專利名稱：融合肝素酶及其編碼基因與制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶工程和生物催化領域，特別涉及融合肝素酶及其編碼基因與制備 方法。
背景技術：
肝素酶(h印arinase)是一類作用于肝素的多糖裂解酶，在許多種微生物中發(fā) 現(xiàn)，包括棒桿菌foi777^a"en'咖sp.(高寧國等，肝素酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條 件，微生物學報1999 Vol. 39:64-67)、鞘胺醇桿菌5^ jV^otecfen'柳sp.(高 寧國等，鞘胺醇桿菌肝素酶的產(chǎn)生，微生物學報2003 Vol. 43:813-816)、枯草芽 胞桿菌^3"77m s"力"'7is(王忠彥等，肝素酶產(chǎn)生菌的篩選及其粗酶性質(zhì)的研究， 四川大學學報(自然科學版)2002 Vol. 39:777-779)、環(huán)狀芽孢桿菌Asw77m c irci/7s/751 (Yasutaka Tahara et al. ， Purification and characterization of h 印arinase that degrades both heparin and heparin sulfate from 5acj'77iAs ci薦7馬BioSci. Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66:1181-1184)、解肝素 擬桿菌尸i"erate2Js力e/ arz./70^ics (Kazuyuki Sugahara et al. ， Characteriz at ion of heparinase from an oral bacterium尸reKote2Z3 / e/ ar//2aZ/f_z'cs J. Biochem. 1998 Vol. 123:283-288)、糞便擬桿菌5a"eroiofes Warcoris HJ-15 (D ong Hyuu Kim et al. ， Purification and characterization of a novel hepar inase from 5acfe渭Ves sfe徹"'5"耵-15 J. Biochem. 2000 Vol.128: 323-328) 和肝素黃桿菌尸7araZ a"eri咖力e/ ari/7咖(Sasiekharan, R. 1991 Ph.D. Thesis, Havard University)。但是來自肝素黃桿菌的肝素酶是商業(yè)化的唯一來源。
肝素酶的研究具有十分重要的意義(Sasiekharan，R. 1991 Ph. D. Thesis, Ha vard University; Sasiekharan，R. et al. ，A comparative analysis of the prim axy sequences and characteristics of heparinase I，II，and III from F73ra Z acteriw/z 力e/ arj'/ wffl Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229:770-777):肝素酶是多糖裂解酶的一種，用于研究肝素酶及其底物 多糖肝素之間的相互作用有助于闡明多糖裂解酶的作用機制；肝素酶可以用于解析 肝素等復雜粘多糖的結(jié)構(gòu)及其生物學功能；肝素酶可以用于解析人體內(nèi)的凝血和抗
3凝血機制；肝素酶可以用作臨床血液肝素化的去除，防止手術后出血；肝素酶用于 PCR反應前血液制品的處理；肝素酶可以用于制備低分子的抗凝血藥物低分子量肝 素。
來自肝素黃桿菌的肝素酶主要有三種，分別命名為肝素酶I (EC 4.2.2.7)、 II (NO EC code)和III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al. ， Purification and characterization of heparin lyases from F73ra6acte"'w/H力eparz'/3咖JEC 1992 Vol. 267:24347-24355)。其中肝素黃桿菌的肝素酶I (H印A)是目前為止研 究最充分的肝素酶之一，其在低分子肝素的生產(chǎn)和體外血液循環(huán)中肝素的去除上的 應用已有報道，具有巨大的市場開發(fā)價值。
肝素酶I通常是從肝素黃桿菌發(fā)酵液中提純獲得的，通常需要經(jīng)過多步的色譜 純化，收率比較低。肝素黃桿菌增長速度慢，肝素酶的生產(chǎn)穩(wěn)定性差，而且，產(chǎn)肝 素酶需要價格昂貴的肝素誘導，增加了酶的成本，因而重組菌生產(chǎn)肝素酶I受到極 大的關注，但通常情況下重組肝素酶I極容易形成包涵體，需要復雜的復性過程才 能形成活性蛋白。
來自大腸桿菌的天然的麥芽糖結(jié)合蛋白MBP能夠與麥芽糖特異吸附，參與大腸 桿菌對麥芽糖的轉(zhuǎn)運和利用。MBP不但能與amy lose結(jié)合，實現(xiàn)親和分離，也能與 馬鈴薯淀粉結(jié)合實現(xiàn)親和分離(廉德君等， 一種改進的融合蛋白親和層析純化方法， 生物化學與生物物理進展簡Vol. 25:283-284; Usha Srinivasan et al. ， A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions Journal of Biotechnology 1998 Vol. 62:163-167)，從而可大大降低 酶的分離純化的成本。本研究小組前期利用融合蛋白技術，將MBP與從肝素黃桿菌中克 隆得到肝素酶I融合，構(gòu)建了高效生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，5L發(fā)酵罐生 產(chǎn)酶活可達20000IU/L以上(Chen Yin, Xing Xin-hui, Ye Feng-chun, Kuang Ying, Luo Ming-fang. Production of MBP-HepA fusion protein in recombinant Escherichia coli by optimization of culture medium, Biochemical Engineering Journal, 2007， 34:114-121)。該法得到的重組肝素酶I只需進行一步親和層析就能達到95%的純化效果。 此項工作已申請專利，專利號為200410038098.6。
綠色熒光蛋白GFP，自從1994年Chalfie等(Chalfie M， Tu Y， Euskirchen G, Ward WW， Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994， 263:802-805 )首次在大腸桿菌細胞中表達出來后，
4由于該熒光蛋白穩(wěn)定、對細胞無毒性、熒光檢測簡單，而且產(chǎn)熒光不需要底物等特 點，已成為在生理學和生物技術的研究和開發(fā)中應用最廣泛的報告蛋白之一。但是，
目前為止GFP在生物學和生物技術中的應用主要側(cè)重于各種定性解析，將其應用于 蛋白質(zhì)生物生產(chǎn)過程的定量監(jiān)測及過程優(yōu)化是一個新的領域。Poppenborg等 (Poppenborg L， Friehs K， Flaschel E The green fluorescent protein is a versatile reporter for bioprocess monitoring. J. Biotechnol. 1997， 58:79-88 ) 首次證明了將GFP融合到一親和耙物上可以實現(xiàn)諸如培養(yǎng)、色譜分離等過程的快速 監(jiān)測。因此，GFP是用于定量快速監(jiān)測細胞培養(yǎng)、發(fā)酵過程優(yōu)化以及追蹤固定化酶 使用過程特性的具有極大潛力的工具。本實驗室前期利用融合蛋白技術，將GFP與從 肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I融合，構(gòu)建了生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株(Chen Yin, Xing Xin-hui, Ye Feng-chun， Kuang Ying. Soluble expression and rapid quantification of GFP-hepA fusion protein in recombinant Escherichia coli， Chinese Journal of Chemical Engineering, 2007, 15:122-126) 。 GFP的融合可以利 用熒光測量對工程菌濃度及肝素酶I酶活進行快速定量追蹤，有利于肝素酶I生產(chǎn)過程的 優(yōu)化和控制，有利于肝素酶的保存和應用過程的快速評價，有利于解析大分子肝素的結(jié)構(gòu) 和降解機理。此項工作已申請專利，專利號為200510090872.2。
現(xiàn)有的肝素酶I生產(chǎn)和催化工藝中，缺乏酶生產(chǎn)一分離一應用整個過程的集成 方法。因此，肝素酶I的高效可溶表達、分離純化、固定化、高效催化以及酶活的 快速檢測等多功能化集成就具有十分重要的意義。融合蛋白技術是實現(xiàn)這一多功能 化集成的有效手段之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合肝素酶。
本發(fā)明提供的融合肝素酶，命名為GFP-MBP-HepA，是如下a)或b)的蛋白
a) 序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
b) 在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
上述b)的蛋白的氨基酸序列具體可為序列表中序列1所示的氨基酸序列。 上述蛋白的編碼基因，命名為她-m^-7^/"，也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。 上述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；
2) 在高嚴謹條件下與序列表中序列2的核苷酸序列雜交且編碼上述蛋白的核苷 酸序列；
3) 與序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼上述蛋白 的核苷酸序列。
序列2中，g步的編碼區(qū)是序列2的自5'端第22-735位的堿基；m^的編碼區(qū)是 序列2的自5，端第778-1878位的堿基；//印乂的編碼區(qū)是序列2的自5，端第 1956-3045位的堿基。
所述高嚴謹條件是指，將雜交膜置于預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， PH7.2， 7%SDS)中，65。C預雜交30min;棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷 酸鈉緩沖液，pH7.2， 7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65t:雜交12hr;棄雜交 液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7,2， 5%SDS) ， 65。C洗膜2次，每次 30min;加入洗膜液II (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 1%SDS) ， 65t:洗膜30min。
含有上述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
上述重組載體是通過以下步驟構(gòu)建的-
將序列表中序列2的第1位-1878位所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位點，得到重組載體；
所述質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA是將序列2的第1956-3045位所示的肝素酶I的編 碼基因插入到質(zhì)粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位點之間，得到的重組質(zhì)粒。
含有權利要求上述基因的重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
上述重組菌是含有上述的重組載體的重組大腸桿菌。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)肝素酶的方法，是將上述的重組菌誘導培 養(yǎng)，表達得到肝素酶。
上述誘導培養(yǎng)條件是0.3-lmM的IPTG， 10-30。C誘導培養(yǎng)5-30小時。 搖瓶培養(yǎng)實驗證明本發(fā)明產(chǎn)生的融合肝素酶的酶活可達1214.4 IU/L培養(yǎng)基， 比酶活可達2.839 IU/mg蛋白。本發(fā)明可以利用GFP蛋白實現(xiàn)菌體濃度和酶活的快 速在線檢測。因為本發(fā)明中酶活與細菌濃度、熒光強度均存在著良好的線性關系， 可以利用熒光強度實現(xiàn)培養(yǎng)過程中細菌濃度以及酶活的快速定量。上述結(jié)果說明在 發(fā)酵培養(yǎng)過程中可以通過檢測熒光強度以快速獲得菌體濃度和肝素酶I的酶活的變 化，從而實現(xiàn)高效生產(chǎn)三重融合肝素酶I的培養(yǎng)過程優(yōu)化和控制。


圖1為表達載體pMAL-hepA的構(gòu)建過程示意圖。
圖2為從肝素黃桿菌中PCR擴增得到的肝素酶I基因電泳圖譜。
圖3為表達載體phGMH-L3的構(gòu)建過程示意圖。
圖4為大腸桿菌TBl/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株表達 GFP-MBP-HepA的SDS-PAGE電泳分析圖。
圖5為大腸桿菌TBl/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株15度誘導培養(yǎng) 21h后菌體濃度、粗酶液酶活及熒光量比較情況示意圖。
圖6為大腸桿菌TBl/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株15度誘導培養(yǎng) 21h后粗酶液比酶活及比熒光強度比較情況示意圖。
圖7為TOP10/phGMH-L3培養(yǎng)過程中細胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活(IU/L 培養(yǎng)基)和熒光強度(U/L)的變化曲線圖。
圖8為TOP10/phGMH-L3培養(yǎng)過程中細胞濃度(0D6。。)、熒光強度(U/L)與肝 素酶I的酶活(IU/L培養(yǎng)基)的關系曲線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。 下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1.綠色熒光蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白和肝素酶I三重融合蛋白的表達 一、三重融合蛋白的表達載體的構(gòu)建
1、含有麥芽糖結(jié)合蛋白和肝素酶I 二重融合蛋白編碼基因的表達載體 pMAL-c2x-H印A的構(gòu)建
表達載體pMAL-c2x-HepA的構(gòu)建過程如圖l所示，具體過程如下從肝素黃 桿菌(F/flvWa"eWwm //e戶〃'"wm)(購買自IAM)的染色體組DNA中擴增肝素酶 I基因，所用的引物分別為
上游引物5' -GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC -3'(帶下劃 線的堿基為BamHI的酶識別位點)，
下游引物5' - CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC- 3'(帶 下劃線的堿基為HindIII酶識別位點)，擴增后，分別引入Bamffl和HindIII酶識別位PCR擴增的反應體系為50ng模板DNA， 100pmol每種引物，lx擴增緩沖液 (北京天為生物技術有限公司)，200|imol/L每種dNTP, 1單位高保Pfii酶；擴增 程序為95攝氏度變性5分鐘，50-60 (51、 53、 55、 57或59°0攝氏度引物退火 45秒，72攝氏度引物延伸90秒，30個循環(huán)后，72攝氏度延伸5分鐘結(jié)束反應。 該PCR結(jié)果如圖2所示，表明擴增得到l.lkb的肝素酶I基因片段。測序表明，該 片段具有自序列表中序列2的5'端第1956位-3045位核苷酸序列。圖2中，泳道 2-6分別為引物退火溫度為51、 53、 55、 57或59'C擴增結(jié)果，泳道1為分子量marker (條帶大小依次為15kb、 10kb、 7500bp、 5000bp、 2500bp、 1000bp、 750bp)，箭 頭所指處為l.lkb目標片段。
將上述得到的PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII雙酶切后，分別插入到購自美國N ew England Biolabs公司的pMAL-c2x載體的BamHI和HindIII酶識別位點之間， 得到pMAL-c2x重組載體，將pMAL-c2x重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以5'GCC TGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3，和5， CTTAAAGCTTTTACTATCT GGCAGTTTCGCTGTAC 3'為引物，通過菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，提取可得到l.lkb PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子中的pMAL-c2x重組載體，分別通過BamHI和Hindin雙酶切驗 證。將通過BamHI和HindIII雙酶切得到Ukb片段的質(zhì)粒進行測序，將含有具有 序列表中序列2的5'端第1956位-3045位的核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白編碼基 因的pMal-c2x重組載體命名為pMAL-c2x-HepA。在pMAL-c2x-HepA中，T/e;^基 因與/flcZa基因之間有兩個連續(xù)的終止密碼TAGTAA，從而能夠有效地終止蛋白翻 譯不會表達lacZa蛋白。
2、三重融合蛋白表達載體phGMH的構(gòu)建
根據(jù)三重融合蛋白中連接綠色熒光蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白的氨基酸殘基序列 不同，我們構(gòu)建了phGMH表達載體，命名為phGMH-L3。 phGMH-L3中連接GFP 與MBP的氨基酸殘基序列為S3N1()I，構(gòu)建過程如圖3所示。具體過程如下
phGMH-L3的構(gòu)建過程 以質(zhì)粒pSG1729 (從Bac川us Genetic Stock Center獲得)為模板，用上游引 物5' CGAGCACTTCACGAACAAGGACCATAGCATATTAATCATCATCATCAT CATCATATGAGTAAAGGAGAAG 3'(帶下劃線的堿基為Asel酶識別位點)和 下游弓I物5' GATCCCATTAATGTTGTTGTTATTGTTATTGTTGTTGTTGTTCGAGCTCGATTTGTATAGTTCATCCAT 3'(帶下劃線的堿基為Asel酶識別位點)擴 增帶有組氨酸標記His6的綠色熒光蛋白基因/^-g步，兩端均引入Asel酶識別位點。
PCR擴增的反應體系為50ng模板DNA， lOOpmol每種引物，2XTransTaq High Fidelity (HiFi) PCRSuperMixII;擴增程序為95攝氏度變性5分鐘，60。C退火 45秒，72攝氏度引物延伸90秒，30個循環(huán)后，72攝氏度延伸10分鐘結(jié)束反應。 測序表明，/^-g步具有SEQ ID Na: 2中5'端第1-735位核苷酸序列。
將上述得到的PCR產(chǎn)物用Ase I酶切后，與pMAL-c2x-HepA經(jīng)Ndel (酶切位點為CATATG)單酶切后的大片斷用T4DNA連接酶，得到重組載體，將 將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。篩選出重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并通過序列測定確認(美國 Invitrogen公司)。將含有三重融合蛋白的編碼基因(如序列表中序列2所示)的 重組載體命名為phGMH-L3。其中，g步的編碼區(qū)是序列2的自5，端第22-735位 的堿基；m^的編碼區(qū)是序列2的自5，端第778-1878位的堿基；壓W的編碼區(qū) 是序列2的自5'端第1956-3045位的堿基。
二、三重融合蛋白的表達 1、誘導表達
提取步驟一中含有phGMH-L3的大腸桿菌DH5 a中的質(zhì)粒，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化 大腸桿菌TBI和TOPIO，經(jīng)過氨芐青霉素篩選和利用步驟一中2提供的引物進行 菌落PCR鑒定，得到含有phGMH-L3的大腸桿菌TBI和TOPIO，即TBl/phGMH-L3 和TOP10/phGMH-L3作為表達GFP-MBP-HepA的工程菌。
以質(zhì)粒pMAL-c2x轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBI和TOPIO，得到空載體對照 TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x。
以下操作對上面的工程菌平行進行。
將空載體對照和工程菌分別在LB培養(yǎng)基(含IOO pg/ml氨芐青霉素)37T:培 養(yǎng)至OD咖約為0. 600附近后，加入終濃度為0. 3 mM IPTG 15"C進行誘導培養(yǎng)21h。 10000 rpm, 8min離心收集菌體并用20咖ol/L Tris-HC1 (pH 7.4)洗滌兩次，重 懸至0De。。約為8.000附近，取樣40pl做細胞全蛋白組分SDS—PAGE電泳。將上面 0De。。約為8. 00重懸液進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的 處理198次)，12000rpm, 30min取上清液40|il做可溶蛋白組分SDS—PAGE電泳。 結(jié)果如圖4所示，圖4中3個M均為marker (從上而下分子量依次均為120kDa、100kDa、 65kDa、 50kDa) ， Cl為空載體對照TOP10/pMAL-c2x全蛋白組分；C2為空 載體對照TBl/pMAL-c2x的全蛋白組分；S9、 S10分別為大腸桿菌TBI (phGMHS-L3) 的全蛋白組分和可溶蛋白組分；Sll、 S12分別為大腸桿菌TOPIO(phGMHS-L3)的全 蛋白組分和可溶蛋白組分。
結(jié)果表明空載體對照菌株TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x誘導培養(yǎng)后無 熒光無酶活，其它工程菌均表達出了可溶性的GFP-MBP-HepA三重融合蛋白，其 中大腸桿菌TOPIO中的表達效果均要優(yōu)于大腸桿菌TB1。并且經(jīng)過測序， TBl/phGMH-L3、 TOP10/phGMH-L3表達出的蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所 示。并且該融合蛋白的GFP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第8-245位所示；該 融合蛋白的MBP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第260-626所示；該融合蛋白 的HepA的氨基酸序列如序列1的自氨基端第653-1015所示。
2、酶活及熒光強度檢測分析
粗酶液即為上面步驟中超聲破碎后離心所得的上清液。酶活力(單位為IU/L) 的檢測采用232 nm的光吸收法，1IU的酶活的定義為30。C每分鐘產(chǎn)生lpmol不飽 和鍵的反應效力。取肝素底物溶液0.5 ml(25 g/L肝素，40 mMNaCl， 3.5 mM CaCl2， 17mMTris-HCl， pH7.4)，加入步驟3中所得的粗酶液，其它體積以Tris緩沖液 補充，最終的反應液體積為1.5ml，測單位時間內(nèi)在232nm的吸光度變化AA232。 消光系數(shù)e二3800IVr1。比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗酶液蛋 白濃度(單位為mg/L)的比值。蛋白濃度監(jiān)測采用常規(guī)的Bradford法。熒光強度 (單位為U/L)檢測采用熒光分光光度計HITACHI F-2500，激發(fā)波長為488nra，檢測 吸收波長為512nm。比熒光強度定義為熒光強度與粗酶液蛋白濃度(單位為mg/L) 的比值。
15'C誘導培養(yǎng)空載體對照和工程菌21h后，OD6。G、酶活、熒光強度結(jié)果如圖5 所示，比酶活和比熒光強度結(jié)果如圖6所示，其中空載體對照誘導培養(yǎng)后無熒光無 酶活未在圖上顯示，大腸桿菌TOP10/phGMH-L3的粗酶液和比酶活很高，酶活可 達517.2 IU/L培養(yǎng)基，比酶活可達2.839 IU/mg蛋白，比熒光強度可達0.858 IU/mg 蛋白。
實施例2.三重融合蛋白肝素酶酶活的熒光定量追蹤
10根據(jù)實施例1的結(jié)果，我們選取大腸桿菌TOP10/phGMH-L3進行了三重融合 蛋白肝素酶酶活的熒光定量追蹤實驗。用含IOO (ig/ml氨芐青霉素的M9YE培養(yǎng)基 (17. 1 g/L Na2HP04 12H20， 3. 0 g/L KH2P04， 0. 5 g/L NaCl; 1. 0 g/L NH4C1， 12. 5 g/L 酵母提取物，12 g/L葡萄糖)對TOP10/phGMH-L3進行培養(yǎng),在37。C培養(yǎng)大約3. 5 小時(至0De。。為0. 735)后，加入終濃度為0. 3 mM的IPTG，并將培養(yǎng)溫度改為15 'C進行誘導培養(yǎng)。之后每隔2小時，取2ml菌液分別測其細胞濃度(OD6co)、肝素 酶I的酶活和熒光強度(熒光分光光度計HITACHI F-2500)，直至誘導培養(yǎng)30小 時。
肝素酶I的酶活是按照實施例1步驟二中的步驟2的方法測定，結(jié)果表明肝素 酶I的酶活隨著誘導時間的延長，表達量逐漸增加。熒光強度的測定分為兩種方式 方式1是直接利用菌液測定熒光強度值，方式2是將菌液離心后用相同體積的20 mM 的Tris緩沖液(pH7.4)重懸，用實施例1中步驟二中的步驟1的方法超聲破碎后 離心去上清來測定熒光強度值。
培養(yǎng)過程的細胞濃度(OD,)、肝素酶I的酶活(IU/L培養(yǎng)基)和熒光強度(RFU) 的變化如圖7所示,最高酶活可達1214.4 IU/L培養(yǎng)基。隨著誘導時間的增加，細胞 濃度、酶活和熒光量均增加，但由于細胞散射的影響，方式l所測得的熒光強度偏 小，且細胞濃度越大，偏差越大。此時可通過方式2來準確測量熒光量。
為進一步研究利用GFP蛋白實現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在線檢測，我們研究了 酶活與0D6。。、熒光強度的關系，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，酶活與細菌濃度、熒 光強度均存在著良好的線性關系，可以利用熒光強度實現(xiàn)培養(yǎng)過程中細菌濃度以及 酶活的快速定量。上述結(jié)果說明在發(fā)酵培養(yǎng)過程中可以通過檢測熒光強度以快速獲 得菌體濃度和肝素酶I的酶活的變化，從而實現(xiàn)高效生產(chǎn)三重融合肝素酶I的培養(yǎng) 過程優(yōu)化和控制。序列表
<110>清華大學
<120>融合肝素酶及其編碼基因
<130〉 CGGNARL92435
<160> 2
<210> 1
<211> 1015
〈212> PRT 〈213>人工序列 〈220〉 <230〉
<400> 1
Met His 1
Gly Val
His His His His His Met 5
lie Leu Val Glu
Val
Lys Phe Ser 35 Leu
Leu Thr 50 Pro Thr 65
Tyr Pro
Leu
Pro 20 Val
Lys
Val
His
Asp
Glu Gly Tyr Val
Ser
Leu 25 Glu
Lys
10
Asp
Gly Glu Glu Leu Gly Asp Val Asp1 Ala
Asn 30 Tyr
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
40 45
Phe lie Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
55 60
Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe
70 75
Met Lys Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 85 90
Gin Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp
Phe Thr 15
Gly His
Gly Lys
Pro Trp
Ser Arg
80 Met Pro 95
Gly AsnTyr
Arg
Gly 145 Ala
Asn
lie 130 His
Asp
lie
100
Arg Ala Glu Val
Thr 115
Glu Leu Lys Gly
Lys Lys Glu
Leu Glu Tyr 150 Asn
Thr Pro lie 195 Gin
Ser
Gin
Asp 180 Gly
Ser
Lys 165 Gly
Thr 210
Val Leu Leu Glu
Met 225
Asp Glu Leu Tyr
Asn Asn lie Met 260 Gly
Lys 245 Lys
Gly
Lys
Glu 305 Phe
Ala
Asp
Lys 275 Thr
Leu
lie 135 Asn
Gly
Val
Lys 120 Asp
Tyr
lie
105
Phe Glu Gly Asp
Phe
Asn
Lys
Lys Ser
Glu
His 155 Asn
110
Thr Leu Val Asn 125
Gly Asn lie Leu
Asp 140
Asn Val Tyr lie
Phe
Ser Val Gin
Asp Gly Pro Ala
Val 170
Leu Ala Asp His 185
Leu Ser Pro Asp
Lys Tyr
Val 200
Lys Asp Pro Asn
Ser 215
Val Thr Ala Ala
Phe 230
Ser Ser Ser Asn
Glu 220
lie
Asn 205 Lys
lie
Gin 190 His
Arg 175 Gin
Tyr Asp
Thr His Gly
Met 160 His
Asn
Leu
Arg Asp His
Gly 235
Asn Asn Asn Asn
Asn 250
Lys Leu Val lie
lie Glu Glu Gly 265
Ala Glu Val Gly
Asn 255 lie
Met 240 Asn
Asn
Gly lie Lys
Asp 290
Lys Phe Pro Gin
Tyr Asn Gly lie
Leu 280
Thr Val Glu His
Val 295
Ala Ala Thr Gly
Trp Ala His Asp 325
Glu lie Thr Pro
Val 310
Arg Phe Gly Gly
Tyr 330 Gin
Asp 315 Ala
Pro 300 Gly
Lys 285 Asp
Trp 270
Lys Phe Glu
Lys Leu Glu Pro Asp Gin Ser Gly
lie Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gin Asp Lys Leu Tyr Pro Phe
lie
Leu 335 Pro
lie 320 Leu
13340
Ala Val Arg Tyr
Thr Trp Asp 355
Glu Ala Leu Ser
345
Gly Lys Leu lie
Ala
Pro 385 Ala
Val 370 Pro
Lys
Trp
Gly
Asn 360
lie Tyr Asn Lys
Lys Gly
Leu 375
Glu lie Pro Ala
350
Ala Tyr Pro lie 365
Leu Leu Pro Asn
Thr Trp Glu 390
Ala Leu Met Phe
Asp 380
Asp Lys Glu Leu
Lys
Thr Trp Pro
Ser 405
lie Ala Ala Asp
Leu 420
Tyr Asp lie Lys
Asn 410 Gly
Leu 395
Leu Gin Glu Pro
Asn Gly Lys 435
Lys Ala Gly Leu Thr Phe
Gly 425
Val Gly Val Asp
Asn 465 Glu
Ala 450
Ala
Asp 440
Val Asp Leu lie
Tyr Ala Phe Val
Tyr 415 Tyr
Lys 400 Phe
Glu
Lys 430
Ala Gly Ala
Asp Thr Asp Thr Ala Met Thr Ser Lys
Thr 485 Asn
Tyr 470 lie
Tyr
Leu 455 Ser
Asn Gly Pro
Asn 445
Asn Lys His Met
Lys 460
Ala Phe Asn Lys
lie Ala Glu Ala 475
Ala Trp Ser Asn
Val 500
Gin Pro Ser Lys Pro Phe 515
Pro Asn Lys Glu
Gly Val
Ala
Ser 530
Thr Asp Glu
Leu 545
Ala Val Ala Leu
Lys Gly
Gly
Val
Gly 520 Ala
Trp 490
Val Leu Pro Thr
Thr 505
Val Leu Ser Ala
lie 495 Lys
Gly 480 Asp
Gly
Phe 510
lie Asn Ala
Leu 535
Glu Ala Val Asn
Leu 550
Ser Tyr Glu Glu
Lys Glu Phe Val
Leu 540 Asp
Gly 525
Glu Asn Tyr Leu
Lys 565
lie Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gin Lys Gly Glu lie Met Pro Asn
Glu 570 Lys
Lys 555
Leu Ala Lys Asp
Lys Pro Leu Lys
Pro 575 Pro
Gly 560 Arg580
Met Ser Ala Phe
lie Pro Gin 595
Asn Ala Ala Ser Gly Arg
585
Tyr Ala Val Arg
Gin 625 Leu
Ser
Ala 610
Thr Asn Ser Ser
Trp 600
Thr Val Asp Glu
Gin 615
Asn Asn Asn Asn
Thr 605 Leu
590
Ala Val lie
Gly lie Glu Gly
Asn
lie 660 lie
Gly 645 Pro
Ser 630
Arg lie Ser Glu
Ala 620
Asn Asn Asn Asn
Asn 635
Gly Ser Gin Gin
Lys Asp Ala Asn
Gin Ser Glu 675
Pro Tyr Ala
690 Ser Tyr Arg 705
Ala Ala Gly Glu
Tyr Arg Val lie Asp Asn Leu Gin Tyr
Phe 650
Val Gin Ala Asp
Asn 665
Trp Val Ala Val
Lys 680
Asp Lys Leu Arg
Phe Glu Leu 710
JLys
Asp 695
Lys Ala Glu Asp
Thr Thr Asn Asp 740 Lys
Gin Lys Leu 755 Ser
Gly
Ser Ser Arg 770
Asp Asn Ala Thr
Thr 725 Phe
Thr
Ser
Lys Val Tyr
Gly Arg lie Lys Phe Tyr
Asn 715 Leu
Pro 785
Arg Thr Leu Val
His 760
Thr Phe Ser Val 775
lie Phe Ala Gin
Thr 790
Thr Pro Glu
Ala 805
Glu Glu Phe Heu Ala Leu Tyr Asp
Gly Arg
Glu 810 Met
Trp 795 lie
Gly 685 Asn
Ser 670 lie
Lys 655 Ala
Asn
Asn 640 Lys
Lys
Lys
Glu 730
Pro Ser Val
Phe 700
Ser Leu Glu Ser Tyr Ser
Gly Lys Pro
Pro 745
Tyr Gly Lys Gly
Tyr Tyr
Lys
Gly
Tyr 735 Asn
Tyr 720 Ala
Ala
Lys Tyr
Gin 750
Cys Glu Gin
lie 780 His
lie 765
Pro Ser Ser Phe
Gly Ala Pro Lys Thr Leu lie Phe Lys Lys
Ser 815 Asn
Ser 800 lie
lie820 825 830
Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys lie Thr Tyr
835 840 845
Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gin Gly Gly Tyr Pro
850 855 860
Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr lie Lys Ala Asn 865 870 875 880
Ser Asp Arg Gin Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn
885 890 895
Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr
900 905 910
Ser Thr lie Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gin Phe Pro Lys Asp Cys
915 920 925
Trp lie Thr Phe Asp Val Ala lie Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu
930 935 940
Ala Asn Thr lie Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr 945 950 955 960
Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gin Lys Ala His lie Val Asn Gin Gin Glu
965 970 975
lie Leu lie Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly
■ 985 990
lie Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser
995 1000 1005
Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg 1010 1015
〈210〉 2
〈211〉 3051
〈212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉 <230>
〈400〉 2
atgcaccacc8ccacc3ccacatg3gtaBagg卿agaacttttcactggagttgtccca60
attcttgttgaattagatggtgacgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggt120
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atggaaaacgccca^gaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctgg1800
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cgtaacgatgacgatggctattacttcaaatttggaatttac鄉(xiāng)gtcggtaacagcacg3000
gtcccggttacttataacctgagcgggtacagcgaaactgccagatagta61305權利要求
1、一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權利要求1所述的多功能融合肝素酶，其特征在于所述b)的蛋白的氨 基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3、 權利要求1或2所述蛋白的編碼基因。
4、 根據(jù)權利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；2) 在高嚴謹條件下與序列表中序列2的核苷酸序列雜交且編碼權利要求1或2所述 蛋白的核苷酸序列；3) 與序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼權利要求1 或2所述蛋白的核苷酸序列。
5、 含有權利要求3或4所述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細胞系。
6、 根據(jù)權利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是通過以下步 驟構(gòu)建的將序列表中序列2的第1位-1878位所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位點，得到重組載體；所述質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA是將序列2的第1956-3045位所示的肝素酶I的編碼 基因插入到質(zhì)粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位點之間，得到的重組質(zhì)粒。
7、 含有權利要求3或4所述基因的重組菌。
8、 根據(jù)權利要求7所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權利要求5 或6所述的重組載體的重組大腸桿菌。
9、 一種生產(chǎn)肝素酶的方法，是將權利要求7或8所述的重組菌誘導培養(yǎng)，表達 得到肝素酶。
10、 根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述誘導培養(yǎng)條件是0.3-lmM的 IPTG， 10-3(TC誘導培養(yǎng)5-30小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合肝素酶。該融合肝素酶是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)生的三重融合蛋白的酶活通過搖瓶培養(yǎng)可達1214.4IU/L培養(yǎng)基，比酶活可達2.839IU/mg蛋白。本發(fā)明可以利用GFP蛋白實現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在線檢測。
文檔編號C12R1/19GK101608178SQ20091009016
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權日2009年7月29日
發(fā)明者葉逢春, 翀 張, 蔣培霞, 邢新會 申請人:清華大學