專利名稱：：一種表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
：在通過過表達(dá)技術(shù)研究基因功能及轉(zhuǎn)基因動物制備過程中，我們往往借助真核表達(dá)載體來實現(xiàn)，傳統(tǒng)的方法就是通過分子生物學(xué)手段將目的基因片段連接到真核啟動子下游，整合到細(xì)胞基因組中后能指導(dǎo)外源基因表達(dá)。該方法在基因表達(dá)及功能的研究中有著極其廣泛的應(yīng)用，但該研究手段也有不足的一方面現(xiàn)在的研究很多情況下可能需要研究多基因之間相互作用關(guān)系，如果通過表達(dá)單一基因的真核表達(dá)載體來研究，則需要分別構(gòu)建多個載體，在細(xì)胞水平上的研究必然要多次轉(zhuǎn)染并分別篩選才能得到同時整合多個基因的細(xì)胞。同樣，在轉(zhuǎn)基因動物中要制備轉(zhuǎn)不同基因的動物時，首先必須分別制備單基因轉(zhuǎn)基因動物，并分別篩選純合子，然后純合子之間交配得到能同時表達(dá)多個基因的后代，上述方法不但研究周期長、操作繁瑣而且耗費(fèi)高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體，其序列含有植酸酶基因表達(dá)盒和人粘病毒抗性基因1表達(dá)盒。所述植酸酶基因表達(dá)盒是由依次串聯(lián)的CMV啟動子、植酸酶基因(appA)和BGH終止子組成；所述人粘病毒抗性基因1表達(dá)盒由依次串聯(lián)的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因1(Mxl)和BGH終止子組成；所述植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列；所述CMV啟動子具有GENBANK號為X03922的自5'端第541—1128位核苷酸序列；所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596—5881位核苷酸序列。所述表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體是以pcDNA3.1(+)載體為出發(fā)載體構(gòu)建得到。所述表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體的核苷酸序列優(yōu)選為序列表中序列1。本發(fā)明通過高保真酶擴(kuò)增出含啟動子、目的基因及終止子的完整真核表達(dá)調(diào)控區(qū)域，連接到另外一個真核表達(dá)載體上，構(gòu)建出各自含表達(dá)調(diào)控基因的多基因真核表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體的可同時高效表達(dá)植酸酶基因(appA)、人粘病毒抗性基因1(Mxl)。本發(fā)明的表達(dá)載體在細(xì)胞水平上驗證了含雙基因的表達(dá)載體的表達(dá)效率幾乎和兩單基因組表達(dá)效率相當(dāng)。本發(fā)明的含雙基因的AMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞及制備轉(zhuǎn)基因小鼠，通過定量PCR檢測出AMP的表達(dá)雙基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因l(Mxl))的效率幾乎和兩單基因組表達(dá)效率相當(dāng)。本發(fā)明的載體顯著優(yōu)勢表現(xiàn)在多個基因過表達(dá)時于不影響各自表達(dá)效率的前提下，實現(xiàn)兩個基因功能，為制備轉(zhuǎn)聯(lián)合基因動物等提供一種便捷的手段。圖1:PCR擴(kuò)增appA產(chǎn)物電泳圖2:pcDNA-appA質(zhì)粒圖譜；圖3:PCR擴(kuò)增Mxl產(chǎn)物電泳圖4:pcDNA-Mxl質(zhì)粒圖譜；圖5:pcDNA-appA-Mx(AMP)質(zhì)粒圖譜；圖6:菌液PCR檢測AMP重組質(zhì)粒；圖7:各組細(xì)胞中appA表達(dá)水平；圖8:各組細(xì)胞中Mx表達(dá)水平；圖9:AMP轉(zhuǎn)基因鼠PCR檢測外源基因；圖10:AMP轉(zhuǎn)基因鼠SOUTHERNBLOT檢測外源基因；圖ll:半定量檢測appA及Mx的表達(dá)電泳圖具體實施例方式下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、表達(dá)雙基因的載體的構(gòu)建1、單基因表達(dá)載體基本構(gòu)件的獲得(1)真核表達(dá)載體pcDNA-appA的制備以大腸桿菌DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)為模板，以表1中列舉的擴(kuò)增appA的引物擴(kuò)增植酸酶基因(appA)片段(GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列)和BGH終止子片段(具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596—5881位核苷酸序列)。反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為50|il，5pL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20pM引物appA-Ll、lpL20引物appA-Rl(引物序列見表l)、0.5)aL5U/pL高保真Tag聚合酶，2pl大腸桿菌DH5a做模板，加超純水至50pL(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴(kuò)增程序98°C10s，68。C2min，循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖l所示)。PCR產(chǎn)物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用HindIII、EcoRl雙酶切純化產(chǎn)物;同時用HindIII、EcoRI雙酶切pcDNA3.1(+)載體(購自invitrogen公司)；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態(tài)大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，部分菌液送公司測序(invitrogen北京公司)；選取測序結(jié)果表明含有appA和BGH終止子的載體，提取質(zhì)粒備用，將該測序表明正確的質(zhì)粒命名為pcDNA-appA(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。(2)真核表達(dá)載體pcDNA-Mxl的制備以人cDNA(以提取專利人血液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄而來)為模板，以表l中列舉的擴(kuò)增Mxl的引物擴(kuò)增人粘病毒抗性基因1(Mxl)片段(GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列)。反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為50|iil，5|iL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20|iM引物Mx-Ll、l|uL20pM引物Mx-Rl(序列見表l)、0.5|LiL5U/pL高保真Tag聚合酶，100ng人cDNA為模板，加超純水至50|nL(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴(kuò)增程序98°C10s，68°C2min，，循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)。PCR產(chǎn)物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用HindIII、EcoRI雙酶切純化產(chǎn)物；同時用HindIII、EcoRI雙酶切pcDNA3.1(+)載體(購自invitrogen公司)；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態(tài)大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，部分菌液送公司測序(invitrogen北京公司)；選取測序結(jié)果表明含有Mxl表達(dá)盒的載體，提取質(zhì)粒備用，將該測序表明正確的質(zhì)粒命名為pcDNA-Mxl(質(zhì)粒圖譜如圖4所示)。2、雙基因表達(dá)載體AMP構(gòu)建以pcDNA-appA(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)為模板，以表1所列的引物擴(kuò)增表1所列的相應(yīng)構(gòu)件。5nL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、l|iL20pM引物CMVappA-Ll、lpL20liM引物CMVappA-Rl(序列見表l)、0.5pL5U/高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA質(zhì)粒，加超純水至50^L(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴(kuò)增程序98°C10s，68°C3min，，循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物部分測序(iiwitrogen公司)；測序結(jié)果表明擴(kuò)增得到的CMV-appA-BGHpA片段；CMV-appA-BGHpA片段由依次串連的CMV啟動子、appA和BGH終止子組成；其中CMV啟動子具有GENBANK號X03922的自5'端第541—1128位核苷酸的序列；植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列(appA基因)。所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596—5881位核苷酸序列。上述PCR產(chǎn)物CMV-appA-BGHpA片段用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用MluI酶切純化產(chǎn)物；同時用MluI單酶切pcDNA-Mxl質(zhì)粒;將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態(tài)大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液PCR檢測插入片段中CMV-appA-BGHpA片段(擴(kuò)增體系同上擴(kuò)增CMV-appA-BGHpA片段部分(引物見表l)，其中模板改為菌液2微升)，結(jié)果見圖6，可見7號及12號泳道中有對應(yīng)的CMV-appA-BGHpA片段擴(kuò)增條帶，將上述兩樣的部分菌液送公司測序(irwitrogen北京公司)；結(jié)果表明獲得含有CMV-appA-BGHpA片段和Mxl表達(dá)盒的重組表達(dá)載體，將該載體命名為pcDNA-appA-Mx，簡稱為AMP。測序表明，AMP具有序列表中序列1的核苷酸序歹U，其序列中含有appA表達(dá)盒和Mxl表達(dá)盒，其中appA表達(dá)盒由依次串聯(lián)的CMV啟動子、植酸酶基因(appA)和BGH終止子組成；Mxl表達(dá)盒由依次串聯(lián)的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因l(Mxl)和BGH終止子組成；CMV啟動子具有GENBANK號X03922的自5'端第541—1128位核苷酸的序列(對應(yīng)自序列表中序列1的5'端第232-819位核苷酸序列和自序列表中序列1的5'端第2675-3262位核苷酸序列)；植酸酶基因(appA基因)具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列(對應(yīng)自序列表中序列1的5'端第917-2221位核苷酸序列)；人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列(對應(yīng)自序列表中序列1的5'端第3360-5438位核苷酸序列)。所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596_5881位核苷酸序列(對應(yīng)自序列表中序列1的5'端第2292-2577位核苷酸序列和自序列表中序列1的5'端第5425-5710位核苷酸序列)。AMP的質(zhì)粒圖譜如圖5所示。表l:3^發(fā)明中用于擴(kuò)增載體構(gòu)件的引物擴(kuò)增片段名稱引物代號引物序列產(chǎn)物長度(bp)5'端引入的酶切位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2、本發(fā)明的含雙基因真核表達(dá)載體的細(xì)胞水平表達(dá)檢驗1、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)pcDNA-appA、pcDNA-Mxl及AMP質(zhì)粒用Seal大量酶切線性化后，QIAGEN純化試劑盒膠回收線性化片段，產(chǎn)物終濃度為500ng/ul用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。從液氮中取出裝有豬PK15細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)的凍存小管，立即投入37-40'C的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解；在l-2min內(nèi)完成復(fù)溫；將細(xì)胞懸液移入無菌的離心管，加入5mL培養(yǎng)液，輕輕吹勻；將細(xì)胞懸液800-1000r/min離心5min，棄上清；向含有細(xì)胞沉淀的離心管加入lmL完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入適量的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選將豬PK15細(xì)胞系細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)分為四組(轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染AMP質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pcDNA-Mxl組及轉(zhuǎn)染pcDNA-appA組)，每組3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染前1天，向每孔含10%胎牛血清(購自GIBCO公司，貨號21640-079)的500pLDMEM高糖培養(yǎng)基(購自GIBCO公司，貨號12100-046)的24孔板中分別接種0.5-2><105個豬PK15細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前達(dá)到卯-95%的匯合；用50pL的無血清、無抗生素的培養(yǎng)基分別稀釋0.8嗎待轉(zhuǎn)染DNA(其中，轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組使用Seal線性化的pcDNA，轉(zhuǎn)染AMP質(zhì)粒組使用Seal線性化AMP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染pcDNA-Mxl組使用Seal線性化的pcDNA-Mxl質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染pcDNA-appA組使用Seal線性化的pcDNA-appA質(zhì)粒)，并溫和的混勻；使用前將脂質(zhì)體溫和搖勻，將2pLlipefectaminTM-2000加入50pL的無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO公司，貨號12100-046)并輕輕混勻，于室溫孵育5min;5min后，分別將50pL的各組DNA稀釋液加入50pL的脂質(zhì)體稀釋液，輕輕混勻并于室溫放置20min;將lOOpL的DNA脂質(zhì)體混合物加入到準(zhǔn)備好的孔內(nèi)，輕輕來回晃動培養(yǎng)板，將其置于37"C、飽和濕度、5%<302的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于4-6h后用完全培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，在后代培養(yǎng)中，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入G418(購自Gibco，貨號11811-023)，篩選兩周。3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)量鑒定1)細(xì)胞總RNA提取及cDNA的制備按照試劑盒(購自北京天跟公司，貨號DP430)操作說明，提取上述轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染AMP質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pcDNA-Mxl組及轉(zhuǎn)染pcDNA-appA組細(xì)胞總RNA;按照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自TOYOBO公司，貨號FSK-100)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNAo2)熒光定量PCR檢測以1)中制備的cDNA為模板，梯度稀釋模板驗證選定最佳模板濃度，以豬GAPDH基因為內(nèi)參(引物為mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，進(jìn)行熒光定量PCR測定appA(appA引物為表1所示的appA-RTLl和appA-RTRl)、Mxl(Mxl引物為表1所示的hMxl-RTL1和hMxl-RTR1)表達(dá)量，上樣體系按照ABI定量試劑說明書上樣，反應(yīng)體系為20(il，10|iiL2xMixturer(TAKARA，貨號DRR041A)、lpL20pM上游引物、lpL20nM下游引物、1微升cDNA，加超純水至20pL。PCR擴(kuò)增程序95°C5min;94。C20s，退火溫度56r，72。Clm，循環(huán)40次，最后72°C延伸5min。熒光定量檢測結(jié)果如圖7、圖8所示，在進(jìn)行MX1表達(dá)水平檢測時，以轉(zhuǎn)pcDNA質(zhì)粒對照組為基準(zhǔn)，轉(zhuǎn)pcDNA-MXl組及AMP組的表達(dá)水平平均為對照組的37.27倍和39.37倍；進(jìn)行appA表達(dá)水平檢測時，以轉(zhuǎn)pcDNA質(zhì)粒對照組為基準(zhǔn)，轉(zhuǎn)pcDNA-appA組合，AMP組的表達(dá)水平分別是對照組的32.27倍和39.07倍，轉(zhuǎn)染AMP基因組能有效高表達(dá)appA及Mxl基因，且單基因載體和雙基因載體表達(dá)效率不能從細(xì)胞水平鑒定出差異(P<0.05)。(圖中縱坐標(biāo)是定量PCR儀顯示的格式，以logn)值為單位，各組的值為每組目的基因的表達(dá)水平和內(nèi)參的表達(dá)水平的比值。以對照組細(xì)胞相應(yīng)基因表達(dá)為參照基數(shù)0，其余各組表達(dá)水平值為對照組相應(yīng)基因表達(dá)的倍數(shù))實施例3、含雙基因真核表達(dá)載體制備的轉(zhuǎn)基因動物的檢驗(l)AMP轉(zhuǎn)基因小鼠的制備將線性化AMP載體利用體內(nèi)精原干細(xì)胞介導(dǎo)的的轉(zhuǎn)基因動物制備的方法(采用李碧春、孫國波等，體內(nèi)外精原干細(xì)胞介導(dǎo)大群生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞，中國科學(xué)C輯:生命科學(xué)，2008，38，626-634)，制備出含AMP的轉(zhuǎn)聯(lián)合基因小鼠。(2)轉(zhuǎn)基因小鼠的整合檢測分別利用appA、Mxl定量檢測引物(見表l，同細(xì)胞表達(dá)檢測時appA、Mxl定量檢測引物)檢測轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA中相應(yīng)基因的整合檢測步驟1)獲得的轉(zhuǎn)聯(lián)合基因小鼠后代小鼠中外源基因的整合情況。PCR反應(yīng)體系為50|il，5pL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20pM引物PL、l^L20pM引物PR、0.5|uL5U/pL高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA質(zhì)粒，加超純水至50|iL。PCR擴(kuò)增程序95°C5min;94°C20s，退火溫度56°C，72。Clm，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出分別能擴(kuò)增出appA及Mxl基因的鼠為基因真核鼠(圖9)(圖中，+:陽性對照，AMP質(zhì)粒DNA為模板；一陰性對照，正常鼠DNA為模板；1一16:為轉(zhuǎn)基因后代鼠擴(kuò)增條帶，上圖可見l-16號鼠能擴(kuò)增出355bp左右的條帶，和預(yù)期擴(kuò)增的appA條帶一致；下圖可見1-16號鼠能擴(kuò)增出355bp左右的條帶，和預(yù)期擴(kuò)增Mxl條帶325bp—致；擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測序分別和appA及Mxl序列一致)。以表1中檢測appA及Mxl的引物為引物,按照試劑盒操作說明書體系加樣;PCR運(yùn)行程序如下95°C5min，94°C45S，56°C1min，72°C1min，30個循環(huán)后72°C延伸10min(探針標(biāo)記試劑盒購自innogen-cn公司，貨號DDLK-010)。以PCR產(chǎn)物為探針進(jìn)行southen雜交檢測，雜交前在95。C變性5分鐘后立即冰水中放置10分鐘備用；大量抽提小鼠尾組織DNA，用Hindm及NotI雙酶切基因組，濃縮基因組酶切產(chǎn)物之300ng/Hl;于1%瓊脂糖凝膠電泳分離各酶切片段，每孔上樣50微升；然后使DNA原位變性后轉(zhuǎn)移到帶正電荷尼龍膜上。按照試劑盒操作說明進(jìn)行預(yù)雜交、雜交及X-光片曝光檢測雜交信號(購自innogen-cn公司，貨號DIGD-210)。檢測結(jié)果(圖IO)表明，PCR檢測陽性鼠樣，southern雜交檢測相應(yīng)鼠能檢測出相應(yīng)調(diào)帶，說明l-16號樣品所代表的轉(zhuǎn)基因鼠為雙基因整合鼠。圖10中k為正常飼養(yǎng)鼠(非轉(zhuǎn)基因鼠)。(3)小鼠血液總RNA提取及cDNA的制備從2)中篩出的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠尾部采集100微升血液，按照天根血液總RNA提取試劑盒(貨號DP433)操作說明，提取各組細(xì)胞總RNA;按照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號FSK-100)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.(4)AMP轉(zhuǎn)基因小鼠半定量PCR檢測以(3)中制備的cDNA為模板，分別以appA、Mxl及小鼠beta-actin基因為內(nèi)參(擴(kuò)增方法如實施例1的步驟1(引物見表l))，進(jìn)行半定量PCR測定，PCR反應(yīng)體系為50|il，510xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20pM上游引物、lpL20pM下游引物(擴(kuò)增appA、Mxl及小鼠beta-actin的引物分別是表1中appA-RTLl、appA-RTRl，hMxl-RTLl、hMxl隱RTR1及actin-RTLl、actin-RTR1)、0.5pL5U/高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA質(zhì)粒，加超純水至50pL。PCR擴(kuò)增程序95。C5min;94。C20s，退火溫度56。C，72。Clm，，最后72°C延伸5min，內(nèi)參beta-actin擴(kuò)增時23個循環(huán)，其他模板擴(kuò)增32個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖11)。半定量結(jié)果表明，2、5、7、10、15泳道擴(kuò)增出陽性條帶，而且在appA和Mxl陽性結(jié)果相一致，說明對應(yīng)的AMP整合陽性鼠能同時表達(dá)appA和Mxl基因。序列表<160>1<210〉1<211>9825〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉1g8Cgg3tCggccgcatagttcgagc犯aatttagggttagg3ttattgactggagttccgcccgcccattattgacgtcaa/tcatatgccatgcccagtatcgctattacactcscggggaaaatcaacggtaggcgtgtctgcttactggtttei33cttaaccccgc犯tgtcagtcgtcccagacgcagctaatcgccga^aagggcccgtaaaacatacccaggcaccaactggattgactttaccgc犯tcaaacgagatctcccaagccagtatttaagctacagcgttttgcgtagttattaacgttacataagacgtcaataatgggtggagaagtacgccccatgacctteicatggtgatgatttccaagtggactttcca3Cggtggg3ggcttatcgaatctgcattcgcatggtgtgctggccaaccttatctcggactgcccgcagtggcgaagcctgatac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啟動子、植酸酶基因和BGH終止子組成；所述人粘病毒抗性基因1表達(dá)盒由依次串聯(lián)的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因1和BGH終止子組成；所述植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列；所述C匿啟動子具有GENBANK號為X03922的自5'端第541—1128位核苷酸序列；所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第55恥一5881位核苷酸序列。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體是以pcDNA3.1(+)載體為出發(fā)載體構(gòu)建得到。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于所述表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體的核苷酸序列為序列表中序列1。全文摘要本發(fā)明公開了一種表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體。該載體，其序列其序列含有植酸酶基因表達(dá)盒和人粘病毒抗性基因1表達(dá)盒。本發(fā)明的表達(dá)載體在細(xì)胞水平上驗證了含雙基因的表達(dá)載體的表達(dá)效率幾乎和兩單基因組表達(dá)效率相當(dāng)。本發(fā)明的含雙基因的AMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞及制備轉(zhuǎn)基因小鼠，通過定量PCR檢測出AMP的表達(dá)雙基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因1(Mx1))的效率幾乎和兩單基因組表達(dá)效率相當(dāng)。文檔編號C12N15/85GK101608189SQ200910089428公開日2009年12月23日申請日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日發(fā)明者奎李,白立景,鞠輝明申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所