專利名稱：微小RNA-146a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
研究涉及微小RNA-146a (miR-146a)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)水平、 作用途徑，以及對滑膜細(xì)胞功能的抑制作用。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯娜硇?自身免疫病。未經(jīng)正確治療的RA可遷延不愈，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。目前RA的發(fā)病機(jī)制并 不明確，限制了治療手段的發(fā)展。
微小RNA (microRNA， miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類位于真核生物中的長度約21nt的內(nèi) 源性非編碼小分子單鏈RNA，通過與耙mRNA的3' UTR結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。 目前的研究表明，近30n/。的人類蛋白編碼基因接受miRNA的調(diào)控，miRNA不僅參與了生物體 的正常發(fā)育，在疾病的發(fā)生中也起著極為重要的作用。MiRNA的發(fā)現(xiàn)，為我們了解疾病的發(fā) 生機(jī)制提供了新的線索。
MiR-146a參與了免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化，也有證據(jù)表明RA患者外周血單個核細(xì)胞 (PBMC)和滑膜組織中miR-146a^達(dá)異常，但目前尚不清楚miR-146a^達(dá)異常的意義。本 研究在觀察RA患者PBMCs miR-146a及其靶標(biāo)mRNA表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了 miR-146a對RA滑膜成纖維細(xì)胞功能的影響，旨在尋找miR-146a潛在的治療價值。

發(fā)明內(nèi)容
本研究首先通過檢測RA患者PBMCs中miR-146a的表達(dá)水平，了解炎癥狀態(tài)下miR-146a的 改變情況。我們選取了診斷明確的RA患者及正常對照各5例，利用密度梯度離心法提取 PBMCs，實時定量PCR (qRT-PCR)檢測了PBMC中miR-146a的表達(dá)情況，并且與RA患者的 臨床資料進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-146a在RA患者PBMCs中顯著下調(diào)，并且與疾病 活動度指標(biāo)一血沉(ESR)成負(fù)相關(guān)。提示miR-146a在RA發(fā)病中可能起著負(fù)調(diào)控的作用。為 了進(jìn)一步了解miR-146a發(fā)揮作用的途徑，我們檢測了與NF- b通路活化密切相關(guān)的兩個靶標(biāo) mRNA—TRAF6、 IRAKI的表達(dá)水平。TRAF6、 IRAKI是活化NF-Kb通路、產(chǎn)生TNF-a等炎 癥因子的重要因素，目前已證明是miR-146a的靶標(biāo)之一。但并不清楚在RA中，miR-146a是否 通過這兩個靶標(biāo)mRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們的結(jié)果顯示RA中表達(dá)下調(diào)的miR-146a與上調(diào)的TRAF6、 IRAK1水平成負(fù)相關(guān)，表明miR-146a至少部分是通過TRAF6、 IRAK1在RA的發(fā)病中發(fā)揮調(diào)控作用的。
為了深入了解miR-146a在RA發(fā)病中的負(fù)調(diào)控作用，我們研究了miR-146a對RA患者FLS增殖及炎性因子分泌的影響。實驗分兩組進(jìn)行， 一組為腫瘤壞死因子-a (TNF-a)活化組，一組為無TNF-a活化組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-146a，以無關(guān)序列小RNA為陰性對照。48小時后檢測FLS的增殖情況，及細(xì)胞上清IL-6及IL-8水平。我們發(fā)現(xiàn)TNF-ci活化組FLS增殖及IL-8、 IL-6分泌水平明顯增高；而miR-146a對兩組FLS的增殖及炎性細(xì)胞因子IL-6、 IL-8的分泌均有明顯的抑制作用。這表明，TNF-ci在RA患者FLS的活化過程中起著重要作用，而miR-146a對RA患者過度活化的FLS具有抑制作用，并且這種抑制作用不受TNF-a的影響。這對于RA的免疫治療具有重要意義。


圖l.RA患者PBMCs中miR-146a^達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(0.74±0.81，
1.82 ±1.35， pO.Ol)。圖2.RA患者PBMCsmiR-146a的表達(dá)水平與ESR成負(fù)相關(guān)(r=-0.449， p<0.05 )圖3.RA患者PBMCs IRAKI 、 TRAF6表達(dá)水平顯著上調(diào)。IRAKl在RA和正常對照PBMCs中的
表達(dá)量分別為2.62土2.04， 1.28土1.32; TRAF6在RA和正常對照PBMCs中的表達(dá)量分別為
3.74±5.48， 1.68±1.32， P值均小于0.05。圖4. RA患者PBMCs miR-146a的表達(dá)水平與靶標(biāo)IRAKl成負(fù)相關(guān)(r = - 0.486, P < 0.01)。圖5. RA患者PBMCs miR-146a的表達(dá)水平與靶標(biāo)TRAF6成負(fù)相關(guān)(r = - 0.297， P < 0.05)。圖6.3H摻入法檢測miR-146a對RA-FLS增殖的影響。轉(zhuǎn)染miR-146a 48小時后，在TNF-a活化
組及無TNF- a組，，F(xiàn)LS cpm值分別為8093.00土2592.98和2015.00土544.75均明顯低于陰
性對照小RNA (16692.40 ±976.91， 8798.60±1922.08, P值均小于O.Ol)。圖7.miR-146a) tRA-FLSIL-6分泌的影響。在無TNF-a組(A)及TNF-a活化組(B)，轉(zhuǎn)染
miR-146a 48小時后，F(xiàn)LS上清IL-6分別為152.59土49.49 pg/ml和16479.05±3710.37
pg/ml，均明顯低于陰性對照小RNA(310.82土 123.36pg/ml和27081.47士3874.37pg/ml， P
值均小于O.Ol)。
圖8.miR-146魂RA-FLSIL-8分泌的影響在無TNF-a組(A)及TNF-a活化組(B)，轉(zhuǎn)染miR-146a48小時后，F(xiàn)LS上清IL-8分別為294.65±94.78 pg/ml和6549.80士1128.86pg/ml，均明顯低于陰性對照小RNA(459.26土 125.79pg/ml和9064.51 士761.99pg/ml， P值均小于0.01)。
具體實施例方式
實施例l: RA患者PBMCs miR-146逮達(dá)情況的檢測
本研究納入符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)分類標(biāo)準(zhǔn)的RA患者30例，同時選取30例年齡、性別相匹配的正常志愿者，獲取知情同意，抽取4ml抗凝血。立即予以密度梯度離心法分離PBMC， Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度儀測A260。 MiR-146a的相對表達(dá)水平用ACt和2^a計算，U6snRNA作為內(nèi)參，檢測方法相同。實時定量PCR根據(jù)上海吉瑪公司提供的miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit進(jìn)行操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者PBMCs中miR-146a表達(dá)顯著下調(diào)，見圖l。
實施例2: RA患者PBMCs miR-146逮達(dá)情況與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析
為探討miR-146a^達(dá)水平的臨床意義，我們對miR-146a^達(dá)量與各項臨床指標(biāo)做了Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a^達(dá)量與ESR成負(fù)相關(guān)，目前未發(fā)現(xiàn)與類風(fēng)濕因子(RF)、抗CCP抗體等其它的臨床指標(biāo)存在相關(guān)性。見圖2。實施例3: RA患者PBMCsmiR-146a^達(dá)情況與靶標(biāo)mRNATRAF6、 IRAKI的相關(guān)性分析
為了了解miR-146a在RA中發(fā)揮作用的途徑，我們同時檢測了RA患者PBMCs中TRAF6、IRAKI的表達(dá)量。TRAF6、 IRAKI是能活化NF-Kb通路，產(chǎn)生TOF-a等致炎因子，已被證明是miR-146a的耙標(biāo)。但RA中miR-146a是否通過TRAF6、 IRAKI發(fā)揮調(diào)控作用并不明確。我們用qRT-PCR檢測了TRAF6、 IRAKI的表達(dá)情況，并且與miR-146a做了Spearmaii相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TRAF6、 IRAK1表達(dá)明顯上調(diào)(圖3),并且二者的含量與miR-146a均成負(fù)相關(guān)(見圖4),說明miR-146a至少部分通過抑制TRAF6、 IRAKI的表達(dá)發(fā)揮在RA中的調(diào)控作用。實施例4: miR-146a對RA-FLS增殖能力的影響
留取RA患者膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后滑膜組織，分離培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞，使用3代后的細(xì)胞進(jìn)行試驗。分成兩組， 一組為TNF-a活化組(10ng/ml)， 一組為無TNF-a活化組，分別同時行Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-146a (序列為
5' -UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'，根據(jù)miRBase release 10.1 ，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/，由上海吉瑪公司合成)，對照選用無關(guān)序列小RNA。轉(zhuǎn)染時使用96孔板，每孔細(xì)胞5X103,設(shè)三復(fù)孔。48小時后收集細(xì)胞，3H摻入法檢測滑膜成纖維細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-a活化組FLS增殖更為明顯，但轉(zhuǎn)染miR-146a后對兩組FLS增殖均有顯著的抑制作用，見圖5。實施例5: miR-146a對RA-FLS分泌炎癥因子的影響
使用3代以后的RA患者FLS， 5X10"孔接種 12孔板，Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-146a及陰性對照后，分成TNF-a誘導(dǎo)(10ng/ml)及無TNF-a組，每組均為復(fù)孔，ELISA法檢測轉(zhuǎn)染48h后FLS上清IL-6、 IL-8的分泌水平。結(jié)果表明，TNF-a活化組FLS分泌IL-6、 IL-8更為明顯，但轉(zhuǎn)染miR-146a后對兩組FLS炎癥因子的分泌均有顯著的抑制作用，見圖7、圖8。
權(quán)利要求
1、一種單鏈非編碼小RNA，序列為5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3’。
2、 權(quán)利要求1中的微小RNA在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于抑制滑膜細(xì)胞功能。
全文摘要
本發(fā)明鑒定了一種在RA炎癥細(xì)胞中低表達(dá)的microRNA(miR-146a)，并且證實了miR-146a能夠抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞的功能，具有抑炎作用。
文檔編號C12N15/11GK101643730SQ20091008963
公開日2010年2月10日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者茹 李, 栗占國, 麗 龍 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院