@些乳品的同時(shí)，通過(guò)其中活菌的作用可以改善胃、腸道內(nèi)微生態(tài) 的平衡，抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)身體健康。但要達(dá)到此作用，一般認(rèn)為其活菌數(shù)要在 106cfu/g(mL)以上。然而，人們長(zhǎng)期忽視了對(duì)準(zhǔn)確檢測(cè)酸奶中雙歧桿菌活菌數(shù)的方法的需 要，導(dǎo)致市場(chǎng)上許多發(fā)酵奶制品中雙歧桿菌活力甚微而又難以檢出。與此同時(shí)，對(duì)健康有益 的乳酸菌如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌等被越來(lái)越多地添加到發(fā)酵乳中，加之酸奶加工使用 的發(fā)酵劑中的嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌，這些乳酸菌的存在均對(duì)雙歧桿菌的檢測(cè)帶 來(lái)干擾。2004年國(guó)家發(fā)布了《GB/T 4789. 34-2008食品中雙歧桿菌的檢測(cè)方法》，此方法采 用的培養(yǎng)基為非選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)雙歧桿菌的活菌檢測(cè)，但是對(duì)于酸奶產(chǎn)品而 言，酸奶中其他乳酸菌均能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，每次檢驗(yàn)都需要多步鑒定才能得到準(zhǔn)確的 數(shù)據(jù)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，成本高。中國(guó)專(zhuān)利CN1880471A “乳制品中雙歧桿菌檢測(cè)方法”中公開(kāi)了 一種乳制品中雙歧桿菌的檢測(cè)方法，在培養(yǎng)基中添加抗菌素抑制其他雜菌生長(zhǎng)，發(fā)明中采 用了氯化鋰、丙酸鈉、雙氯青霉素3種抗菌素。雙氯青霉素為廣譜青霉素類(lèi)抗生素，雙歧桿 菌對(duì)該類(lèi)抗生素敏感，對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法，完全避免酸牛奶中其他 乳酸菌對(duì)雙歧桿菌檢測(cè)數(shù)量的影響，以便及時(shí)對(duì)含有嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞 種、嗜酸乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種酸牛奶產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)督和控制。本發(fā)明的酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法包括以下步驟1)稀釋液、MRS培養(yǎng)基、抗生素溶液和培養(yǎng)液的配制；2)樣品稀釋?zhuān)?)接種培養(yǎng)；4)菌落計(jì)數(shù)；5)顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)；
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所述抗生素溶液包含硫酸新霉素和硫酸巴龍霉素。酸牛奶樣品是含有4種乳酸菌(嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿 菌和動(dòng)物雙歧桿菌)的酸牛奶。酸牛奶中長(zhǎng)雙歧桿菌菌粉來(lái)自蒙牛乳業(yè)(北京)有限責(zé)任 公司保藏菌種，CGMCC No. 2265。所使用的稀釋液是用滅菌的0. 9%的生理鹽水。所述MRS培養(yǎng)基的組成為(g/L):蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖 20.0，吐溫801. 0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2. 0，乙酸鈉(3H20) 5. 0，檸檬酸三銨2.0，硫酸鎂 (7H20) 0. 2，硫酸錳(4H20) 0. 05，瓊脂 15. 0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調(diào)節(jié)到6.2 士 0. 1，并用蒸餾水定容至lOOOmL， 121°C，高壓滅菌15min。所述抗生素溶液的組成為硫酸新霉素80 120mg，硫酸巴龍霉素35 65mg， LiCl 1. 5 4. 5g，丙酸鈉15 45g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 25 0. 75g，蒸餾水50mL。制法0. 45 um微孔濾膜過(guò)濾后加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個(gè)月。在無(wú)菌條件下，在1000mL47°C MRS培養(yǎng)基中加入50mL抗生素溶液，混勻，制成本發(fā) 明檢測(cè)方法中使用的培養(yǎng)液。所述樣品稀釋是通過(guò)無(wú)菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有225mL滅 菌生理鹽水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸取1 10稀 釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖均勻，做成1 100的稀釋 液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每遞增一次，換用 1支lmL滅菌吸管，制成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的均勻稀釋液。所述接種培養(yǎng)包括選擇2個(gè) 3個(gè)適宜的稀釋度，分別注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后將 融化并冷卻至45°C左右的培養(yǎng)液傾注于平皿中，培養(yǎng)液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層， 迅速與稀釋菌液混勻，凝固后培養(yǎng)，同時(shí)作滅菌生理鹽水空白對(duì)照。待瓊脂表面干后，翻轉(zhuǎn)平皿，放在厭氧罐內(nèi)，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包并快速關(guān)緊厭氧罐， 或關(guān)緊厭氧罐后抽充高純氮?dú)馊?。從稀釋樣品到傾注平板及放入?yún)捬豕薜倪^(guò)程要迅速， 在20分鐘內(nèi)完成操作。將厭氧罐置于36°C 士 1°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h士3h。菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)原則同GB4789. 2-2003種菌落總數(shù)計(jì)數(shù)原則。選取菌落數(shù)在30 300之間的平板對(duì)可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)出平皿內(nèi)的雙歧桿菌菌數(shù)，然后乘以樣品的稀釋 倍數(shù)，得每毫升樣品中雙歧桿菌數(shù)。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)為雙歧桿菌的是4個(gè)，則lmL樣品中雙歧桿菌數(shù)為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態(tài)菌體細(xì)胞末端膨大，呈骨棒狀，微彎曲，0. 63 1. 25 X 3. 12 6. 25 y m， 單個(gè)、成對(duì)或欄柵狀排列，無(wú)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，嚴(yán)格厭氧，菌落乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形， 表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。菌種鑒定隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落進(jìn)行如下3項(xiàng)鑒定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，按以下方法進(jìn)行染色鑒定a.涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；
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c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復(fù)染lmin，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果革蘭氏染色陽(yáng)性、無(wú)芽孢桿菌。革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。②菌體形態(tài)顯微鏡觀(guān)察呈現(xiàn)“Y”或“V”型的分叉狀、棒狀等多形態(tài)的桿菌。③過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶陰性。具體方法用接種環(huán)挑取一小環(huán)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，接到涂有3%過(guò)氧化 氫的玻片上，用竹簽攪動(dòng)，有氣泡出現(xiàn)者為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明針對(duì)酸牛奶產(chǎn)品的特點(diǎn)，采用雙歧桿菌不敏感或中度敏 感的氨基糖苷類(lèi)抗生素作為選擇性試劑，使得培養(yǎng)基對(duì)其他乳酸菌有一定程度的抑制，從 而選擇性計(jì)數(shù)酸奶中的雙歧桿菌，減少鑒定步驟，在48小內(nèi)得到準(zhǔn)確的檢測(cè)數(shù)據(jù)。能夠有 效的排除其他乳酸菌的干擾，準(zhǔn)確檢測(cè)出含有4種乳酸菌的酸牛奶中雙歧桿菌的活菌數(shù) 量，降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。


圖1是顯示乳雙歧桿菌細(xì)胞形態(tài)的顯微照片；圖2是顯示長(zhǎng)雙歧桿菌細(xì)胞形態(tài)的顯微照片；圖3是顯示青春雙歧桿菌細(xì)胞形態(tài)的顯微照片；圖4是顯示乳雙歧桿菌菌落形態(tài)的照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1待測(cè)樣品已知乳雙岐桿菌活菌數(shù)1. 0 X 105cfu/mL的酸牛奶樣品樣品的制備將已知活菌數(shù)的乳雙歧桿菌菌粉(科 漢森公司產(chǎn)品)按一定 比例添加到酸牛奶產(chǎn)品中，使酸牛奶中嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌的活菌數(shù)量分別達(dá)到 1.0X105,嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的數(shù)量總計(jì)達(dá)到1. 0X 106。儀器和設(shè)備超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司、BCM-1000A)、高壓滅菌鍋(上海申 安醫(yī)療器械廠(chǎng)、LDZX-50KB)、厭氧罐(長(zhǎng)沙市馭儀電子科技有限公司、2. 5L)、電熱恒溫培養(yǎng) 箱(黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司、SKP02. 600)、生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠(chǎng)，XSZ-4)。試劑0. 9%的滅菌生理鹽水。MRS培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫80 1.0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2. 0，乙酸鈉(3H20) 5.0，檸檬酸三銨2.0，硫酸鎂(7H20)0. 2，硫酸 錳(4H20) 0.05，瓊脂15.0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調(diào)節(jié)到6.2 士 0. 1，并用蒸餾 水定容至1000mL，121°C，高壓滅菌15min?？股厝芤旱慕M成為硫酸新霉素80mg，硫酸巴龍霉素65mg，LiCl 1.5g，丙酸鈉 15g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 25g，蒸餾水50mL。制法0. 45 um微孔濾膜過(guò)濾后加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個(gè)月。在無(wú)菌條件下，在1000mL47°C MRS培養(yǎng)基中加入50mL抗生素溶液，混勻，制成培養(yǎng)液。操作步驟樣品稀釋是通過(guò)無(wú)菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有 225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸 取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖均勻，做成 1 100的稀釋液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每 遞增一次，換用1支lmL滅菌吸管，制成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的均勻稀釋液。選擇2個(gè) 3個(gè)適宜 的稀釋度，分別注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后將融化并冷卻至45°C左右的培養(yǎng)液傾注于平皿中， 培養(yǎng)液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固后培養(yǎng)，同時(shí)作滅菌生 理鹽水空白對(duì)照。待瓊脂表面干后，翻轉(zhuǎn)平皿，放在厭氧罐內(nèi)，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包并快速關(guān)緊 厭氧罐，或關(guān)緊厭氧罐后抽充高純氮?dú)馊巍南♂寴悠返絻A注平板及放入?yún)捬豕薜倪^(guò)程 要迅速，在20分鐘內(nèi)完成操作。將厭氧罐置于36°C 士 1°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h士3h。菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)原則同GB4789. 2-2003種菌落總數(shù)計(jì)數(shù)原則。選取菌落數(shù)在30 300之間的平板對(duì)可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)出平皿內(nèi)的雙歧桿菌菌數(shù)，然后乘以樣品的稀釋 倍數(shù)，得每毫升樣品中雙歧桿菌數(shù)。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)為雙歧桿菌的是4個(gè)，則lmL樣品中雙歧桿菌數(shù)為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態(tài)觀(guān)察結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌 落乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。 菌種鑒定隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落進(jìn)行如下3項(xiàng)鑒定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，按以下方法進(jìn)行染色鑒定a.涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復(fù)染lmin，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌 落，按革蘭氏染色鑒定方法，鏡檢均為革蘭氏陽(yáng)性菌。②菌體形態(tài)受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落，按 革蘭氏染色鑒定方法，在顯微鏡(1000倍)下觀(guān)察菌體形態(tài)，呈現(xiàn)“Y”或“V”型的分叉狀、 棒狀等多形態(tài)的桿菌。③過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)具體方法用接種環(huán)挑取一小環(huán)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，接到涂有3%過(guò)氧化 氫的玻片上，用竹簽攪動(dòng)，有氣泡出現(xiàn)者為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌 落，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。結(jié)果活菌數(shù)為5. 1 X 105cfu/mL。為了驗(yàn)證本實(shí)施例1中計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，提取本次檢測(cè)中培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌 落，采用生理生化和分子生物技術(shù)鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證方法及結(jié)果如下生理生化和基因鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證方法形態(tài)特征在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不 透明，邊緣整齊。革蘭氏染色，電子顯微鏡下鏡檢，菌體革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢，細(xì)胞末端膨大， 呈骨棒狀。微彎曲，0.63 1.25X3. 12 6.25 iim，單個(gè)、成對(duì)或欄柵狀排列。生理生化特征 16SrDNA基因序列分析培養(yǎng)菌落按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技有限公司)說(shuō) 明提取基因組DNA。以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16SrDNA，細(xì)菌域的16SrDNA 基因擴(kuò)增的通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘)和1541R(5' -TAAGGAGGTGATCCAGCC-3‘)
oPCR 反應(yīng)體系(30ul 體系):1. 5ul 引物 1，1. 5ul 引物 2，5ul 5Xbuffer,0. 2ul Mg (250mM)，1. 2ul dNTP (2. 5mM)，18. 4ul H20, lul 模板(5ng)。PCR過(guò)程為94°C預(yù)變性3min后，進(jìn)行下述30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸90s，最后72°C保溫lOmin。PCR結(jié)束后，取15ul反應(yīng)混和物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中添加EB替代物， 電泳緩沖液1XTAE緩沖液。電泳結(jié)束后在紫外光下觀(guān)察，可見(jiàn)相應(yīng)大小為1. 5kb的條帶。 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物送樣到測(cè)序公司測(cè)序(美國(guó)英杰生命 技術(shù)有限公司)，將得到的堿基序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索(blast)，找出與數(shù)據(jù) 庫(kù)中同源性最高的模式菌株。結(jié)果如下基因序列(序列數(shù)字標(biāo)識(shí)1)cgcgttgcgtggcattgaagtccaccgacggcttggtgcgtggcgccatcgtgcacgaca60
ccggcggcccgatcgaggtgccggtcggcgatgttaccaagggccatgtgttcgacgttt120
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cccgcatctgcgacggcgtg tacgacaacg tgccggagca ggcatctcgg ca 1192
系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果菌株BB-1216SrDNA基因序列與B. animalis subsp.lactis
DSM 10140T 同源性為 100%，與 B. animal is subsp. animalisATCC25527T 同源性為 97. 2%, 與B.bifidum ATCC 29521同源性為96. 1 %，與雙歧桿菌屬內(nèi)其它種同源性均低于90%，在 亞種水平上有很好的分辨率。鑒定結(jié)論乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)。在實(shí)施例1中，受試樣品按本發(fā)明方法操作步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和菌種鑒 定，活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果為5. lX105cfu/mL。為了驗(yàn)證本實(shí)施例中計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，提取本 次檢測(cè)中培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，采用生理生化和分子生物技術(shù)鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒 定，鑒定結(jié)論表明培養(yǎng)物為乳雙歧桿菌Bifidobacterium lactis，與本實(shí)施例1樣品中所 添加的雙歧桿菌為同一種屬菌種，表明受試樣品按本發(fā)明方法操作步驟進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)， 可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)雙歧桿菌活菌數(shù)數(shù)量。實(shí)施例2待測(cè)樣品已知長(zhǎng)雙岐桿菌活菌數(shù)1.0X106cfU/mL的酸牛奶樣品樣品的制備將已知活菌數(shù)的長(zhǎng)雙歧桿菌菌粉(蒙牛乳業(yè)(北京)有限責(zé)任公司 保藏菌種，CGMCC No. 2265)按一定比例添加到酸牛奶產(chǎn)品中，使酸牛奶中嗜酸乳桿菌和長(zhǎng) 雙歧桿菌的活菌數(shù)量分別達(dá)到1. OX 106cfu/mL，嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的 數(shù)量達(dá)到 1. 0X106cfu/mL。試劑0. 9%的滅菌生理鹽水。MRS培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫 801. 0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2.0，乙酸鈉(3H20) 5. 0，檸檬酸三銨2. 0，硫酸鎂(7H20)0.2，硫 酸錳(4H20) 0.05，瓊脂15.0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調(diào)節(jié)到6.2 士 0.1，并用蒸 餾水定容至1000mL，121°C，高壓滅菌15min?？股厝芤旱慕M成為硫酸新霉素lOOmg，硫酸巴龍霉素50mg，LiC13g，丙酸鈉 30g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，蒸餾水50mL。制法0. 45 um微孔濾膜過(guò)濾后加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個(gè)月。在無(wú)菌條件下，在1000mL47°C MRS培養(yǎng)基中加入50mL抗生素溶液，混勻，制成培養(yǎng)液。
操作步驟樣品稀釋是通過(guò)無(wú)菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有 225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸 取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖均勻，做成 1 100的稀釋液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每 遞增一次，換用1支lmL滅菌吸管，制成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的均勻稀釋液。選擇2個(gè) 3個(gè)適宜 的稀釋度，分別注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后將融化并冷卻至45°C左右的培養(yǎng)液傾注于平皿中， 培養(yǎng)液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固后培養(yǎng)，同時(shí)作滅菌生 理鹽水空白對(duì)照。待瓊脂表面干后，翻轉(zhuǎn)平皿，放在厭氧罐內(nèi)，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包并快速關(guān)緊 厭氧罐，或關(guān)緊厭氧罐后抽充高純氮?dú)馊?。從稀釋樣品到傾注平板及放入?yún)捬豕薜倪^(guò)程 要迅速，在20分鐘內(nèi)完成操作。將厭氧罐置于36°C 士 1°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h士3h。菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)原則同GB4789. 2-2003種菌落總數(shù)計(jì)數(shù)原則。選取菌落數(shù)在30 300之間的平板對(duì)可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)出平皿內(nèi)的雙歧桿菌菌數(shù)，然后乘以樣品的稀釋 倍數(shù)，得每毫升樣品中雙歧桿菌數(shù)。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)為雙歧桿菌的是4個(gè)，則lmL樣品中雙歧桿菌數(shù)為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態(tài)觀(guān)察結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌 落乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。菌種鑒定隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落進(jìn)行如下3項(xiàng)鑒定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，按以下方法進(jìn)行染色鑒定a.涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復(fù)染lmin，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌 落，按革蘭氏染色鑒定方法，鏡檢均為革蘭氏陽(yáng)性菌。②菌體形態(tài)受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落，按 革蘭氏染色鑒定方法，在顯微鏡(1000倍)下觀(guān)察菌體形態(tài)，呈現(xiàn)“Y”或“V”型的分叉狀、 棒狀等多形態(tài)的桿菌。③過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)具體方法用接種環(huán)挑取一小環(huán)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，接到涂有3%過(guò)氧化 氫的玻片上，用竹簽攪動(dòng)，有氣泡出現(xiàn)者為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌 落，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。經(jīng)以上鑒定步驟，本次樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果活菌數(shù)為3.0X106cfu/mL。為了驗(yàn)證本實(shí)施例中計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，提取本次檢測(cè)中培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落， 采用生理生化和分子生物技術(shù)鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證方法及結(jié)果如下形態(tài)特征在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢，菌體革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢，桿狀、多形態(tài)。
生理生化特征接觸酶陰性，氧化酶陰性，嚴(yán)格厭氧生長(zhǎng)，果糖-6-磷酸鹽磷酸酮 酶陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸。 16SrDNA基因序列分析培養(yǎng)菌落按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技有限公司)說(shuō) 明提取基因組DNA。以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16SrDNA，細(xì)菌域的16SrDNA 基因擴(kuò)增的通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‘)和1541R(5' -TAAGGAGGTGATCCAGCC-3‘)
oPCR 反應(yīng)體系(30ul 體系)1. 5ul 引物 1，1. 5ul 弓丨物 2，5ul 5 * buffer, 0. 2ulMg(250mM)，1. 2ul dNTP (2. 5mM)，18. 4ul H20, lul 模板(5ng)。PCR 過(guò)程為 94°C預(yù)變 性3min后，進(jìn)行下述30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，最后72°C保溫 lOmin。PCR結(jié)束后，取15ul反應(yīng)混和物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中添加EB替代物， 電泳緩沖液1XTAE緩沖液。電泳結(jié)束后在紫外光下觀(guān)察，可見(jiàn)相應(yīng)大小為1. 5kb的條帶。 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物送樣到測(cè)序公司測(cè)序(美國(guó)英杰生命 技術(shù)有限公司)，將得到的堿基序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索(blast)，找出與數(shù)據(jù) 庫(kù)中同源性最高的模式菌株。結(jié)果如下(序列數(shù)字標(biāo)識(shí)2)ttagacggctccatcccacaaggggttaggccaccggcttcgggtgctgcccactttcat60
gacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcgacgttgctgattcg120
cgattactagcgactccgccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagac180
cggttttcagggatccgctccgcgtcgccgcgtcgcatcccgttgtaccggccattgtag240
catgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatccccaccttcctcc300
gagttaaccccggcggtcccccgtgagttcccggcataatccgctggcaacacggggcga360
gggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccat420
gcaccacctgtgaacccgccccgaagggaagccgtatctctacgaccgtcgggaacatgt480
caagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtg540
cgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcgggatgc600
ttaacgcgttagctccgacacggaacccgtggaacgggccccacatccagcatccaccgt660
10
ttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcag720
cgtcagtaacggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttcccgatatctacacat780
tccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgcactcaagcccgcccgtacccgg840
cgcggatccaccgttaagcgatggactttcacaccggacgcgacgaaccgcctacgagcc900
ctttacgcccaataattccggataacgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggca960
cgtagttagccggtgcttattcaacgggtaaactcactctcgcttgctccccgataaaag1020
aggtttacaacccgaaggcctccatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgccc1080
attgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtatctcagtcccaa1140
tgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgaagccacggtgggccgttaccccg1200
ccgtcaagctgataggacgcgaccccatcccataccgcgaaagctttcccagaagaccat1260
gcgatcaactggagcatccggcattaccacccgtttccaggagctattccggtgtatggg1320
gcaggtcggtcacgcattactcacccgttcgccactctcaccaccaagcaaagcctgatg1380
gatcccgttc gacttgca1398鑒定結(jié)論長(zhǎng)雙歧桿菌 Bifidobacterium longum。本實(shí)施例中，受試樣品按本發(fā)明方法操作步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和菌種鑒定， 活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果為3. 0 X 106cfu/mL。為了驗(yàn)證本實(shí)施例2中計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，提取本次檢 測(cè)中培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，采用生理生化和分子生物技術(shù)鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒定， 鑒定結(jié)論表明培養(yǎng)物為長(zhǎng)雙歧桿菌Bifidobacterium longum,與本實(shí)施例樣品中所添加的 雙歧桿菌為同一種屬菌種，表明受試樣品按本發(fā)明方法操作步驟進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，可準(zhǔn)確 計(jì)數(shù)雙歧桿菌活菌數(shù)數(shù)量。實(shí)施例3待測(cè)樣品已知青春雙岐桿菌活菌數(shù)1. OX 106cfu/mL的酸牛奶樣品樣品的制備將已知活菌數(shù)的青春雙歧桿菌菌粉(蒙牛乳業(yè)(北京)有限責(zé)任公 司保藏菌種，CGMCC No. 2264)按一定比例添加到酸牛奶產(chǎn)品中，使酸牛奶中嗜酸乳桿菌和 青春雙歧桿菌的活菌數(shù)量分別達(dá)到1. OX 106cfu/mL，嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞 種的數(shù)量達(dá)到1. OX 106cfu/mL。試劑0. 9%的滅菌生理鹽水。MRS培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫 801. 0ml，磷酸氫二鉀(7H20)2. 0，乙酸鈉(3H20) 5. 0，檸檬酸三銨2. 0，硫酸鎂(7H20)0. 2，硫 酸錳(4H20) 0.05，瓊脂15.0。將上述成分溶解在蒸餾水中，將pH調(diào)節(jié)到6.2 士 0.1，并用蒸 餾水定容至1000mL，121°C，高壓滅菌15min?？股厝芤旱慕M成為硫酸新霉素120mg，硫酸巴龍霉素35mg，LiCl 4. 5g，丙酸鈉 45g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 75g，蒸餾水50mL。制法0. 45 um微孔濾膜過(guò)濾后加入滅菌瓶中。4°C下保藏一個(gè)月。在無(wú)菌條件下，在1000mL47°C MRS培養(yǎng)基中加入50mL抗生素溶液，混勻，制成培養(yǎng)液。操作步驟樣品稀釋是通過(guò)無(wú)菌操作，將充分混勻的檢樣酸牛奶25mL放入含有 225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)作成1 10的均勻稀釋液。再用lmL滅菌吸管吸 取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖均勻，做成1 100的稀釋液。另取lmL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此操作，每 遞增一次，換用1支lmL滅菌吸管，制成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的均勻稀釋液。選擇2個(gè) 3個(gè)適宜 的稀釋度，分別注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后將融化并冷卻至45°C左右的培養(yǎng)液傾注于平皿中， 培養(yǎng)液的用量恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固后培養(yǎng)，同時(shí)作滅菌生 理鹽水空白對(duì)照。待瓊脂表面干后，翻轉(zhuǎn)平皿，放在厭氧罐內(nèi)，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包并快速關(guān)緊 厭氧罐，或關(guān)緊厭氧罐后抽充高純氮?dú)馊?。從稀釋樣品到傾注平板及放入?yún)捬豕薜倪^(guò)程 要迅速，在20分鐘內(nèi)完成操作。將厭氧罐置于36°C 士 1°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h士3h。菌落計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)原則同GB4789. 2-2003種菌落總數(shù)計(jì)數(shù)原則。選取菌落數(shù)在30 300之間的平板對(duì)可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)出平皿內(nèi)的雙歧桿菌菌數(shù)，然后乘以樣品的稀釋 倍數(shù)，得每毫升樣品中雙歧桿菌數(shù)。例如，檢樣IX 104倍的稀釋液在MRS瓊脂平板上，生成 的可疑菌落為35個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)為雙歧桿菌的是4個(gè)，則lmL樣品中雙歧桿菌數(shù)為 35X4/5X 104 = 2. 8X 104。菌落形態(tài)觀(guān)察結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌 落乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不透明，邊緣整齊。菌種鑒定隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落進(jìn)行如下3項(xiàng)鑒定。①革蘭氏染色挑取瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，按以下方法進(jìn)行染色鑒定a.涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液染色lmin，水洗；b.滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗；c.滴加脫色酒精，約30s ；d.水洗，滴加番紅復(fù)染lmin，水洗，待干，鏡檢。結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌 落，按革蘭氏染色鑒定方法，鏡檢均為革蘭氏陽(yáng)性菌。②菌體形態(tài)受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落，按 革蘭氏染色鑒定方法，在顯微鏡(1000倍)下觀(guān)察菌體形態(tài)，呈現(xiàn)不規(guī)則桿菌。③過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)具體方法用接種環(huán)挑取一小環(huán)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，接到涂有3%過(guò)氧化 氫的玻片上，用竹簽攪動(dòng)，有氣泡出現(xiàn)者為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。結(jié)果受試樣品在本發(fā)明方法所述條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌 落，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。經(jīng)以上鑒定步驟，本次樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果活菌數(shù)為2. lX106cfu/mL。為了驗(yàn)證本實(shí)施例3中計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，提取本次檢測(cè)中培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌 落，采用生理生化和分子生物技術(shù)鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證方法及結(jié)果如下形態(tài)特征在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為乳白色，濕潤(rùn)，液滴狀，圓形，表面光滑，突起，不 透明，邊緣整齊。革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢，菌體革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢，桿狀、多形態(tài)。生理生化特征接觸酶陰性，氧化酶陰性，嚴(yán)格厭氧生長(zhǎng)，果糖-6-磷酸鹽磷酸酮 酶陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸。 16SrDNA基因序列分析培養(yǎng)菌落按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技有限公司)說(shuō) 明提取基因組DNA。以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16SrDNA，細(xì)菌域的16SrDNA 基因擴(kuò)增的通用引物27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1541R(5' -TMGGAGGTGATCCAGCC-3 ‘)。PCR 反應(yīng)體系(30ul 體系)1. 5ul 引物 1，1. 5ul 弓丨物 2，5ul 5 * buffer, 0. 2ulMg(250mM)，1. 2ul dNTP (2. 5mM)，18. 4ul H20, lul 模板(5ng)。PCR 過(guò)程為 94°C預(yù)變 性3min后，進(jìn)行下述30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，最后72°C保溫 lOmin。PCR結(jié)束后，取15ul反應(yīng)混和物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中添加EB替代物， 電泳緩沖液1XTAE緩沖液。電泳結(jié)束后在紫外光下觀(guān)察，可見(jiàn)相應(yīng)大小為1. 5kb的條帶。 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物送樣到測(cè)序公司測(cè)序(美國(guó)英杰生命 技術(shù)有限公司)，將得到的堿基序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索(blast)，找出與數(shù)據(jù) 庫(kù)中同源性最高的模式菌株。結(jié)果如下(序列數(shù)字標(biāo)識(shí)3)ccaggagcttgctcctgggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccgacctgcc60
ccatacaccggaatagctcctggaaacgggtggtaatgccggatgctccagttgactgca120
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gtcatgaaagtgggtagcacccgaagccggtggcccaa1358鑒定結(jié)論青春雙歧桿菌 Bifidobacterium adolescentis本實(shí)施例中，受試樣品按本發(fā)明方法操作步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和菌種鑒定， 活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果為2. lX106cfu/mL。為了驗(yàn)證本實(shí)施例中計(jì)數(shù)結(jié)果的可靠性，提取本次檢 測(cè)中培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，采用生理生化和分子生物技術(shù)鑒定方法對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行鑒定， 鑒定結(jié)論表明培養(yǎng)物為青春雙歧桿菌Bifidobacterium adolescentis,與本實(shí)施例樣品 中所添加的雙歧桿菌為同一種屬菌種，表明受試樣品按本發(fā)明方法操作步驟進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì) 數(shù)，可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)雙歧桿菌活菌數(shù)數(shù)量。
權(quán)利要求
一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟1)稀釋液、MRS培養(yǎng)基、抗生素溶液和培養(yǎng)液配制；2)樣品稀釋?zhuān)?)接種培養(yǎng)；4)菌落計(jì)數(shù)；5)顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)；其特征在于所述抗生素溶液包含硫酸新霉素和硫酸巴龍霉素。
2.如權(quán)利要求1中所述的方法，步驟1)所述的稀釋液為0.9%滅菌生理鹽水，培養(yǎng)液 由滅菌MRS培養(yǎng)基和抗生素溶液組成，抗生素溶液的組成為硫酸新霉素80 120mg，硫酸巴 龍霉素35 65mg，LiCl 1. 5 4. 5g，丙酸鈉15 45g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 25 0. 75g，蒸 餾水50mL。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，所述的步驟1)中培養(yǎng)液是將通過(guò)0.45μπι微孔濾膜 過(guò)濾后的抗生素溶液加入到滅菌的47°C MRS培養(yǎng)基中混勻制備的。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法所述的步驟2)包括通過(guò)無(wú)菌操作，將充分混勻的檢 樣酸牛奶25mL放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)制成1 10的均勻稀釋液； 用ImL滅菌吸管吸取1 10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)， 振搖均勻，做成1 100的稀釋液；另取ImL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋 液，如此操作，每遞增一次，換用1支ImL滅菌吸管，制成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的均勻稀釋液。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法所述步驟3)包括選擇其中2個(gè) 3個(gè)稀釋度，分別 注入滅菌培養(yǎng)皿中，然后將融化并冷卻至45°C左右的培養(yǎng)液傾注于平皿中，培養(yǎng)液的用量 恰好覆蓋平皿底部一薄層，迅速與稀釋菌液混勻，凝固后培養(yǎng)，同時(shí)作滅菌生理鹽水空白對(duì) 照，待瓊脂表面干后，翻轉(zhuǎn)平皿，放在厭氧罐內(nèi)，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包并快速關(guān)緊厭氧罐，或關(guān)緊 厭氧罐后抽充高純氮?dú)馊巍?br> 6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法所述步驟4)和5)包括選取菌落數(shù)在30 300之 間的平板對(duì)可疑菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)挑取五個(gè)可疑菌落進(jìn)行顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過(guò) 氧化氫酶試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶陰性，革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，顯微鏡下出現(xiàn)“Y”或“V”型的分 叉狀或棒狀形態(tài)的桿菌為雙歧桿菌。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)培養(yǎng)液是在無(wú)菌條件下，在IOOOmL 470C MRS培養(yǎng)基中加入50mL抗生素溶液，混勻后制成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酸牛奶中雙歧桿菌的檢測(cè)方法，包括稀釋液、培養(yǎng)基和抗生素溶液配制；樣品處理培養(yǎng)物培養(yǎng)；菌落計(jì)數(shù)；顯微鏡檢查、革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。所述抗生素溶液包含硫酸新霉素和硫酸巴龍霉素。本發(fā)明方法能夠有效的排除其他乳酸菌的干擾，準(zhǔn)確檢測(cè)出含有4種乳酸菌酸牛奶中雙歧桿菌的活菌數(shù)量，降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101851664SQ20091026538
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者代青梅, 劉愛(ài)萍, 牛天嬌, 蔣菁莉, 趙紅峰 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司