一種可徹底特異性酶解依諾肝素鈉的肝素酶組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)依諾肝素鈉中1，6酐含量的不含肝素酶I的肝素酶組 合物及其應(yīng)用與其檢測(cè)方法，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 依諾肝素鈉 （Enoxaparin Sodium，ES)是一種低分子肝素鈉鹽，由豬腸粘膜肝素芐 基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得，美國(guó)專(zhuān)利US005389618A詳述了這種依諾肝素鈉制備過(guò)程。 美國(guó)藥典和歐洲藥典等對(duì)于依諾肝素鈉的質(zhì)量控制有著諸多要求，除了對(duì)效價(jià)、分子量分 布、重金屬含量和試劑殘留含量等理化項(xiàng)目檢測(cè)外，還要求測(cè)定1，6-酐含量。由于1，6-酐 環(huán)結(jié)構(gòu)低聚糖鏈的百分?jǐn)?shù)是依諾肝素鈉低聚糖混合物的特征，藥典中規(guī)定其1，6-酐環(huán)結(jié) 構(gòu)需占全部糖單元的15% -25%。基于依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)與組成的高度復(fù)雜性，目前常規(guī) 的檢測(cè)尚難以涉及其分子的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)確證與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制上存在一定的不確定 性。
[0003] 美國(guó)藥典描述了一種1，6_酐含量測(cè)定方法（USP32附錄〈207> "依諾肝素鈉的 1，6-酐衍生物檢查")，是利用三種肝素酶等量混合，酶解依諾肝素鈉樣品兩天，產(chǎn)物再經(jīng)還 原后HPLC分析。但實(shí)際應(yīng)用中按此方法進(jìn)行，其結(jié)果往往不能符合標(biāo)準(zhǔn)，主要原因在于肝 素酶性質(zhì)特別，往往酶解過(guò)程無(wú)法完成徹底，使得樣品性能不能判斷。特別是肝素酶I不穩(wěn) 定，價(jià)格高，選擇性差，不同來(lái)源的肝素酶對(duì)1，6-酐含量測(cè)定方法影響很大。所以導(dǎo)致該方 法的穩(wěn)定性差，重復(fù)性差，至今該方法只是一個(gè)一般檢測(cè)方法，而沒(méi)有作為依諾肝素的質(zhì)檢 放行方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種可徹底特異性酶解依諾 肝素鈉的肝素酶組合物及其檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的目的，將通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種可徹底特異性酶解依諾肝素鈉的肝素酶組合物，所述肝素酶組合物為肝素酶 Π 與肝素酶III的混合物，所述肝素酶II :肝素酶III的酶量活性比為3:1。
[0007] 優(yōu)選地，所述肝素酶II與肝素酶III為酶溶液或凍干酶粉。
[0008] 優(yōu)選地，所述肝素酶組合物用于依諾肝素鈉的特異性酶解還原制得1，6-酐衍生 物。
[0009] 優(yōu)選地，所述肝素酶組合物酶解還原制得1，6-酐衍生物包括如下步驟，
[0010] S1，完全酶解依諾肝素鈉步驟，在待酶解的依諾肝素鈉溶液中加入肝酶素組合物， 置于室溫下酶解至少24小時(shí)；
[0011] S2,還原酶解后樣品步驟，在經(jīng)過(guò)酶解后的樣品中添加硼氫化鈉溶液渦旋混合進(jìn) 行室溫的還原，并經(jīng)過(guò)濾膜的過(guò)濾；
[0012] S3,還原產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)，對(duì)S2中的還原產(chǎn)物按照以下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)：
[0013]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物，其特征在于：所述肝素酶組合 物為肝素酶II與肝素酶III的混合物，所述肝素酶II;肝素酶III的酶量活性比為3:1。
2. 如權(quán)利要求1所述一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物，其特征在 于；所述肝素酶II與肝素酶III為酶溶液或凍干酶粉。
3. 如權(quán)利要求1所述一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物的應(yīng)用，其特 征在于：所述肝素酶組合物用于依諾肝素鋼的特異性酶解還原制得1,6-酢衍生物。
4. 如權(quán)利要求3所述一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物的應(yīng)用，其特 征在于：所述肝素酶組合物酶解還原制得1,6-酢衍生物包括如下步驟， S1，完全酶解依諾肝素鋼步驟，在待酶解的依諾肝素鋼溶液中加入肝酶素組合物，置于 室溫下酶解至少24小時(shí)； 52, 還原酶解后樣品步驟，在經(jīng)過(guò)酶解后的樣品中添加棚氨化鋼溶液禍旋混合進(jìn)行室 溫的還原，并經(jīng)過(guò)濾膜的過(guò)濾； 53, 還原產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)，對(duì)S2中的還原產(chǎn)物按照W下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)：
54, 分析圖譜得出糖單元種類(lèi)和含量； 根據(jù)色譜圖的分離度，得出洗脫還原產(chǎn)物為1，6-酢衍生物，并按照公式計(jì)算還原產(chǎn)物 中1，6-酢摩爾百分含量，1，6-酢摩爾百分含量為
S種主要的1，6-酢衍生物的摩爾百分含量的計(jì)算，S種所述1，6-酢衍生物分別 包括 4# 峰l,6-anhyho_IIS與l,6-anhy^o_IISeP\9# 峰l,6-anhy^o_IS和 11# 峰 1，6-anhy化0-IS-ISepi; 其中Mw;依諾肝素鋼平均分子量；Mwx;各個(gè)衍生物X的相對(duì)分子量；Ax;各個(gè)衍生 物X的峰面積；A1 ;1，6-AnhydroAIs的峰面積；A2 ;1，6-AnhydroAIIs的峰面積；A3 ; 1. 6-AnhydroAIs-Is的峰面積 S5,判斷1，6-酢衍生物中1，6-酢含量是否合格；當(dāng)1，6-酢衍生物中1，6-酢含量的摩 爾百分含量結(jié)果在15-25%范圍內(nèi)，則判定為合格，否則即判定為不合格。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種可徹底特異性酶解依諾肝素鈉的肝素酶組合物，所述肝素酶組合物為肝素酶Ⅱ與肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量活性比為3:1。通過(guò)本發(fā)明的肝素酶組合物可以徹底的酶解依諾肝素鈉形成并經(jīng)還原制得1,6-酐衍生物，且含量均在合格范圍，本發(fā)明的肝素酶組合物不用肝素酶I減少了酶雜質(zhì)的引入，使方法更可靠，是對(duì)幾大藥典方法的重要補(bǔ)充，具有很高的實(shí)際使用價(jià)值和意義。
【IPC分類(lèi)】G01N30-02, G01N3-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104792896
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510197244
【發(fā)明人】金永生, 姚亦明, 王寧霞, 王林林, 閆倩倩
【申請(qǐng)人】蘇州融析生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月23日