專利名稱：一種l-艾杜糖脫氫酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種L-艾杜糖脫氫酶及其編碼基因與表達 方法、應用。
背景技術：
維生素C對人類來說是非常重要且必不可少的營養(yǎng)因子。維生素C還用于動物 飼料，盡管一些畜牧動物自身體內可以合成維生素C。在過去的幾十年中，已通過公認的 Reihcstein方法從D-葡萄糖對維生素C進行了工業(yè)生產。該工藝中只有一個步驟(D-山 梨醇到L-山梨糖的轉化)是通過微生物轉化進行的，其它步驟都是通過化學方式進行的。 維生素C的化學生產方法具有諸多缺陷，例如高能耗以及大量使用有機及無機試劑。因此， 在過去的數十年中，人們一直在研究更加經濟且環(huán)保的用微生物轉化來生產維生素C的方 法。2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)是合成抗壞血酸(維生素C)的重要中間體。已知有 多種微生物能將L-山梨醇/山梨糖轉化為2-KGA，如Stoddard等所用的NRRLB-21627 (美 國專禾Ij US5834231)，T. Hoshino等所提到的DSM4025 (歐洲專禾Ij EP9611500. 8)，尹光琳等 提到的SCB329等(中國專利CN96116464. 6)。有文獻報道用微生物能夠將L-山梨糖轉化 為2-KGA，例如，美國專利US3907. 639公開了屬于醋菌屬、假單孢菌、沙雷氏桿菌、葡萄狀球 菌、氣桿菌、產堿桿菌、青霉菌、假絲酵母以及葡萄糖酸菌的微生物具有上述轉化活性。對比化學合成法生產維生素C的七步化學反應，用微生物經2步發(fā)酵由山梨醇生 成2-KGA，再經甲醇酯化生成維生素C是目前中國通用的方法。但在2步發(fā)酵中使用了 3種 微生物，即在由L-山梨糖到2-KGA的轉化過程中有2種微生物參與，其中一個是轉化L-山 梨糖為2-KGA的酮古龍酸菌。但是，酮古龍酸菌通常單獨生長較慢，2-KGA的轉化率較低，所 以目前工業(yè)生產應用的均是采用兩菌共生，如枯草桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等 與酮古龍酸菌共同發(fā)酵。因此，在實際生產中存在相當多的問題，比如轉化率低、工藝控制 較為復雜等。

發(fā)明內容
酮古龍酸菌在將L-山梨糖轉化為2-KGA的過程中，其中2-KGA旁路代謝的關鍵 酶——L-艾杜糖脫氫酶會將2-KGA轉化為L-艾杜糖酸，這條代謝途徑對于2-KGA的生產 是不利的，降低了 2-KGA的產率。本發(fā)明采用同源重組的方法用體外突變失活的L-艾杜 糖脫氫酶基因替換酮古龍酸菌基因組上正常的L-艾杜糖脫氫酶基因，對酮古龍酸菌中編 碼L-艾杜糖脫氫酶的基因進行敲除，使宿主菌中的L-艾杜糖脫氫酶基因永久失活，阻斷了 2-KGA到L-艾杜糖酸的代謝途徑，使得已產生的2-KGA不再被代謝為L-艾杜糖酸，提高了 2-KGA的產量和質量。本發(fā)明的目的之一是提供一種L-艾杜糖脫氫酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的L-艾杜糖脫氫酶(rIDH)是具有序列表中SEQ ID No :2氨基酸殘基序列的蛋白質或與序列表中SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列具有至少80%同源性且具 有與SEQ ID N2 :2相同活性的由SEQ ID N2 :2衍生的蛋白質。本發(fā)明的L-艾杜糖脫氫酶 分子量為35，730道爾頓。
所述 SEQ ID Na :2 來源于酮古龍酸菌(Ketogulonogenium vulgarum) Welcome S, 由343個氨基酸殘基組成。其中，酮古龍酸菌(Ketogulonogenium vu lgarum) Welcome S已 于2009年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址湖北省武漢市武昌珞珈山武 漢大學)，保藏號為CCTCC NO :M209304。所述與序列表中SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列具有至少80%同源性且具有與 SEQ ID Na 2相同活性的由SEQ ID Na 2衍生的蛋白質優(yōu)選為與SEQ ID Na 2具有至少 90%同源性且具有與SEQ ID N2 :2相同活性的由SEQ ID N2 :2衍生的蛋白質，尤其優(yōu)選為 將SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有 與SEQ ID Na 2相同活性的由SEQ ID Na 2衍生的蛋白質。所述L-艾杜糖脫氫酶可為序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列或與序列表中SEQ ID No :1具有至少80%同源性的DNA序列在宿主菌大腸桿菌或畢赤酵母中表達得到的蛋白 質。本發(fā)明提供的L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的 SEQ ID Na 1 ；2)編碼序列表中SEQ ID Na 2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID Na 1限定的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質的DNA序列，其中，優(yōu)選為與序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列具有90%以 上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。所述 SEQ ID Ns :1 來源于酮古龍酸菌(Ketogulonogenium vu lgarum) Welcome S CCTCC NO :M209304,由1032個堿基組成，該基因的開放閱讀框架(ORF)為自5，端第1到第 1029位堿基。含有本發(fā)明基因的表達載體和細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍，利用現有分子生 物學的方法可以得到不同的表達載體和細胞系(工程菌)，如含有本發(fā)明基因的大腸桿菌 BL21(DE3)。也可用常規(guī)方法將含有本發(fā)明基因的上述工程菌固定于不同的載體中，制備固 定化細胞。另外，還可用常規(guī)方法將本發(fā)明的L-艾杜糖脫氫酶固定在瓊脂糖、丙烯酰胺、藻 酸鈉等支持物上，制備固定化酶。本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達L-艾杜糖脫氫酶的方法。本發(fā)明所提供的表達L-艾杜糖脫氫酶的方法，是將以酮古龍酸菌 (Ketogulonogenium vu lgarum) Welcome S CCTCC NO :M209304 基因組 DNA 為模板擴增得到 的L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因導入表達宿主菌，得到陽性克隆，培養(yǎng)陽性克隆，表達L-艾 杜糖脫氫酶。可使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，例如根 據SEQ ID N2 :3和SEQ ID N2 :4的核苷酸引物，根據PCR擴增技術，通過核酸擴增獲得上 文定義的核酸，即與序列表中SEQ IDNo 1限定的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼 相同功能蛋白質的DNA序列。由此擴增的核酸可被克隆進合適的載體，并通過DNA序列分析對其加以表征。其中，酮古龍酸菌(Ketogulonogenium vulgarum)Welcome S CCTCC NO: M209304基因組DNA、cDNA、mRNA可按常規(guī)方法獲取。其中，SEQ ID Na 3由28個堿基組成， SEQ ID Ns :4由28個堿基組成。所述陽性克隆可為含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌 BL21(DE3)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。本發(fā)明的L-艾杜糖脫氫酶依賴于輔酶PMS，該酶屬于氧化還原酶家族，將L-艾杜 糖酸轉化為2-KGA的PH范圍為5. 0-9. O，最適為7. 5。具體地，本發(fā)明涉及1) 一種L-艾杜糖脫氫酶，是序列表中SEQ ID NO :2氨基酸殘基序列表示的蛋白 質，或與序列表中SEQ ID NO 2序列具有至少80%同源性且具有與SEQ ID Na 2相同活性 的由SEQ ID Na :2衍生的蛋白質。2)根據項1)所述的L-艾杜糖脫氫酶，是與序列表中SEQ ID NO 2序列具有至 少90%同源性且具有與SEQ ID Na 2相同活性的由SEQ ID Na 2衍生的蛋白質。3)根據項1)所述的L-艾杜糖脫氫酶，是序列表中SEQ ID No 1的DNA序列或與 序列表中SEQ ID Na 1具有至少80%同源性的DNA序列在宿主菌大腸桿菌或畢赤酵母中 表達得到的蛋白質。4) 一種L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一①序列表中的SEQ ID Na 1 ；②編碼序列表中SEQ ID Na 2氨基酸殘基序列的多核苷酸；③與序列表中SEQ ID No 1的DNA序列具有至少80%同源性且編碼相同功能蛋 白質的DNA序列。5)含有項4)所述基因的表達載體。6)含有項4)所述基因的細胞系。7)根據項6)所述的細胞系，其是含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的大腸桿菌或畢 赤酵母。8)根據項7)所述的細胞系，其是固定化細胞。9) 一種表達L-艾杜糖脫氫酶的方法，是將以酮古龍酸菌CCTCC NO :M209304基因 組DNA為模板擴增得到的L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因導入表達宿主菌，得到陽性克隆，培 養(yǎng)陽性克隆，表達L-艾杜糖脫氫酶。10)根據項9)所述的方法，其中所述擴增步驟的引物為序列表中SEQ ID No 3和 SEQ ID Na :4。11)根據項9)所述的方法，其中陽性克隆為含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的大腸 桿菌DH5a或大腸桿菌BL21(DE3)。12)項1 3任一所述的L-艾杜糖脫氫酶、權利要求4所述的L-艾杜糖脫氫酶 的編碼基因、權利要求5所述的含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的表達載體、權利要求6 8任一所述的含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的細胞系在L-山梨糖轉化為2-KGA過程中的應用。 本發(fā)明的rIDH編碼基因為2-KGA合成中的一個重要基因，可利用本發(fā)明的L-艾 杜糖脫氫酶基因對現有的2-KGA產生菌進行改造、定向育種，提高2-KGA的產量，如將本發(fā)明的L-艾杜糖脫氫酶基因通過基因敲除的方法對現有的2-KGA產生菌進行基因改造，或用 分子生物學手段表達本發(fā)明的L-艾杜糖脫氫酶基因，利用固定化酶法或固定化細胞法在 體外合成2-KGA，或合成本發(fā)明的L-艾杜糖脫氫酶基因對應的蛋白質用于2-KGA的生產，降 低2-KGA的生產成本、提高2-KGA的轉化率、減少對環(huán)境的污染、減少生產過程對能源的需 求、提高產品的質量。本發(fā)明通過對酮古龍酸菌(Ketogulonogeniumvulgarum)Welcome S CCTCCNO M209304的全基因組序列測定，經基因注釋，預測出與2-酮基-L-古龍酸合成有關的酶基 因-L-艾杜糖脫氫酶基因。用分子生物學手段將該基因表達于不同的載體及宿主中所產 生的蛋白(酶)均能在體外有效地將L-艾杜糖酸轉化為2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)，不 論任何形式表達的L-艾杜糖脫氫酶(包含體，分泌蛋白，融合蛋白)均在體外具有L-艾杜 糖脫氫酶活性。另一方面，本發(fā)明利用分子生物學手段，將酮古龍酸菌(Ketogulonogenium vulgarum) Welcome SCCTCC NO :M209304的L-艾杜糖脫氫酶基因敲除，并將構建的基因工 程菌進行小規(guī)模上罐實驗，相應于出發(fā)菌株，2-KGA的轉化率提高了 1_2%。


圖1為L-艾杜糖脫氫酶基因的PCR擴增產物的電泳圖譜，其中，1為L-艾杜糖脫 氫酶基因PCR產物，2為Ikb ladder，分子量標準(marker)從小到大依次為250bp，500bp， 750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,2500bp, 3000 bp,3500bp,4000bp,5000bp,6000bp, 8000bp, IOOOObp。圖2為L-艾杜糖脫氫酶基因在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達產物的SDS-PAGE圖 譜，其中，從左至右:1，2，3，4，5，7，8為表達用大腸桿菌BL21(DE3)(含質粒PET-39b-IDH) 經誘導后全細胞裂解物SDS-PAGE電泳條帶；6為重分子量標準；9，10為誘導前全細胞裂解 物SDS-PAGE電泳條帶。圖3為Chelating-SFF層析對陽性克隆大腸桿菌BL21 (DE3)融合表達的rIDH純 化后的SDS-PAGE電泳圖譜，其中，1為重分子量Marker，2為40% (NH4)2SO4沉淀，3為過親 和層析柱粗純的酶。圖4為L-艾杜糖脫氫酶基因敲除PCR擴增產物的電泳圖譜，其中，1為L-艾杜糖 脫氫酶基因敲除PCR產物，2為Ikb ladder，分子量標準(marker)從小到大依次為250bp， 500bp,750bp,1000bp,1500bp,2000bp,2500bp,3000bp,3500bp,4000bp,5000bp,6000bp, 8000bp,10000bp。圖5為實現L-艾杜糖脫氫酶基因敲除的菌落PCR鑒定圖譜，點樣順序從左到右為 32，35，39，40，41，45，50，98，陽性對照，酮古龍酸菌基因組，陰性對照，1Kb ladder。
具體實施例方式本發(fā)明使用的分子生物學操作通用菌株，如大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌BL21 (DE3) 和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等均為市購，pGEM-T-VECTOR、T4DNA連接酶購自 Promega公司，表達載體PET_39b購自Strategene公司，其它有機及無機化學試劑均為市 購。實施例IL-艾杜糖脫氫酶基因的獲得
收集對數生長期的酮古龍酸菌(Ketogulonogeniumvulgarum)Welcome S (CCTCC NO :M209304)，以細菌基因組DNA提取方法(精編分子生物學實驗指南，第三版，F.奧斯伯 等著，科學出版社，1998年，第39頁)提取基因組DNA，按全基因組鳥槍法進行基因組序列 測定(Fleischmann RD, Adams MD，etal. Science. 1995. 269(5223) :496_512)，共進行 35000 個反應；測序總長度達18M，為其染色體DNA近6倍的覆蓋率。然后用PHRED-PHRAP，GLIMMER 軟件包拼接注釋，并進行ORF預測。根據基因注釋結果，預測L-艾杜糖脫氫酶基因序列為 SEQ ID Ns 1。實施 例2L-艾杜糖脫氫酶基因的表達l、PET_39b (Strategene)表達 rIDHPET_39b 表達引物5，引物catatgAAAGCCATTGTCATCCATGCCG(SEQ ID Na 3)3，引物ctcgagGGCAAAGGCGATCTGCGTCTTG(SEQ ID Na 4)以酮古龍酸菌(Ketogulonogenium vu lgarum) Welcome S (CCTCC NO :M209304)基 因組DNA為模板進行PCR反應，50 μ 1體系中含有終濃度為1. 5mmol/L的MgC12，0. 2mmol/L 的 dNTPs，各 0. 2 μ mol/L 的 5，引物和 3，引物，IOmmol/L 的 Tris-HCl，2u 的 TaqDNA 聚合酶； PCR反應條件為94°C 5分鐘；然后在如下條件下進行30個循環(huán)94°C 1分鐘，55°C 1分鐘， 720C 2分鐘；72°C 10分鐘。PCR產物電泳結果如圖1所示，表明PCR產物大小為1. 032Kb。PCR產物經電泳回收純化，與pGEM-T-VECTOR用T4DNA連接酶連接，然后轉化大腸 桿菌DH5 α，挑取白斑，用QIAGEN的MINI質粒提取柱提取質粒并經Ndel/Xhol酶切驗證，找 出正確插入的pGEMT-IDH質粒后，經Ndel/Xhol酶切并瓊脂糖電泳回收1. 032kb的基因片 段后，與表達載體PET-39b連接，轉化大腸桿菌DH5 α，鋪平板(含AMP100g/ml)，挑取克隆 并用Ndel/Xhol酶切鑒定，得陽性克隆質粒PET-39b-IDH。提取質粒PET-39b-IDH，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。挑單菌落接種到5mlLB培養(yǎng) 基中(含Kan 10(^8/1111)371培養(yǎng)過夜，按1%接種量接種到5011111^培養(yǎng)基中(含Kan 100 μ g/ml)培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6-1，加IPTG誘導(終濃度1. 0mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時， 離心收集菌體，進行SDS-PAGE檢測，結果如圖2所示。表明在36828道爾頓處檢測到特異 條帶，說明檢測到L-艾杜糖脫氫酶基因的表達產物。實施例3L-艾杜糖脫氫酶的功能驗證1、酶活性測定參照文獻(Agri.Biol. Chem. 54(5) 1211-1218，1990)和 SugiSANA等(Agric,Biol, Chem，55，363-370，1991)，利用分光光度計測定吸光度的方法檢測L-艾杜糖脫氫酶的酶活 性。建立以2-KGA、D-山梨醇、L-山梨糖為底物，以DCIP為顯色劑的酶活性測定方法第一 個 EP 管中，加入 Iml 的反應溶液，包括 0. ImM 的 DCIP(2，6-dichlorophenol indophenol, 2. 6- 二氯酚靛酚)，0· ImM 的 PMS(phenazine methosulphate,吩嗪硫酸甲酯)，125mM 的底 物，50mM的Tris-HCLbuffer (pH8. 0)，10 μ 1酶(親和層析粗純)，第二個管中包含除底物 外的其他所有反應物，用以分光光度檢測時調零。第一個管子最后加入酶，加入后兩個管 子立刻同時進行分光光度分析，通過第一管的讀數得到酶活性數值。經測定，結果如表1所 示，L-艾杜糖脫氫酶相應于2-KGA、D-山梨醇、L-山梨糖底物酶活性分別30. 6units/mg, 0units/mg、0units/mg。1個酶單位定義為1分鐘內催化1 μ mol DCIP的酶量。
表1陽性克隆大腸桿菌BL21 (DE3)融合表達的rIDH的活性
權利要求
1.一種L-艾杜糖脫氫酶，是序列表中SEQ ID NO :2氨基酸殘基序列表示的蛋白質，或 與序列表中SEQ ID NO 2序列具有至少80%同源性且具有與SEQ ID Na 2相同活性的由 SEQ ID Na :2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的L-艾杜糖脫氫酶，是與序列表中SEQID NO :2序列具有至 少90%同源性且具有與SEQ ID Na 2相同活性的由SEQ ID Na 2衍生的蛋白質。
3.根據權利要求1所述的L-艾杜糖脫氫酶，是序列表中SEQID N2:l的DNA序列或 與序列表中SEQ ID Na 1具有至少80%同源性的DNA序列在宿主菌大腸桿菌或畢赤酵母 中表達得到的蛋白質。
4.一種L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQID Na 1 ；2)編碼序列表中SEQID No 2氨基酸殘基序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID N2 :1的DNA序列具有至少80%同源性且編碼相同功能蛋白質 的DNA序列。
5.含有權利要求4所述基因的表達載體。
6.含有權利要求4所述基因的細胞系。
7.根據權利要求6所述的細胞系，其是含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的大腸桿菌或畢 赤酵母。
8.根據權利要求7所述的細胞系，其是固定化細胞。
9.一種表達L-艾杜糖脫氫酶的方法，是將以酮古龍酸菌CCTCC N0:M209304基因組 DNA為模板擴增得到的L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因導入表達宿主菌，得到陽性克隆，培養(yǎng) 陽性克隆，表達L-艾杜糖脫氫酶。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述擴增步驟的引物為序列表中SEQIDN2 :3和 SEQ ID Na :4。
11.根據權利要求9所述的方法，其中陽性克隆為含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的大 腸桿菌DH5a或大腸桿菌BL21(DE3)。
12.權利要求1 3任一所述的L-艾杜糖脫氫酶、權利要求4所述的L-艾杜糖脫氫酶 的編碼基因、權利要求5所述的含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的表達載體、權利要求6 8任一所述的含有L-艾杜糖脫氫酶編碼基因的細胞系在L-山梨糖轉化為2-KGA過程中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種L-艾杜糖脫氫酶，是序列表中SEQ ID NO2氨基酸殘基序列表示的蛋白質，或與序列表中SEQ ID NO2序列具有至少80％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。本發(fā)明還涉及上述L-艾杜糖脫氫酶的編碼基因及其表達載體、細胞系，以及在L-山梨糖轉化為2-KGA過程中的應用。
文檔編號C12P7/60GK102108343SQ200910265308
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權日2009年12月29日
發(fā)明者修建新, 吳洪濤, 孫君偉, 崔永濤, 朱欣杰, 李錦 , 楊麗霞, 米造吉, 謝萍, 賈茜, 黃艷敏 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司, 河北維爾康制藥有限公司