專利名稱：：一種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒。
背景技術：
：豬的養(yǎng)殖是養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，目前我國已是世界上最大的養(yǎng)豬生產國。豬的皮、骨、肉、脂可供食用或用作工業(yè)原料，豬的器官(心臟、肝臟、皮膚等)正被研究用于人體器官移植，豬的排泄物可做肥料。所以，不管是對于滿足人類的需要來說，還是增加經濟效益來說，豬的養(yǎng)殖都是非常重要的。我國的養(yǎng)豬生產水平在近幾十年得到了較大的提高，但仍落后于歐美一些國家。生產效率不高削弱著養(yǎng)豬業(yè)的經濟效益，而生產效益則可以通過提高母豬繁殖力和肉豬出欄率得到提高。衡量母豬生產性能的主要指標是母豬能否生產出較重的初生重和斷奶重的子豬。子豬的初生重和斷奶重成為豬養(yǎng)殖業(yè)中影響經濟效益的兩個重要指標。平均初生重大，變異系數小，說明窩整齊度好，對提高仔豬成活率非常有好處，平均初生重大也可以剌激母豬多產奶。大量調查數據證明，仔豬初生重1500-1600克的豬場經濟效益要比出生重1200-1300克的豬場好的多。在2006年國際豬獸醫(yī)學會(IPVS)會議上，明尼蘇達州大學JohnDeen運用預測統(tǒng)計模型論述了子豬初生重對斷奶重和斷奶前死亡率的影響初生重小斷奶重就小，初生重每增加1克，平均斷奶重增加2.34克；初生重每增加100克，斷奶前死亡率可能會降低10%。斷奶重小，斷奶過渡就難，保育期死亡率增加、育肥期增重速度慢、飼料效率變差，出欄時間就會延長。斷奶重偏小是國內豬場普遍存在的問題，大多數豬場28天斷奶重6.5-7.5千克，管理好的豬場28天斷奶重可達到8-9.3千克以上。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供的輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的方法，是檢測待測豬的基因型為ID基因型還是DD基因型；所述DD基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的雜合體；DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型的豬。II基因型為基因組DNA中具有序列l(wèi)所示DNA片段的純合體。所述DD基因型可為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的純合體；所述ID基因型可為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的雜合體。n基因型為基因組DNA中具有序列4所示DNA片段的純合體。所述方法具體包括如下步驟1)將待測豬的基因組DNA作為模板，用特異性引物對進行PCR擴增；所述特異性引物對為序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段；2)檢測PCR擴增產物。如果PCR產物只有一種，且含有序列表的序列1所示的DNA片段，待測豬為II基因型；如果PCR產物只有一種，且不含有序列表的序列1所示的DNA片段，待測豬為DD基因型；如果PCR產物有兩種，一半含有序列表的序列1所示的DNA片段的，另一半不含有序列表的序列1所示的DNA片段的，待測豬為ID基因型。DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型。所述待測豬具體可為長白豬。本發(fā)明還保護核苷酸序列為序列表的序列1所示的DNA片段。含有序列表的序列1所示的DNA片段的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供了輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的特異性引物對，是序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段所述引物對可應用于輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀。所述引物對還可應用于制備輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒。本發(fā)明還保護一種輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒，所述試劑盒含有所述特異性引物對。所述方法、所述DNA片段、所述引特異性引物對、所述試劑盒均可應用于豬的育種。本發(fā)明提供的DNA片段在豬群中具有缺失多態(tài)。基因型為DD的待測豬的初生重與基因型為ID的待測豬的初生重存在顯著性差異(P〈0.05);基因型為DD的待測豬的斷奶重與基因型為ID的待測豬的斷奶重存在極顯著性差異(P<0.01);DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型。本發(fā)明的DNA片段可用于檢測豬的初生重和斷奶重等生長性狀，從而為豬的分育種提供了一個新的遺傳標記。本發(fā)明的DNA片段、引物對、試劑盒和方法將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。圖1為三種基因型的樣本的電泳結果。M:DNA分子量標準(100-1500bpladder)。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例1、特異性DNA片段的發(fā)現和不同豬群的基因頻率統(tǒng)計一、特異性DNA片段的發(fā)現試驗樣本的信息見表l。表1試驗樣本信息品種組合樣本數類型購買途徑五指山豬Wuzhishan36近交系小型豬中國農業(yè)科學院畜牧研究所巴馬香豬Bamaxiangpig45近交系小型豬廣西大學巴馬香豬近交繁育中心長白豬Landracepig329長白純種廣東溫氏集團提取每個樣本的基因組DNA，以基因組DNA為模板進行PCR。PCR的引物對如下PLInDell:5，-TGATGTGACCAACAAGGACT-3'(如序列表SEQIDNO:2);PRInDell:5，-GGATCGAACCTGCATCTC-3'(如序列表SEQIDNO:3)。PCR體系(20pL):豬基因組DNA約100ng，含IXbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150ixmol/L，引物終濃度為0.2umol/L，2U7鄰DNA聚合酶(PromegeO。PCR擴增程序94。C5min，循環(huán)30次(94°C、30s，61°C、30s，72°C、30s)，最后72'C延伸5min。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，樣本共顯示3種帶型。將PCR產物分別進行測序，測序結果表明33個樣本的PCR產物只有一種，PCR產物為序列表的序列4所示的DNA片段(341bp)，將其命名為II基因型；262個樣本的PCR產物只有一種，PCR產物為序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的DNA片段(297bp)，將其命名為DD基因型；115個樣本的PCR產物為兩種DNA片段的混合物，將其命名為ID基因型。應用以上PCR引物對對樣本的基因組DNA進行PCR擴增，若得到單一341bp片段，則其基因型為II純合體；若得到單一297bp片段，則其基因型為DD純合體;若得到341bp和297bp兩個片段，其基因型為ID雜合體。II、DD、ID三個基因型樣本的帶型見圖1。二、不同豬群的基因型和基因頻率統(tǒng)計在分析的3個豬群中，基因型及等位基因頻率統(tǒng)計結果如表2所示。_表2特異性DNA片段在3個豬群中的分布_突變位點InDell(45bp)一品種數量等位基因頻率不同基因型個體的數量IDIIIDDD450.83330.166730150360.34720.6528319143290.12310.8769081248結果表明在所檢測的3個豬品種中，中國地方豬群(巴馬香豬和五指山豬)都是II、ID基因型占優(yōu)勢，而國外豬群(長白豬)是DD基因型占優(yōu)勢。巴馬香豬B咖axiang五指山Wuzhishan長白豬Landrace實施例2、特異性DNA片段與豬初生重和斷奶重性狀的關聯分析用于性狀關聯分析的材料為實施例1中的329頭長白豬。一、模型的建立首先建立如下的分析模型以消除性別、組合及屠宰批次對表型值的影響Yijk=n+BATCHYSEXj+COMBINATIONk+(BS)ij+(BC)ik+(SC)jk+Sijk，其中，Yijk是性狀觀察值，p為總體均數，BATCHi為批次效應，SEXj為性別效應，COMBINATIONk為組合效應，(BS);j為批次和性別的互作效應，(BC)jk為批次和組合的互作效應，(SC)jk為性別和組合的互作效應，Sijk為隨機誤差，假定服從N(0，a2)分布。應用該模型對每個性狀進行分析并獲得一個新的性狀值，即標準化的殘差值，然后將所獲得殘差值作為新的性狀值，再建立如下的分析模型Yi產u+GEN0TYPEi+e!」Yij是新的性狀值，u是新的性狀值的總體均值，GENOTYPEi為基因型效應，e;j為隨機誤差，假定服從N(0,o2)分布。至此該模型已經消除了性別、組合及屠宰批次的系統(tǒng)誤差。應用該模型就可以直接分析基因型的效應，同時進行基因型間的兩兩比較。二、關聯分析試驗豬群基因型與經濟性狀關聯分析是應用SPSS軟件中的一般線性模型程序來完成的。利用實施例l獲得的基因型檢測結果，對每頭豬進行基因型與生長性狀以及免疫性狀間的關聯分析。在消除了品種、屠宰批次以及性別之間的差異后，基因型間性狀的簡單均數和標準差分析結果總結于表3。結果發(fā)現，248個基因型為DD的個體與81個基因型為ID的個體在初生重存在顯著性差異(P<0.05)，在斷奶重存在極顯著差異(P<0.01)。表3基因型與豬初生重和斷奶重性狀的關聯分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注肩注*表述P〈0.05;肩注**表述P〈0.01。序列表<110>中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所<120>—種檢測豬初生重和斷奶重性狀的方法及其專用試劑盒〈130>CGGNARY92079〈160>4〈210>1〈211〉45〈212〉DNA〈213>豬屬豬(Sus)〈400〉1taaatcaaaactcataatggccattaaatcaaaactcataatggc45<210>2<211>20〈212>賺〈213>人工序列<220>〈223><400>2tgatgtgaccaacaaggact20<210>3<211〉18<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223〉<400>3ggatcgaacctgcatctc18<210〉4<211〉341〈212〉腿<213>豬屬豬(Sus)〈400>4tgatgtgax:c肌c肪ggacttaMccctg8肪tataca肌tagcttatacagctc肪taa60caaaaaaccaaac肌cccaattg3aacatgggcag2iag2icctaiaeitaaac3ttttggcaa120agacgatatacagatggccaataggcacatgaa犯aBtgctcaccattgctaattattag180agaatgcaaatcaaaactcataatggccattaaatc肌aactcataatggcwttaaatc240aaaactcataatggccattaaaaagtctataagaggagttcccactgtggccacaatggg300gtcatcagtgtcttgggagcactgagatgcaggttcgatcc34權利要求1、輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的方法，是檢測待測豬的基因型為ID基因型還是DD基因型；所述DD基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的雜合體；DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型的豬。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于所述DD基因型為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第211-255位核苷酸的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中的序列4所示DNA片段中缺失自5'末端第21卜255位核苷酸的雜合體。3、如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)將待測豬的基因組DNA作為模板，用特異性引物對進行PC財廣增；所述特異性引物對為序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段；2)檢測PCR擴增產物。4、核苷酸序列為序列表的序列1所示的DNA片段。5、含有權利要求4所述DNA片段的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。6、輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的特異性引物對，是序列表的序列2所示的DNA片段和序列表的序列3所示的DNA片段。7、權利要求6所述特異性引物對在輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀中的應用。8、權利要求6所述特異性引物對在制備輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒中的應用。9、一種輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權利要求6所述特異性引物對。10、權利要求1至3中任一所述方法、權利要求4所述DNA片段、權利要求6所述特異性引物對、權利要求9所述試劑盒在豬的育種中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的方法，是檢測待測豬的基因型為ID基因型還是DD基因型；所述DD基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的純合體；所述ID基因型為基因組DNA中缺失序列1所示DNA片段的雜合體；DD基因型的豬的初生重和斷奶重高于ID基因型。本發(fā)明還提供了輔助檢測豬初生重和/或斷奶重性狀的特異性引物對，是序列表的序列2和序列3所示的DNA片段。本發(fā)明還提供了與豬初生重和/或斷奶重性狀相關的DNA片段，如序列1所示。本發(fā)明的DNA片段可用于檢測豬的初生重和斷奶重等生長性狀，從而為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標記。本發(fā)明的DNA片段、引物對、試劑盒和方法將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。文檔編號C12N15/12GK101603087SQ20091008969公開日2009年12月16日申請日期2009年7月24日優(yōu)先權日2009年7月24日發(fā)明者何文波,唐中林,彭克美,勇李,奎李,楊述林,牟玉蓮,王志偉申請人:中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所