專利名稱：一種腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)載體的構(gòu)建。具體地說是一種腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體的構(gòu)建及更直觀、簡便、快捷的活性檢測方法的建立。
背景技術(shù)：
對于腫瘤基因治療，無論采用何種治療策略，目前面臨的一個難題都是治療的靶向性或特異性問題。因為如果所有細(xì)胞都可接受外源基因并表達(dá)，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，必將帶來一些副作用，尤其是對于具有細(xì)胞殺傷作用的基因，這個問題尤為突出。因此，腫瘤靶向基因治療日益受到重視。所謂腫瘤靶向基因治療，就是使治療基因靶向、有效的導(dǎo)入特定的腫瘤組織、細(xì)胞，并實現(xiàn)靶向高效表達(dá)，從而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，減少毒副作用。解決腫瘤基因治療所面臨的這一關(guān)鍵問題的主要策略是通過利用腫瘤組織/細(xì)胞特異性啟動子調(diào)控治療基因靶向表達(dá)。但目前發(fā)現(xiàn)腫瘤組織/細(xì)胞特異性啟動子在嵌合基因中通常存在活性較低的問題。因此腫瘤細(xì)胞特異性的高效啟動子的發(fā)現(xiàn)勢必為腫瘤靶向基因治療開辟新途徑。
Lin CS等1993年在J Biol Chem，1993，2682781-2801中發(fā)現(xiàn)L-plastin肌動蛋白結(jié)合蛋白在大量實體瘤細(xì)胞(＞90％)內(nèi)高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是實體瘤細(xì)胞中表達(dá)的一個新的重要標(biāo)志物，L-plastin啟動子能夠在具有內(nèi)源性L-plastin表達(dá)的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)激活報告基因的表達(dá)，而在沒有內(nèi)源性L-plastin表達(dá)的正常的成纖維細(xì)胞、HeLa等細(xì)胞中沒有活性。美國的Deisseroth研究組利用截短的2.4kb的L-plastin啟動子構(gòu)建了腺病毒載體AdLP，并對其在腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)行了系列研究。1999年他們在Cancer Gene Ther，1999，6(2)99-106文章中構(gòu)建了重組腺病毒載體AdLPLacZ，同時以帶有CMV啟動子的AdCMVLacZ為對照進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，發(fā)現(xiàn)AdLPLacZ和AdCMVLacZ轉(zhuǎn)染的乳腺癌、卵巢癌以及成纖維細(xì)胞瘤細(xì)胞中都有LacZ基因的高水平表達(dá)，而且L-plastin啟動子與CMV啟動子的活性相當(dāng)。但AdCMVLacZ在正常成纖維細(xì)胞中高水平表達(dá)LacZ基因，而AdLPLacZ在成纖維細(xì)胞中不能啟動LacZ基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測不到LacZ活性。研究結(jié)果還提出2.4kb的L-plastin啟動子是腫瘤細(xì)胞特異性的高效啟動子。2001年他們在Cancer Res，2001，614405-4413文章中又將L-plastin啟動子應(yīng)用于自殺基因治療，分別構(gòu)建了重組自殺基因CD的腺病毒載體Ad-Lp-CD和Ad-CMV-CD，動物模型實驗結(jié)果顯示Ad-Lp-CD和Ad-CMV-CD具有同樣的抑制腫瘤生長的能力，但Ad-Lp-CD明顯使腫瘤縮小，而且研究顯示含有L-plastin啟動子的重組腺病毒不僅具有腫瘤細(xì)胞特異性，而且能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療和化療藥物的敏感性。上述研究結(jié)果提示2.4kb L-plastin啟動子具有腫瘤細(xì)胞特異性強(qiáng)、活性高，能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療和化療藥物的敏感性等優(yōu)點，因此L-plastin啟動子的應(yīng)用將為腫瘤靶向基因治療開辟一條新途徑。
但上述將2.4kb的L-plastin啟動子用于腫瘤靶向基因治療的研究中存在如下問題和缺點首先，他們構(gòu)建的腺病毒載體屬于病毒類載體，存在引起的宿主炎性免疫反應(yīng)較強(qiáng)，可能通過重組產(chǎn)生致病的野生型病毒，并且生產(chǎn)成本較高等問題；其次，研究中都是以LacZ為報告基因檢測2.4kb的L-plastin啟動子活性，需對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行固定等一系列處理，并且需要相應(yīng)的酶底物，如X-gal進(jìn)行顯色，才能分析相對活性，此方法相對較費時、繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種相對低毒、低成本、高活性的非病毒腫瘤特異性真核表達(dá)載體以及更直觀、簡便、快捷的載體活性檢測方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是通過分子克隆技術(shù)，利用2.4kb L-plastin啟動子序列PLN置換真核表達(dá)載體pcDNA3.1上的巨細(xì)胞病毒CMV啟動子，從而獲得非病毒真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN。為了檢測真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN的活性及腫瘤細(xì)胞特異性，特采用了一種不需抗體、輔因子、酶底物等其他成分，而且不影響宿主細(xì)胞的獨特的報告蛋白——綠色熒光蛋白GFP。將GFP重組在L-plastin啟動子的下游，構(gòu)建報告表達(dá)載體pcDNA3.1PLN-GFP，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞后48小時收獲細(xì)胞，僅用PBS洗滌兩至三次，就可采用熒光激發(fā)細(xì)胞分選技術(shù)FACS在流式細(xì)胞儀上檢測表達(dá)GFP細(xì)胞，根據(jù)發(fā)光細(xì)胞比率就可以分析L-plastin啟動子的相對活性。檢測結(jié)果表明pcDNA3.1PLN載體中L-plastin啟動子啟動下游基因僅在存在內(nèi)源性L-plastin的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而且啟動子活性較高，與CMV啟動子活性相當(dāng)。在2.4kb的L-plastin啟動子序列下游的多克隆位點插入腫瘤治療基因，構(gòu)建治療表達(dá)載體，具體可為，在2.4kb的L-plastin啟動子序列下游的多克隆位點EcoRI和XhoI之間插入p16基因。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN是一種非病毒的腫瘤細(xì)胞特異性的高效表達(dá)載體，為腫瘤靶向基因治療提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。以GFP為報告基因結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析啟動子活性較以往研究中以LacZ等報告基因更直觀、簡便、快捷。用本發(fā)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN介導(dǎo)p16，CD，p53，p21等腫瘤治療基因進(jìn)行腫瘤治療，不僅能充分發(fā)揮治療基因的抑瘤作用，而且具有腫瘤特異性，降低毒副作用，確保治療的安全有效。


圖1為PLN片段制備示意圖pcDNA3.1PLN和報告表達(dá)載體pcDNA3.1PLN-GFP的構(gòu)建2為PLN片段的制備及酶切鑒定11kb DNA ladder；2pBluescript SK-PLN質(zhì)粒；3pBluescript SK-PLN質(zhì)粒用EcoRI+SmaI酶切；4pBluescript SK-PLNa質(zhì)粒；5pBluescript SK-PLNa質(zhì)粒用HindIII+BamHI酶切；6回收的PLN DNA片段圖3為真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN，pcDNA3.1PLN-GFP，pcDNA3.1PLN-p16質(zhì)粒構(gòu)建示意4為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CMV-PLN的限制性內(nèi)切酶分析1pcDNA3.1質(zhì)粒；2pcDNA3.1-CMV-PLN質(zhì)粒；3pcDNA3.1用EcoRI酶切；4pcDNA3.1-CMV-PLN質(zhì)粒用HindIII酶切；5pcDNA3.1-CMV-PLN質(zhì)粒用HindIII+BamHI酶切；61kb DNA ladderMaker圖5為重組pcDNA3.1PLN質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶分析11kb DNA ladder Maker；2pcDNA3.1-CMV-PLN質(zhì)粒；3pcDNA3.1-CMV-PLN用HindIII+NruI酶切；4pcDNA3.1PLN質(zhì)粒；5pcDNA3.1PLN用EcoRI酶切；6DNA DL-2000 Maker圖6為重組質(zhì)粒pcDNA3.1PLN-GFP的限制性內(nèi)切酶分析11kb DNA ladder Maker；2pcDNA3.1PLN質(zhì)粒；3pcDNA3.1PLN-GFP質(zhì)粒；4pcDNA3.1PLN質(zhì)粒用EcoRI+NotI酶切；5pcDNA3.1PLN-GFP質(zhì)粒用EcoRI+NotI酶切；61kb DNA ladderMaker圖7為重組質(zhì)粒pcDNA3.1PLN-p16的限制性內(nèi)切酶分析11kb DNA ladder Maker；2pcDNA3.1PLN質(zhì)粒；3pcDNA3.1PLN-p16質(zhì)粒；4pcDNA3.1PLN質(zhì)粒用EcoRI+XhoI酶切；5pcDNA3.1PLN-p16質(zhì)粒用EcoRI+XhoI酶切；61kb DNA ladderMaker圖8為pcDNA3.1PLN-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP陽性細(xì)胞比率的FACS分析結(jié)果圖9為Western blot分析pcDNA3.1PLN-p16/MCF-7，pcDNA3.1PLN/MCF-7，MCF-7細(xì)胞中p16蛋白的表達(dá)1陽性對照HeLa細(xì)胞；2pcDNA3.1PLN-p16/MCF-7細(xì)胞；3pcDNA3.1PLN/MCF-7細(xì)胞；4MCF-7細(xì)胞圖10為MCF-7，MCF-7/pcDNA3.1，MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16細(xì)胞生長曲線圖11為p16對MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響具體實施方式
實施例1 L-plastin啟動子調(diào)控下腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN的構(gòu)建一、實驗材料1.質(zhì)粒和菌株(1)pcDNA3.1(+)質(zhì)粒購自Invitrogen公司，Bluescript SK質(zhì)粒購自Strategen公司。
(2)大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
2.分子克隆主要相關(guān)試劑(1)限制性內(nèi)切酶HindIII，BamHI，EcoRI，SmaI，NruI購自大連寶生物工程有限公司。
(2)大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段(Large fragment E.coli DNA polymerase I)，T4 DNA連接酶(ligase)及其相應(yīng)緩沖液，購自大連寶生物工程有限公司。
(3)dNTP(脫氧核苷三磷酸)，購自Promega公司。
(4)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(1kb DNA Ladder)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
(5)質(zhì)粒提取、純化試劑盒，購自Promega公司。
(6)DNA回收試劑盒，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
(7)細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(tryptone)，酵母提取物(yeast extract)，購自O(shè)xid公司。
(8)瓊脂糖凝膠電泳所需的瓊脂糖、溴化乙錠、Tris等購自Sigma公司。
(9)其他試劑均為分析純的國產(chǎn)生化試劑。
(10)Eppendorf管、移液器槍尖等塑料耗材，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
二、實驗方法(一)2.4kb L-plastin啟動子PLN基因片段的獲得2.4kb L-plastin啟動子PLN基因片段的獲得具體參照文獻(xiàn)Lin CS等J Biol Chem，1993，2682781-2801的兩篇文章及Lin CS等1993年在Mol.Cell Biol，1990，101818-1821獲得，獲得的兩端帶有ScaI酶切位點的2382bp的片段插入到Bluescript SK質(zhì)粒的EcoRV位點后，即獲得重組2.4kbL-plastin啟動子的克隆載體Bluescript SK-PLN。
1.新鮮感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)將凍存的E.coli DH5α種植在LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；(2)挑取單個克隆接種于3mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；(3)次日將菌液按1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-4h，使OD600值達(dá)到0.4；(4)冰浴15min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；(5)將菌液移入預(yù)冷的Eppendorf管中，4000rpm，4℃離心10min；(6)棄上清，將管倒置于濾紙上1min后，將細(xì)菌重新懸浮于500μl冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2中，輕輕混勻后，置冰浴30min；(7)4000rpm，4℃離心10min；(8)棄上清，將管倒置于濾紙上1min；(9)每管中加入200μl冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2，重懸菌體，冰浴中保存?zhèn)溆谩?br> 2.大腸桿菌轉(zhuǎn)化(1)在每管200μl的感受態(tài)細(xì)菌中加入1-2μl Bluescript SK-PLN質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min；(2)將管放入預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中，熱休克2min；(3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min；
(4)每管加入800μl 37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 150rpm振蕩培養(yǎng)45min；(5)5000rpm離心10min；(6)棄上清，剩余100μl液體重懸菌體，并涂布于LB氨芐青霉素抗性選擇固體培養(yǎng)基上，靜置10min；(7)倒置平皿于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h。
3.質(zhì)粒DNA的小量提取與純化按Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒操作說明進(jìn)行。
(1)挑取單個陽性克隆接種于5mL LB氨芐青霉素抗性選擇液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，OD600值達(dá)到0.6；(2)將菌液室溫下10000rpm離心10min，菌體收集于1.5mL Eppendorf管中，棄上清后，將管倒置于濾紙上1min；(3)加入250μl Cell Resuspension Solution，重新混旋菌體；(4)加入250μl Cell Lysis Solution，顛倒離心管4次使之混勻，室溫放置1-5min；(5)加入10μl Alkaline Protease Solution，顛倒離心管4次使之混勻，室溫放置5min；(6)加入350μl Neutralization Solution，立即顛倒離心管4次使之混勻，12000rpm室溫離心10min；(7)將上清小心移入Spin Column上，12000rpm室溫離心1min；(8)棄掉管中液體，加入750μl Column Washing Solution，12000rpm室溫離心1min；(9)棄掉管中液體，加入250μl Column Washing Solution，12000rpm室溫離心2min；(10)將Spin Column轉(zhuǎn)移入一新的無菌的1.5mL Eppendorf管中，用100μl Nuclease-FreeWater洗脫，12000rpm室溫離心1min；(11)棄掉Spin Column，于-20℃保存Eppendorf管中的DNA，備用。
4.PLN基因片段的制備(1)將Bluescript SK-PLN質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和SmaI雙酶切反應(yīng)，37℃水浴2h；(2)酶切反應(yīng)完成后，加入大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段和dNTP，室溫下溫育15min將酶切片段的3′凹端補(bǔ)平；(3)于75℃水浴中加熱10min，以滅活反應(yīng)液中的大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段和限制酶；(4)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，在5.34kb處可見一目標(biāo)片段Bluescript SK-PLN；(5)用DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段Bluescript SK-PLN1)電泳結(jié)束后，在紫外觀測儀上用手術(shù)刀片切取含有目標(biāo)DNA片段的瓊脂糖；2)放入預(yù)先稱量好的Eppendorf管中，稱量、搗碎，按重量比1∶3加入溶液B；3)50℃水浴10min，直至膠完全溶化，其間旋渦振蕩三次；
4)將溶液置于離心柱中，靜置1-2min，≥8000rpm離心30s-60s；5)倒掉液體，加入500μl溶液C(用無水乙醇1∶1稀釋)于離心柱中，8000rpm離心30s-60s；6)倒掉液體，用稀釋好的溶液C 500μl再洗一遍，8000rpm離心30s-60s；7)≥15000rpm再次離心30s-60s，以甩干剩余液體；8)將離心柱置于新的離心管中，加入≥50℃預(yù)熱的50μl溶液D，混勻，50℃水浴中溫育60min；9)≥15000rpm離心60s，管底即為所需DNA，將DNA保存于-20℃?zhèn)溆?。取少量DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定回收片段。
(6)將回收獲得的Bluescript SK-PLN片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒Bluescript SK-PLNa；(7)感受態(tài)細(xì)菌DH5α的制備及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，方法同上；(8)提取和純化重組質(zhì)粒Bluescript SK-PLNa，方法同上；(9)將正確重組的質(zhì)粒Bluescript SK-PLNa進(jìn)行HindIII和BamHI雙酶切反應(yīng)，37℃水浴2h；(10)酶切反應(yīng)完成后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，在2.4kb處可見一目標(biāo)片段PLN；(11)用DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段PLN(方法同上)，-20℃保存?zhèn)溆?。Bluescript SK-PLN質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和SmaI雙酶切反應(yīng)體系Bluescript SK-PLN 20μl10×T Buffer4μlEcoRI 2μlSmaI2μl0.1％BSA4μlddH2O 8μl總體積 40μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效果。
酶切片段補(bǔ)平反應(yīng)體系Bluescript SK-PLN質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)液 34μl大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段 2μldNTP mix4μl總體積 40μl室溫下溫育15min后于75℃水浴中加熱10min，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收Bluescript SK-PLN質(zhì)粒大片段備用；連接反應(yīng)體系補(bǔ)平的Bluescript SK-PLN質(zhì)粒大片段 1μl
10×連接酶緩沖液2μlT4DNA連接酶 1μlddH2O 16μl總體積 20μl充分混勻，16℃連接反應(yīng)過夜。
Bluescript SK-PLNa質(zhì)粒HindIII和BamHI雙酶切反應(yīng)體系Bluescript SK-PLNa 20μl10×K Buffer4μlHindIII 2μlBamHI 2μlddH2O 12μl總體積 40μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收PLN片段備用；(二)pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體的構(gòu)建1.pcDNA3.1-CMV-PLN中間載體的構(gòu)建用HindIII和BamHI雙酶切含有CMV啟動子的pcDNA3.1質(zhì)粒，獲得pcDNA3.1-CMV大載體片段后，通過連接反應(yīng)將已經(jīng)獲得的PLN基因片段與pcDNA3.1-CMV連接構(gòu)成pcDNA3.1-CMV-PLN中間重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，提取和純化連接產(chǎn)物，酶切分析鑒定。
(1)限制性酶切反應(yīng)pcDNA3.120μl10×K Buffer4μlHindIII 2μlBamHI 2μlddH2O 12μl總體積 40μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收pcDNA3.1-CMV大載體片段備用；(2)連接反應(yīng)pcDNA3.1-CMV大載體片段 1μlPLN基因片段 3μl10×連接酶緩沖液2μlT4DNA連接酶 1μl
ddH2O 13μl總體積 20μl充分混勻，16℃連接反應(yīng)過夜。pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體的構(gòu)建如圖3所示。
(3)感受態(tài)細(xì)菌的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法同上；(4)質(zhì)粒的提取與純化方法同上；(5)pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體的酶切分析鑒定pcDNA3.1-CMV-PLN 10μl10×K Buffer 2μlHindIII1μlBamHI 1μlddH2O 6μl總體積 20μlpcDNA3.1 10μl10×H Buffer 2μlEcoRI 1μlddH2O 7μl總體積 20μlpcDNA3.1-CMV-PLN 10μl10×M Buffer 2μlHindIII1μlddH2O 7μl總體積 20μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。獲得正確重組的pcDNA3.1-CMV-PLN中間載體。
2.pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體的構(gòu)建通過NruI和HindIII雙酶切反應(yīng)，從pcDNA3.1-CMV-PLN中間載體中去除CMV啟動子部分，再通過大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段補(bǔ)平載體大片段后，進(jìn)行連接反應(yīng)，使其環(huán)化，構(gòu)成pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，提取和純化質(zhì)粒并進(jìn)行酶切分析鑒定。
(1)pcDNA3.1-CMV-PLN質(zhì)粒的NruI和HindIII雙酶切反應(yīng)pcDNA3.1-CMV-PLN 20μl
10×NruI Buffer 4μlNruI2μlHindIII 2μl0.1％BSA4μlddH2O 8μl總體積 40μl37℃水浴2h后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效果。酶切結(jié)束后，進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)。
(2)酶切片段補(bǔ)平反應(yīng)pcDNA3.1-CMV-PLN質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)液34μl大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段 2μldNTP mix4μl總體積 40μl室溫下溫育15min后于75℃水浴中加熱10min，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收補(bǔ)平的pcDNA3.1PLN質(zhì)粒大片段備用；(3)連接反應(yīng)補(bǔ)平的pcDNA3.1PLN質(zhì)粒大片段 1μl10×連接酶緩沖液2μlT4DNA連接酶 1μlddH2O 16μl總體積 20μl充分混勻，16℃連接反應(yīng)過夜。pcDNA3.1PLN重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建如圖3所示。
(4)感受態(tài)細(xì)菌的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法同上；(5)質(zhì)粒的提取與純化方法同上；(6)pcDNA3.1PLN重組真核表達(dá)載體的酶切分析鑒定pcDNA3.1PLN 10μl10×H Buffer2μlEcoRI 1μlddH2O 7μl總體積 20μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。獲得正確重組的pcDNA3.1PLN質(zhì)粒載體(7)由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，序列如Sequence 1。
三、實驗結(jié)果與分析
(一)PLN基因片段的獲得和鑒定Bluescript SK-PLNa重組克隆載體的酶切分析和酶譜鑒定2.4kb L-plastin啟動子(PLN)基因片段的獲得具體參照文獻(xiàn)Lin CS等J Biol Chem，1993，2682781-2801的兩篇文章及Lin CS等1993年在Mol.Cell Biol，1990，101818-1821獲得，獲得的兩端帶有ScaI酶切位點的2382bp的片段插入到Bluescript SK質(zhì)粒的EcoRV位點后，即獲得重組2.4kbL-plastin啟動子的克隆載體Bluescript SK-PLN。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，為了后續(xù)表達(dá)載體構(gòu)建需要，首先將Bluescript SK-PLN克隆載體中的EcoRI酶切位點去除，構(gòu)建了重組克隆載體Bluescript SK-PLNa。Bluescript SK-PLN質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和SmaI雙酶切，并通過大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段補(bǔ)平后回收，得到一約5.3kb的DNA大片段。將回收的已補(bǔ)平的載體大片段，進(jìn)行自身連接環(huán)化，得到重組克隆載體Bluescript SK-PLNa，重組質(zhì)粒構(gòu)建圖見圖1。Bluescript SK-PLNa重組質(zhì)粒經(jīng)HindIII和BamHI酶切后，其產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，在約2.9kb和2.4kb處各出現(xiàn)一DNA條帶，與實驗預(yù)計的片段大小一致，將2.4kb的DNA條帶進(jìn)行回收，即獲得了兩端帶有所需酶切位點的PLN基因片段，見圖2。
(二)pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體的酶切分析和鑒定將含有CMV啟動子的pcDNA3.1真核表達(dá)載體經(jīng)HindIII和BamHI酶切后，酶切產(chǎn)物大片段與經(jīng)HindIII和BamHI酶切Bluescript SK-PLNa重組質(zhì)粒獲得的PLN基因片段相連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，將在瓊脂糖凝膠電泳中滯后于空質(zhì)粒的重組質(zhì)粒樣品進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)HindIII單酶切的空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳時分別在大約5.4kb和7.8kb處出現(xiàn)一明顯DNA條帶，這一結(jié)果與實驗設(shè)計的質(zhì)粒大小一致。將重組質(zhì)粒經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切后，其產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，在約2.4kb處出現(xiàn)一清晰DNA條帶。以上結(jié)果表明PLN基因已經(jīng)克隆入pcDNA3.1，pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體的構(gòu)建結(jié)果與實驗設(shè)計一致。參見圖3，4。
(三)pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體的構(gòu)建pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體經(jīng)HindIII和NruI雙酶切后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在7.1kb和0.7kb處分別出現(xiàn)一清晰DNA條帶，結(jié)果與實驗設(shè)計的一致，說明我們已經(jīng)成功地從pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體中消化掉了CMV啟動子序列。將不含CMV啟動子的大載體片段補(bǔ)平回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，使其自身環(huán)化，得到pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體。圖3為質(zhì)粒構(gòu)建圖。獲得的連接產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定分析。產(chǎn)物經(jīng)EcoRI單酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳，得到一條DNA條帶，該片段大小與pcDNA3.1-CMV-PLN重組中間載體經(jīng)HindIII和NruI雙酶切得到的大片段大小一致，見圖5。結(jié)果表明，獲得的連接產(chǎn)物即為pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體。測序結(jié)果也進(jìn)一步表明我們已經(jīng)成功將pcDNA3.1中的CMV啟動子置換為2.4kbL-plastin啟動子，構(gòu)建了全長為7.1kb的L-plastin啟動子調(diào)控下的腫瘤細(xì)胞特異性pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體。
實施例2報告表達(dá)載體pcDNA3.1PLN-GFP的構(gòu)建及活性檢測方法的建立為了檢測本發(fā)明中構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN的活性及腫瘤細(xì)胞特異性，本發(fā)明特采用了一種不需抗體、輔因子、酶底物等其他成分，而且不影響宿主細(xì)胞的獨特的報告蛋白——綠色熒光蛋白GFP。將GFP基因重組在pcDNA3.1PLN的L-plastin啟動子的下游構(gòu)建報告表達(dá)載體pcDNA3.1PLN-GFP，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞后，采用熒光激發(fā)細(xì)胞分選技術(shù)在流式細(xì)胞儀上檢測表達(dá)GFP細(xì)胞，根據(jù)發(fā)光細(xì)胞比率就可以分析L-plastin啟動子的相對活性及載體的腫瘤細(xì)胞特異性。具體如下一、實驗材料1.分子生物學(xué)相關(guān)材料及試劑(1)質(zhì)粒pEGFP-C1為Clontech公司產(chǎn)品。
(2)編碼GFP的序列是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以質(zhì)粒pEGFP-C1為模板，利用如下引物(正向引物5′-GGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3′；反向引物5′-GCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′)合成具有EcoRI和NotI酶切位點的0.7kb的GFP片段，序列如Sequence 2。具體參照文獻(xiàn)Kneen M等Biophys J，March1998，Vol.74，No.3，p.1591-1599。
(3)限制性內(nèi)切酶NotI購自大連寶生物工程有限公司。
(4)菌株及其他分子克隆主要相關(guān)試劑同實施例12.細(xì)胞株(1)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U343細(xì)胞株由加拿大阿爾伯塔大學(xué)郝春海博士提供。
(2)人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞株由深圳大學(xué)劉士德老師惠贈(3)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞株、鼠成纖維細(xì)胞系L929細(xì)胞株由吉林大學(xué)免疫教研室提供。
3.真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需主要材料及試劑(1)DMEM，脂質(zhì)體(Lipofectin) GIBCO公司產(chǎn)品。
(2)新生牛血清 杭州四季清生物工程公司。
(3)胰酶 Sigma公司產(chǎn)品(4)EDTA 北京化工廠產(chǎn)品(5)0.01M PBS(pH7.4)NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，蒸餾水定容至1000ml。
(6)細(xì)胞培養(yǎng)板為COSTAR產(chǎn)品二、實驗方法1.pcDNA3.1PLN-GFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒pcDNA3.1PLN進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切反應(yīng)后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，，回收目標(biāo)載體大片段，再通過連接反應(yīng)將具有相同酶切位點的GFP片段正向插入載體pcDNA3.1PLN的多克隆位點EcoRI和NotI之間，得到重組子pcDNA3.1PLN-GFP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，提取和純化連接產(chǎn)物，酶切分析鑒定。(1)限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)pcDNA3.1PLN 20μl10×H Buffer4μlEcoRI 2μlNotI2μl0.1％ BSA 4μlddH2O 8μl總體積 40μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，DNA回收試劑盒回收pcDNA3.1PLN大載體片段備用；(2)連接反應(yīng)pcDNA3.1PLN大載體片段 1μlGFPcDNA片段 3μl10×連接酶緩沖液2μlT4DNA連接酶 1μlddH2O 13μl總體積 20μl充分混勻，16℃連接反應(yīng)過夜。pcDNA3.1PLN-GFP重組載體的構(gòu)建如圖3所示。
(3)感受態(tài)細(xì)菌的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法同上；(4)質(zhì)粒的提取與純化方法同上；(5)pcDNA3.1PLN-GFP重組載體的酶切分析鑒定pcDNA3.1PLN 10μl10×H Buffer2μlEcoRI 1μlNotI1μl0.1％BSA2μlddH2O 4μl總體積 20μlpcDNA3.1PLN-GFP 10μl10×H Buffer2μlEcoRI 1μlNotI1μl
0.1％BSA2μlddH2O 4μl總體積 20μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。獲得正確重組的pcDNA3.1PLN-GFP重組載體。
(6)送樣品到上海生工生物工程有限公司測序。
2.pcDNA3.1-GFP載體的構(gòu)建參照質(zhì)粒pcDNA3.1PLN-GFP的構(gòu)建方法，將兩端帶有EcoRI和NotI酶切位點GFP片段正向插入載體pcDNA3.1的多克隆位點EcoRI和NotI之間，得到重組子，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5α，提取和純化連接產(chǎn)物，酶切分析鑒定。
3.細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于含10％新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃飽和濕度，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每3-5天，用0.25％胰酶和0.02％EDTA消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。
4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗(1)收獲細(xì)胞，將1-2×105個細(xì)胞重懸于2ml完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接于6孔培養(yǎng)板中；(2)37℃飽和濕度，5％CO2孵箱中培養(yǎng)18-24小時，待細(xì)胞達(dá)40-60％融合，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，用2ml無血清且無抗生素的DMEM洗滌一次；(3)在無菌管中配制如下溶液溶液A將1-2μg質(zhì)粒DNA溶于100μl無血清培養(yǎng)基中；溶液B將2-20μl脂質(zhì)體溶于100μl無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育30分鐘。
(4)輕輕混合溶液A和B，置室溫15分鐘；(5)加入0.8ml無血清培養(yǎng)基至脂質(zhì)體-DNA混合物中，混勻后，小心滴加到細(xì)胞上，輕輕混勻；(6)37℃飽和濕度，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5-24小時后，棄掉轉(zhuǎn)染液，加入2ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；(7)轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步檢測。
5.流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)光率細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后，用0.25％胰酶和0.02％EDTA消化收集細(xì)胞，用冷的PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞三次，每次充分懸起細(xì)胞后，用水平轉(zhuǎn)頭常溫低速離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，最后，用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)光細(xì)胞比例。
三、實驗結(jié)果(一)pcDNA3.1PLN-GFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建如圖1所示，將具有EcoRI和NotI雙酶切位點的GFP片段通過連接反應(yīng)正向插入載體pcDNA3.1PLN的多克隆位點EcoRI和NotI之間，得到重組子pcDNA3.1PLN-GFP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，提取和純化連接產(chǎn)物，將在瓊脂糖凝膠電泳中滯后于空質(zhì)粒的重組質(zhì)粒樣品進(jìn)行酶切鑒定。分別將pcDNA3.1PLN和pcDNA3.1PLN-GFP質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切反應(yīng)后，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1PLN-GFP質(zhì)粒得到兩條DNA條帶，一條在7.1kb處，與pcDNA3.1PLN進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切反應(yīng)后的載體片段大小一致，另一條在0.7kb處，該片段大小與GFP片段一致，酶切鑒定結(jié)果與實驗設(shè)計相符。見圖3，6。
參照質(zhì)粒pcDNA3.1PLN-GFP的構(gòu)建方法，將兩端帶有EcoRI和NotI酶切位點GFP片段正向插入載體pcDNA3.1的多克隆位點EcoRI和NotI之間，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-GFP載體，以其用于活性分析的平行對照實驗中。
(二)pcDNA3.1PLN真核表達(dá)載體的活性分析將pcDNA3.1PLN-GFP和帶有CMV啟動子的pcDNA3.1-GFP及空質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染人的腫瘤細(xì)胞株(U343，HeLa)和轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞(HEK293)及鼠成纖維細(xì)胞株(L929)，轉(zhuǎn)染48小時后收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行FACS(fluorescence activated cell sorting)分析，通過分析表達(dá)GFP的發(fā)光細(xì)胞百分率來確定啟動子的相對活性和載體的轉(zhuǎn)染效率。FACS結(jié)果如圖7顯示，pcDNA3.1PLN-GFP和pcDNA3.1-GFP轉(zhuǎn)染的U343，HEK293的發(fā)光細(xì)胞比率明顯高于空質(zhì)粒(pcDNA3.1)的，而HeLa(沒有內(nèi)源性的L-plastin蛋白表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株)，L929細(xì)胞中，pcDNA3.1-GFP轉(zhuǎn)染后的發(fā)光率明顯高于pcDNA3.1PLN-GFP和空質(zhì)粒pcDNA3.1的，并且pcDNA3.1PLN-GFP和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后的發(fā)光率差異不顯著。從L-plastin啟動子/CMV啟動子活性比值來看，在轉(zhuǎn)染的U343，HEK293細(xì)胞中L-plastin啟動子的活性與CMV啟動子的活性基本相當(dāng)(如表所示)。檢測結(jié)果表明pcDNA3.1PLN載體中L-plastin啟動子啟動下游基因僅在存在內(nèi)源性L-plastin的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而且啟動子活性較高，與CMV啟動子活性相當(dāng)。這一結(jié)果與以往以LacZ為報告基因的檢測結(jié)果一致。這表明我們的檢測方法及報告基因的選擇是可行的。以LacZ為報告基因檢測L-plastin啟動子活性時，需對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行固定等一系列處理，并且需要相應(yīng)的酶底物(如X-gal)進(jìn)行顯色，才能分析相對活性，因此，以GFP為報告基因分析啟動子活性較以LacZ等報告基因更直觀、簡便、快捷。
表 用GFP作報告蛋白對轉(zhuǎn)染細(xì)胞中L-plastin和CMV啟動子的相對活性分析啟動子相對活性(GFP陽性細(xì)胞百分比)細(xì)胞株L-plastin CMV相對活性(L-plastin/CMV)U343 15.86 14.65 1.08HeLa 6.3 23.21 0.27HEK293 28.57 28.97 0.98L929 7.5836.64 0.21
實施例3 治療表達(dá)載體pcDNA3.1PLN-p16的構(gòu)建及其抑瘤效應(yīng)分析一、實驗材料1.分子生物學(xué)相關(guān)材料及試劑(1)兩端帶有EcoRI和XhoI酶切位點的編碼p16的序列通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)從淋巴細(xì)胞中獲得，序列如Sequence3。
(2)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI購自大連寶生物工程有限公司。
(3)其他材料及試劑同實施例1和實施例22.細(xì)胞株 缺少p16表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞株由吉林大學(xué)免疫教研室提供。
3.抗體(1)小鼠抗人p16INK4a單克隆抗體購于晶美生物工程有限公司。
(2)山羊抗小鼠IgG-HRP購于北京中山生物技術(shù)有限公司。
4.主要試劑(1)細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所需主要試劑除G418為GIBCO公司產(chǎn)品，DMSO為Sigma公司產(chǎn)品外，其余同實施例2。
(2)SDS-PAGE和Western blot所需主要試劑丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、BSA購于上海生工生物工程有限公司SDS、Tris、甘氨酸、PMSF、DAB均為Sigma公司產(chǎn)品(3)主要試劑配制1)細(xì)胞裂解液0.15mol/L NaCl，10m mol/L Tris-Cl(pH7.4)，5m mol/L EDTA，1％TritonX-100，1m mol/L PMSF2)SDS-PAGE用試劑及其他相關(guān)試劑的配置參照Sambrook J等編著的《分子克隆實驗指南》第二版二、實驗方法(一)重組p16基因的表達(dá)載體pcDNA3.1PLN-p16的構(gòu)建將質(zhì)粒pcDNA3.1PLN進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切反應(yīng)，獲得載體大片段，再通過連接反應(yīng)將p16cDNA正向插入載體pcDNA3.1PLN的多克隆位點EcoRI和XhoI之間，得到重組子pcDNA3.1PLN-p16，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，提取和純化連接產(chǎn)物，酶切分析鑒定。
1.限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)pcDNA3.1PLN 20μl10×H Buffer 4μlEcoRI 2μlXhoI 2μlddH2O12μl
總體積 40μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，DNA回收試劑盒回收pcDNA3.1PLN大載體片段備用；2.連接反應(yīng)pcDNA3.1PLN大載體片段 1μlP16cDNA片段 3μl10×連接酶緩沖液2μlT4DNA連接酶 1μlddH2O 13μl總體積 20μl充分混勻，16℃連接反應(yīng)過夜。pcDNA3.1PLN-p16重組載體的構(gòu)建如圖3所示。
3.感受態(tài)細(xì)菌的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法同上；4.質(zhì)粒的提取與純化方法同上；5.pcDNA3.1PLN-p16重組載體的酶切分析鑒定pcDNA3.1PLN 10μl10×H Buffer2μlEcoRI 1μlXhoI1μlddH2O 6μl總體積 20μlpcDNA3.1PLN-p16 10μl10×H Buffer2μlEcoRI 1μlXhoI1μlddH2O 6μl總體積 20μl37℃水浴2h酶切結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。獲得正確重組的pcDNA3.1PLN-p16重組載體。
6.送樣品到上海生工生物工程有限公司測序。
(二)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立1.收獲細(xì)胞，將1.5×105個細(xì)胞重懸于2ml完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接于6孔培養(yǎng)板中；2. 37℃飽和濕度，5％CO2孵箱中培養(yǎng)18-24小時，待細(xì)胞達(dá)30-50％融合，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，用2ml無血清且無抗生素的DMEM洗滌一次；3.在無菌管中配制如下溶液溶液A將2μg質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1PLN或pcDNA3.1PLN-p16)溶于100μl無血清培養(yǎng)基中；溶液B將10μl脂質(zhì)體溶于100μl無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育30分鐘。
4.參照實施例2中瞬時轉(zhuǎn)染的(4)-(6)；5.轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞，將細(xì)胞按1∶10比例轉(zhuǎn)移至含有1mg/mlG418的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)；6.約3-5天后，更換篩選液，G418濃度降至200μg/ml，以維持篩選作用。每3天換液一次，大約2周后，2-3mm的抗性克隆形成；7.克隆化用無菌濾紙蘸取0.25％胰酶將陽性克隆消化下來，轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；8.擴(kuò)大培養(yǎng)待細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中長滿后，轉(zhuǎn)移至T25方瓶中培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移至100ml培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。
9.連續(xù)傳代，檢測外源基因的表達(dá)；10.繼續(xù)培養(yǎng)獲得MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16和MCF-7/pcDNA3.1PLN細(xì)胞系，保存細(xì)胞。
(三)Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p16INK4a基因的表達(dá)分別收集1×106個MCF-7，MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16和MCF-7/pcDNA3.1PLN細(xì)胞，冷的0.01mol/L PBS洗細(xì)胞2次后，加入100μl細(xì)胞裂解液，充分混勻，冰浴30分鐘，4℃10000rpm離心10分鐘，取上清測蛋白含量。將蛋白變性，經(jīng)12％SDS-PAGE膠電泳分離后，通過半干式轉(zhuǎn)移電泳槽將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將NC膜在3％BSA-TBST中4℃封閉過夜，TBST洗膜3次，15min 1次，5min 2次，加入抗p16INK4a單克隆抗體(抗體用封閉液按1∶200稀釋)，室溫作用2小時，TBST洗膜3次，15min 1次，5min 2次，加入羊抗小鼠IgG-HRP(用封閉液按1∶5000稀釋)，室溫孵育2小時，TBST洗3次，每次10min，與底物(DAB)在過氧化氫存在的條件下顯色，蒸餾水漂洗終止反應(yīng)。
(四)MCF-7細(xì)胞增殖特性分析將1×105細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)，每24小時計數(shù)一次，連續(xù)5天，繪制生長曲線。
(五)流式細(xì)胞儀分析p16INK4a表達(dá)對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，收集細(xì)胞，冷PBS洗2次，70％冷乙醇固定，PI染色后，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行FACS分析。
三、實驗結(jié)果與分析參照實施例2中報告載體pcDNA3.1PLN-GFP的構(gòu)建方法，通過連接反應(yīng)將治療基因p16cDNA正向插入載體pcDNA3.1PLN的多克隆位點EcoRI和XhoI之間，得到重組子pcDNA3.1PLN-p16，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，提取和純化連接產(chǎn)物，將在瓊脂糖凝膠電泳中滯后于空質(zhì)粒的重組質(zhì)粒樣品進(jìn)行酶切鑒定。分別將pcDNA3.1PLN和pcDNA3.1PLN-p16質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切反應(yīng)后，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1PLN-p16質(zhì)粒得到兩條DNA條帶，一條在7.1kb處，與pcDNA3.1PLN進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切反應(yīng)后的載體片段大小一致，另一條在0.8kb處，該片段大小與p16cDNA片段一致，酶切鑒定結(jié)果與實驗設(shè)計相符(圖3，7)。結(jié)果表明，已經(jīng)成功構(gòu)建治療載體pcDNA3.1PLN-p16。
將重組p16基因的pcDNA3.1PLN-p16以及空載體pcDNA3.1PLN分別通過脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，經(jīng)新霉素G418抗性篩選后，進(jìn)行如下實驗分析①分別裂解MCF-7，MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16細(xì)胞，以抗p16的抗體為探針進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果如圖9顯示僅MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16細(xì)胞在約16千道爾頓處檢測到一條明顯的雜交帶，說明在該細(xì)胞克隆中存在p16的表達(dá)，而MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7對照細(xì)胞沒有檢測到p16的表達(dá)。這說明p16基因已被轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞，并在L-plastin啟動子的調(diào)控下得到有效表達(dá)。②通過細(xì)胞生長曲線如圖10，可以看出，pcDNA3.1PLN-p16的轉(zhuǎn)染顯著抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖能力，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pcDNA3.1PLN細(xì)胞與MCF-7對照細(xì)胞增殖速度的差異不顯著。③通過流式細(xì)胞儀的FACS分析細(xì)胞周期結(jié)果如圖11顯示MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例較對照組(MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7對照細(xì)胞)增加近24％，S期細(xì)胞比例較對照組(MCF-7/pcDNA3.1PLN及MCF-7對照細(xì)胞)下降近15％，這一結(jié)果表明pcDNA3.1PLN-p16的轉(zhuǎn)染使MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的G1期阻滯，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞分裂。④通過流式細(xì)胞儀的FACS分析細(xì)胞凋亡結(jié)果見圖11顯示MCF-7/pcDNA3.1PLN-p16細(xì)胞中凋亡細(xì)胞百分比為23.61％，而MCF-7/pcDNA3.1PLN細(xì)胞和MCF-7對照細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比分別為9.17％和11.27％，凋亡細(xì)胞百分比較對照組提高了近13％。這一結(jié)果說明pcDNA3.1PLN-p16的轉(zhuǎn)染使MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞實驗結(jié)果說明pcDNA3.1PLN-p16真核表達(dá)載體能夠表達(dá)功能性p16蛋白，抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡。如果用pcDNA3.1PLN-p16真核表達(dá)載體導(dǎo)入p16進(jìn)行腫瘤治療，不僅能充分發(fā)揮p16的抑瘤作用，而且具有腫瘤特異性，降低毒副作用，確保治療的安全有效。
序列表<110>OrganizationName吉林大學(xué)Application Project-------------------<120>Title一種腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體<130>AppFileReferenceP16<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence 1--------<213>OrganismNamePlasmid pcDNA3.1(+)<400>PreSequenceStringgacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgag cttgatacta tgctgcacaa gcaatttaaa 240acaccaacag caaaaaaata cacttctctg aaaaagtctt ggtctaggac ctaaacaatt 300gcctgaaact gggtagactt acaccaatga gaggcagata aagagattaa gattgaggga 360gtagggcagg gcttgcaatg gtgccggcca ggatgtggct gagggggtgt gggtgcctgc 420cgtggatgct agggtagaag acgactctat taactgggtg gctgtaagca gtacccaggt 480caatgccttt catcttctac aacctcgacg ttgcctggaa tcctaaatct ttttcttcac 540ttaacaaaca tcacctctgc tcaaatctgc aactgctttg atatcacact gcctttttca 600cccctctatt atagatggca tttatttact tacatgtttt ttccccacta gactatactc 660cttgagaaca gcgattgtgt cttatttatt tctgaatcac caattcagac aggcatgcaa 720acacttgctg aaccaatgca caaatatatt ttgctcttct tcatagattc ctccggcctc 780agatgaccag gcaccactag atacagaaca ctgtgctttc cttctccaag gtaaaggaat 840aaatatctgt tccccttcat gaagtgttac tgttgggcct ttatgccatc ctgaagccac 900caggatgtgg aaccagatca gggaggtcca cagttacaac cccttgtatc tgtaacacca 960gcaggacatt atctacagag tcctgctgca gggccccgaa tgaagacagc attttgctgc1020tttgtagcgt gagcagtgct gtaacagtga tgcatggatg ttcctctggt gtcctgaaag1080aatgtaggtg cttcttgaaa gctctctgca acttattaat tgggagtgat tatgcgatgg1140agaaaacaga gtccccatca ccccctcagt cttccctggg aaatcacaag agggctgata1200gctctctgtg aggtgaaccg tttctagaat ccccaccgtc tcgtcctgtt cttccgccca1260cccagttcct caagatagcc cctgtgggct tctgatgaag tcaccacacc actggctaat1320gaagtagata aaccagaaca gtttggttta acatttaagg tcagaaacag gaactttcta1380gaggagaaat caaaaaagca aaagaagtat aagggcagcc ctccaaccag tcagaatacc1440gtgaccacct gagaggcccg tggcccagcg gacacggacg catgtcaact ctggagcaga1500tatcttcagc gcagcatctg acctgggagt acagccacat accctcattc ctaaacggca1560gattgactac tggagtcaca cacagtctcc gggcaatgtg gagacatgtc taatatttag1620tcaacataac tcagggtgcc acagtcttca caactgttgt gagcacttga ggatgctcca1680tttgaagata ggaatttgcc ctcaagcatc tggggtttgg gtacagaaca gagcttcccc1740tgccaccacc tgctaatttt ataaatgtgc attcaaaaaa aaatcctgcc tgtaagaagg1800aattaagcta cccatttaaa tataacagct gcctgtgcaa tctactgctg ctctttatag1860gaaacgctta aataattgag atacttaatt gggttaaaga gatccctagc acatagatgt1920tctataaata aaagaatgag taaataatct agtaaccttc cttttcatgt ccttcactta1980aagagatcgt tctgttttgt ttgcaccaat aagatcactg ttagaggact ccagagaggt2040ttgatttcag gtggggtggg gctttcccaa ggaagtccct tttcattgtt tcaggtgtac2100
tgccaccttt ttccctggct ctttcactaa aaatgaaaaa tttgttgatc tttgctgtaa2160gtaggtaggc atctgggctt tgcttttgca actagagtca aagaagtcaa gttatcaggc2220tgatcttgcc ttgctatcta gaatcagaaa ggtttaagta gcccagggac tactcaaaga2280cagctggagg agaaagggag agagaaaaat gcttataaag aggtgggcaa aagagcggga2340ccttgtctca aaaaaaaaaa aaaaaaagag gaagtggtag gaggtgtctg aatttcactg2400tgacctgttc tgtcaggtga tttttggtgg ggcggggaca tgaaaaaaaa gttaaaatgt2460ccttataaag acaaaatctt tttctttcct ggctgatgat ttgtcattct agtcacttcc2520tgccttgtga ccacacaccc aggcttgaca aagctgttct gcagatcaga aagaaggggt2580tcctggtcat acaccagtat cgaattgggg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg2640cagatatcca gcacagtggc ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc2700agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc2760cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc2820gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg2880ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga2940ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt3000aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc3060gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca3120agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc3180caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt3240tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac3300aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc3360ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat3420gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc3480atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga3540agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc3600atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt3660tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga3720ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc3780ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac3840gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca3900atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt3960gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg4020tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga4080agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct4140cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg4200gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg4260gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc4320gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat4380ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac4440tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt4500gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct4560cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc4620tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca4680ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga4740tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag4800cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt4860cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac4920cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt4980gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg5040gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt5100cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt5160tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc5220
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg5280ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg5340ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac5400gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg5460gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct5520ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg5580tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct5640gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac5700tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt5760tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc5820tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca5880ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc5940aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt6000aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa6060aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat6120gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct6180gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg6240caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag6300ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta6360attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg6420ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg6480gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct6540ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta6600tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg6660gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc6720cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg6780gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga6840tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg6900ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat6960gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc7020tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca7080catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 7109<212>TypeDNA<211>Length7109SequenceNamepcDNA3.1PLNSequenceDescriptionFeature-------SequencepcDNA3.1PLN<221>FeatureKeyL-plastin promoter<222>LocationFrom209<222>LocationTo2601Other InformationCDSJoinNoFeature-------SequencepcDNA3.1PLN<221>FeatureKeyMultiple cloning site<222>LocationFrom2610<222>LocationTo2690
Other InformationCDSJoinNoFeature-------SequencepcDNA3.1PLN<221>FeatureKeypcDNA3.1 bases 1011-5428<222>LocationFrom2691<222>LocationTo7109Other InformationCDSJoinNoJournal-------SequencepcDNA3.1PLN<301>AuthorsChung I，Schwartz P E，Crystol R G，Pizzorno G，Leavitt J，Deisseroth A<302>TitleUse of L-plastin promoter to develop an adenoviral system thatconfers transgene expression in ovarian cancer cells but not innormal mesothelial cells<303>JournalNameCancer Gene Therapy<304>Volume6<305>Issue2<306>PageRange99-106<307>Date1999-03-04<308>DBAccessionNumber<309>DBEntryDate＿＿-＿-＿<313>From209<313>To2609Journal-------SequencepcDNA3.1PLN<301>AuthorsLin C S，Chen Z P，Park T，Ghosh K，Leavitt J<302>TitleCharacterization of the human L-plastin gene promoter in normaland neoplastic cells<303>JournalNameTHE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY<304>Volume268<305>lssue4<306>PageRange2793-2801<307>Date1993-02-05<308>DBAccessionNumber<309>DBEntryDate＿＿-＿-＿<313>From209<313>To2609Sequence2--------<213>OrganismNamePlasmid pEGFP-C1<400>PreSequenceString
gaattcacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 60gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat120gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc180tggcccaccc tcgtgaccac cttcacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac240cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc300accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc360gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc420ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag480cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg540cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc600gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat660cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg720tacaagtaag cggccgc 737<212>TypeDNA<211>Length737SequenceNameGFPSequenceDescriptionFeature-------SequenceGFP<221>FeatureKeyCDS<222>LocationFrom10<222>LocationTo729Other InformationCDSJoinNoJournal-------SequenceGFP<301>AuthorsKneen M，F(xiàn)arinas J，Li Y，Verkman A S<302>TitleGreen fluorescent protein as a noninvasive intracellular pHindicator<303>JournalNameBiophysical Journal<304>Volume74<305>Issue3<306>PageRange1591-1599<307>Date1998-03-01<308>DBAccessionNumber<309>DBEntryDate＿＿-＿-＿<313>From<313>ToSequence3--------<213>OrganismNameHUMAN LYMPHOCYTE<400>PreSequenceStringcggagagggg gagaacagac aacgggcggc ggggagcagc atggagccgg cggcggggag 60cagcatggag ccttcggctg actggctggc cacggccgcg gcccggggtc gggtagagga120ggtgcgggcg ctgctggagg cgggggcgct gcccaacgca ccgaatagtt acggtcggag180gccgatccag gtcatgatga tgggcagcgc ccgagtggcg gagctgctgc tgctccacgg240
cgcggagccc aactgcgccg accccgccac tctcacccga cccgtgcacg acgctgcccg300ggagggcttc ctggacacgc tggtggtgct gcaccgggcc ggggcgcggc tggacgtgcg360cgatgcctgg ggccgtctgc ccgtggacct ggctgaggag ctgggccatc gcgatgtcgc420acggtacctg cgcgcggctg cggggggcac cagaggcagt aaccatgccc gcatagatgc480cgcggaaggt ccctcagaca tccccgattg aaagaaccag agaggctctg agaaacctcg540ggaaacttag atcatcagtc accgaaggtc ctacagggcc acaactgccc ccgccacaac600ccaccccgct ttcgtagttt tcatttagaa aatagagctt ttaaaaatgt cctgcctttt660aacgtagata taagccttcc cccactaccg taaatgtcca tttatatcat tttttatata720ttcttataaa aatgtaaaaa agaaaaacac cgcttctgcc ttttcactgt gttggagttt780aaaaatgtaa aaaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa818<212>TypeDNA<211>Length818SequenceNameP16SequenceDescriptionJournal-------SequenceP16<301>AuthorsSerrano M，Hannon GJ，Beach D<302>TitleA new regulatory motif in cell-cycle control causing specificinhibition of cyclinD/CDK4<303>JournalNameNature<304>Volume366<305>Issue47<306>PageRange704-707<307>Date1993-12-16<308>DBAccessionNumber<309>DBEntryDate＿＿-＿-＿<313>From41<313>To508
權(quán)利要求
1.一種腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是包括去掉CMV啟動子序列后的pcDNA3.1質(zhì)粒，和在該pcDNA3.1質(zhì)粒的多克隆位點NruI和BamHI之間插入的2.4kb的L-plastin啟動子序列PLN。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是其核苷酸序列如Sequence 1所述。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是在2.4kb的L-plastin啟動子序列PLN下游的多克隆位點EcoRI和NotI之間插入報告蛋白GFP基因，構(gòu)建報告表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是報告蛋白GFP基因核苷酸序列如Sequence 2所述。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是在2.4kb的L-plastin啟動子序列PLN下游的多克隆位點插入腫瘤治療基因，構(gòu)建治療表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是在2.4kb的L-plastin啟動子序列PLN下游的多克隆位點EcoRI和XhoI之間插入p16基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，其特征是p16基因核苷酸序列如Sequence 3所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體，屬于真核表達(dá)載體的構(gòu)建。包括去掉CMV啟動子序列后的pcDNA3.1質(zhì)粒，和在該pcDNA3.1質(zhì)粒的多克隆位點NruI和BamHI之間插入2.4kb的L－plastin啟動子序列PLN。所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN是一種非病毒的腫瘤細(xì)胞特異性的高效表達(dá)載體，為腫瘤靶向基因治療提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。用本發(fā)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1PLN介導(dǎo)p16，CD，p53，p21等腫瘤治療基因進(jìn)行腫瘤治療，不僅能充分發(fā)揮治療基因的抑瘤作用，而且具有腫瘤特異性，降低毒副作用，確保治療的安全有效。
文檔編號A61K48/00GK1644701SQ20041001119
公開日2005年7月27日 申請日期2004年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日
發(fā)明者李桂英, 朱迅 申請人:吉林大學(xué)