專利名稱：用于預防艾滋病的重組痘病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的疫苗，尤其是，所述疫苗為含有編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白的經(jīng)過人工修飾的Gag、Pol和野生的Env核苷酸序列的重組痘病毒。這些疫苗在體內施用時用作病毒蛋白抗原生物合成的轉錄單位。
背景技術：
艾滋病被認為是世界上直接威脅人類健康的第一大傳染病，聯(lián)合國艾滋病聯(lián)合規(guī)劃署發(fā)表的《2004全球艾滋病疫情年度報告》指出，目前全球有3800萬名艾滋病病毒攜帶者，2003年共有290萬人死于艾滋病。2003年，亞洲地區(qū)共有110萬人被感染，50多萬人死于艾滋病，該地區(qū)目前共有740萬名艾滋病毒攜帶者。2003年底，中國有艾滋病病毒感染者約84萬，其中艾滋病患者約8萬例。報告感染數(shù)波及31個省、自治區(qū)、直轄市。雖然近幾年抗艾滋病藥物的“雞尾酒”療法在發(fā)達國家有效地控制了HIV的蔓延，但是昂貴的價格(在我國該藥物價格大約為3000-10000元人民幣/人/月)，耐藥病毒株的產生，長期用藥的副作用以及最終無法徹底清除患者體內病毒等方面的不利因素顯示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地預防和控制艾滋病。所以艾滋病疫苗研制勢在必行。
國內外有關方面研究現(xiàn)狀 用HIV-1疫苗防治AIDS被國際上認為是目前最行之有效的方法，已成為世界上許多科研機構研究的熱點。目前，關于艾滋病疫苗的生產國際上尚屬空白。而HIV-1疫苗的研制工作在國外已有多家大型科研機構、制藥公司正開展進行。
自八十年代發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，人們就開始進行艾滋病疫苗的研究。一般來說，減毒活疫苗和滅活疫苗能產生較好免疫保護性反應，但安全性較差，不適用于作為艾滋病疫苗。隨著人類對艾滋病認識的不斷提高，九十年代初人們意識到CTL(Cytotoxic T Lymphocytes細胞毒性T細胞，即細胞免疫應答)的重要性，越來越多的證據(jù)顯示陽性CD8介導的CTL在控制艾滋病毒感染中起舉足輕重的作用。因此人們開始研究用重組病毒載體疫苗來誘導CTL，然后用胞膜蛋白亞單位疫苗增強免疫來誘導中和抗體，力圖從體液免疫和細胞免疫兩方面來誘導人體對艾滋病毒的保護反應。但由于免疫強度有限，而用重組載體疫苗又難以進行多次增強免疫，所以在動物模型和人體試驗結果都顯示了較低的對HIV的免疫保護反應。
痘病毒作為天花的有效疫苗被在世界范圍內廣泛應用，為人類最后在全世界范圍內滅絕天花做出了決定性的貢獻。痘病毒具有極高的免疫效率，但是它也具有明顯的副作用。例如，接種者往往出現(xiàn)發(fā)燒，虛弱，肌肉痛，頭痛，嘔吐和淋巴結腫大等癥狀。絕大部分接種者都出現(xiàn)發(fā)燒癥狀。尤其兒童接種者，近70％的兒童接種者體溫上升到38度，15-20％的兒童甚至達到更高的體溫。更有甚者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥，直至死亡。據(jù)McElwain等報道，美國七十年代平均每年有七人死于天花疫苗接種。
由于痘苗病毒的副作用，人們在六、七十年代就開始了痘苗病毒的致弱工作。1960年至1974年期間，德國教授Anton Mayr領導的研究小組通過將痘病毒在雞胚成纖維細胞中傳代的方法，成功地將從Ankara地區(qū)分離得到的痘病毒CVA株致弱。當傳到516代時，這株致弱毒株被命名為MVA(Modified Vaccinia Ankara)。MVA不但繼承了CVA的免疫原性好，對天花的保護性高的特點，同時由于在哺乳細胞不能繁殖，所以MVA還具有對人和動物毒副作用小的特點。動物試驗(雞，兔和小鼠)結果顯示，MVA對新生動物不產生任何副作用，甚至對于免疫能力低下的動物同樣沒有明顯的副作用。
1980年，隨著世界衛(wèi)生組織宣布天花在地球上的滅絕，痘苗病毒本身作為疫苗的歷史結束了。然而在同一年，基因重組技術在痘苗病毒上的應用，為痘病毒作為病毒載體用于開發(fā)研制新疫苗拓開了嶄新，廣泛的應用前景。
MVA作為病毒載體，具備其他痘病毒載體的優(yōu)點如(1)外源基因容量大，MVA不但能夠表達大的外源基因，而且能夠同時容納，表達多個外源基因，從而可以同時刺激產生針對多種抗原的免疫反應或表達免疫輔助因子，誘導產生高效保護反應；(2)表達水平高；(3)感染多種細胞，使抗原有效地提呈到不同的組織；(4)同時MVA還具有獨特的優(yōu)勢，安全性好。
MVA目前被廣泛用于人類基因治療和疫苗的研究，英國的Oxford Bio Medica和法國Strasbourg的TransGene，在分別以MVA為載體進行癌癥基因治療的人體臨床試驗，同時英國MRC和肯尼亞正在合作進行以MVA為載體的HIV疫苗的臨床試驗。
國內研究艾滋病疫苗的隊伍主要有中國預防醫(yī)學科學院、衛(wèi)生部艾滋病預防與控制中心和病毒學研究所、清華大學、中國科學院微生物所及一些部隊院校等。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種用于預防艾滋病的重組痘病毒疫苗(M-GPE)。
本發(fā)明采取的技術方案是該預防艾滋病的重組痘病毒疫苗一種含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，所述轉錄單位編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白序列，該人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白序列是具有免疫原性的人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中轉錄單位指導抗原的合成。本發(fā)明的一個重要方面，采用的痘病毒是經(jīng)過修飾的痘病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankara，MVA)。在本發(fā)明的另一個重要方面，所含有的轉錄單位編碼的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重組型的結構蛋白，進一步包括人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、編碼酶類蛋白的Pol和外膜蛋白Env。其各氨基酸序列分別如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4所述。
本發(fā)明所述的重組的痘病毒是非復制型的。
本發(fā)明可作為一種用于預防艾滋病的非復制型重組痘病毒載體疫苗，它包含了可編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明包含一個β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表達報告基因Lac Z，含有兩個啟動子，分別是引導Lac Z基因的啟動子P11和引導人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白基因的HIV-1-GagPol和Env的P7.5，包含兩個閱讀框架，可以同時表達β-半乳糖苷酶表達報告基因Lac Z和人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白HIV-1-GagPol和Env。
在本發(fā)明的一個重要實施方案中，包含由穿梭質粒PSC11-GPE與經(jīng)過修飾的痘病毒安卡拉株重組而成，穿梭質粒PSC11-GPE包含了編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白的核苷酸序列，穿梭質粒PSC11-GPE的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述，其中編碼GagPol的核苷酸序列來源于經(jīng)過修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的GagPol的核苷酸序列，而編碼Env蛋白的核苷酸序列則來源于未經(jīng)修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env的核苷酸序列。
本發(fā)明提供了一種藥用組合物，為含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒和一種可藥用的載體。它的一個重要實施方案中含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒M-GPE與生理鹽水的滴度體積比為106-1010pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。
本發(fā)明提供了一種抗原，其由含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒表達產生，該表達產生的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的結構蛋白Gag、Pol和Env。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)表達水平高；(2)感染多種細胞，使抗原有效地提呈到不同的組織；(3)安全性好；(4)疫苗靶抗原包括了幾乎所有的HIV-1結構蛋白，如GagPol和Env，更好的誘導人體產生對HIV有效的免疫保護。


圖1、穿梭質粒pSC11-GPE示意圖。該質粒共含有14958bp，包括兩個方向相反的啟動子P11和P7.5分別驅動LacZ和HIV-1抗原基因的轉錄，F(xiàn)L-1-TK和FL-2-TK是兩段與MVA病毒載體上TK基因的同源序列，正是由于這兩段同源序列的存在，使該重組穿梭質粒和MVA在細胞內能發(fā)生同源重組，把包括LacZ和HIV-1抗原基因的表達框重組到MVA病毒載體中，從而構建了重組MVA病毒載體疫苗M-GPE。
圖2、M-GPE示意圖。HIV-1結構基因表達框架重組到MVA的TK基因中，基因表達的啟動子采用P7.5。
圖3 gagpol基因重組痘苗病毒在哺乳動物細胞中的表達情況。
含有gagpol基因的MVA重組病毒感染HEK293細胞，感染16-24小時后收集細胞，用WESTEN BLOT檢測蛋白表達情況。LANE 1空白對照；LANE 2未修飾的gagpol基因表達產物；LANE 3修飾的gagpol基因表達產物。
圖4 M-GPE在哺乳動物細胞中的表達。
人HEK293細胞被M-GPE感染。蛋白表達用WESTERN BLOT分析。實驗所用抗體為廣西壯族自治區(qū)HIV-1陽性血清。LANE 1標準蛋白分子量；LANE 2空白對照；LANE 3M-GPE表達產物；LANE 4標準病毒(廣西壯族自治區(qū)HIV-1高發(fā)區(qū)病毒樣品)。
具體實施例方式
實施例1抗原的選擇與修飾1、目的基因的選擇目前中國主要的HIV-1流行株為B/C重組型HIV-1。
選擇的HIV-1中國流行株gagpol基因序列如SEQ ID NO6，選擇的HIV-1中國流行株env基因序列如SEQ ID NO7，我們這里用于構建艾滋病疫苗的HIV-1目的基因就是根據(jù)上述B/C重組亞型的基因序列為基礎，然后對gagpol進行了全序列人工合成，該合成的基因所表達的氨基酸序列與野生的HIV-1中國流行株gagpol基因表達的氨基酸序列一致，但基因表達效率則大大提高。
以上述修飾過的gagpol和野生的env基因作為目標抗原的基因，它們的表達產物組成了HIV-1最主要的結構蛋白，因此它們是抗原基因的最佳選擇。
2、抗原基因gagpol的修飾2.1方法根據(jù)我們以前研究的結果發(fā)現(xiàn)，HIV-1 gag，pol基因內存在許多抑制因子。這些抑制因子是以A和T為主組成，造成HIV-1 mRNA不穩(wěn)定，不能從細胞核轉制到細胞漿，從而影響蛋白表達。去除抑制因子的辦法就是在不影響氨基酸編碼的前提下，將Codon第三位的A或T盡量改為C或G。
2.2過程GPCINS、ENVCINS分別代表合成的全新的gagpol和env基因GPCINS基因序列合成引物F1GACGTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATCCCCAGCGTGAACAATGAGACCR1CTGCACTGGAAGATGGCGGGGCTGCCCTTCCAGCCCTGGGGCAGCACGTTGTACTGGTACCGGATGCCGGGGGTCTCATTGTTCACGCTGF2CCAGGACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACCGTGCTGGACGTGGGCGACGCR2CAGATCGTCCATGTACTGGTAGATCACGATGTCGGGGTTCTGCTTCCGGAAGGGCTCCAGGATCTTGGTCATGCTGCACTGGAAGATGGCF3CATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAACAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGAR3TTCAGGAGGTGCTCCCGCAGTTCCTCGATCTTGGTCCGGTGCTGGCCGATCTCCAGGTCGCTGCCCACGTACAGATCGTCCATGTACTGGF4GACCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACAACACCCCCATCTTCGCCATCCG
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第一輪PCR的目的是合成該基因中間的一段DNA序列，所以設計合成一對引物F1和R1，F(xiàn)1為正向引物，R1為反向引物，F(xiàn)1與所要合成的基因的中間部分的有義鏈序列一致，R1與所要合成的基因的中間部分的反義鏈序列一致，且它們的3’端互補(見引物序列的下劃線處)，因此，第一輪PCR不需要加入模板，只需要加入Taq酶緩沖液、4種dNTP、引物F1、引物R1、Taq酶，補加水至一定體積，按照PCR的“加溫變性-退火-延伸”的程序進行多次循環(huán)。
第二輪PCR以第一輪PCR產物為模板，引物為F2和R2，F(xiàn)2將使擴增產物向5’端延長，R2將使擴增產物向3’端延長，該輪PCR產物為F2與R2之間的區(qū)段。
第三輪PCR以第二輪PCR產物為模板，引物為F3和R3，其余操作過程與第二輪PCR相同。以后與此類同，經(jīng)過29輪PCR可合成GPCINS基因。
2.3抗原修飾的結果合成的全新gagpol(GPCINS)基因序列如SEQ ID NO5。
我們對gagpol修飾前后的核苷酸序列進行了比較，為了增加gagpol抗原的表達水平，修飾前后核苷酸序列變化較大，但核苷酸長度沒有變化，為4280bp。合成后我們用FseI限制性內切酶切去了整合酶3’端531個堿基對，新的gagpol核苷酸長度為3730bp，從1至3730個堿基對中修飾后堿基變化個數(shù)為994，突變率為26.6％?；蛐揎椙昂驡ag氨基酸序列與野生型完全一致。
我們對pol基因中的protease蛋白酶活性中心進行了失活突變(Pol第336位天門冬氨酸突變?yōu)榻M氨酸)，目的是使protease失去活性，從而也消除了逆轉錄酶保持活性的可能性。另外，由于我們用FseI限制性內切酶切去了整合酶3’端531個堿基對，從而使整合酶完全失去活性，同時，由于修飾后整合酶基因所表達的蛋白與HIV-1病毒整合酶基因所表達的蛋白有較大的區(qū)別，這一點也可以用來區(qū)分該疫苗在人體內引起的免疫反應與HIV-1病毒感染引起的免疫反應的不同。
實施例2、重組痘苗M-GPE的構建1、構建過程用于構建重組痘苗所用的gagpol基因為實施例1中修飾過的gagpol基因，構建重組痘苗所用的env基因為野生型env基因，修飾的痘病毒Ankara株(Modified Vaccinia VirusAnkara，MVA)為人體內復制缺陷型痘病毒。
上述HIV-1中國流行株(區(qū)域性)的gagpol和env基因被克隆到中間質粒pSC11中，構成pSC11-GPE。如圖1所示pSC11-GPE質粒中，位于同源臂TK-R和TK-L中，分別有兩個閱讀框架啟動子P11引導的Lac Z基因和啟動子P7.5引導的HIV-1-GagPol和Env。
重組穿梭質粒pSC11-GPE全序列如SEQ ID NO1在構建M-GPE時，首先以滴度0.05pfu/cell的MVA感染CEF細胞。感染2小時后，利用Lipofection2000(INVITROGEN產品)的方法將pSC11-GPE轉化到感染了MVA細胞的CEF細胞中。MVA在CEF細胞內復制的過程中，由于pSC11-GPE具有與MVA的TK基因同源的TK-R和TK-L，所以有一定比例的MVA病毒基因組與pSC11-GPE發(fā)生重組，結果HIV-1-Gag-Pol-Env和Lac Z閱讀框架被重組到MVA病毒基因組中。形成如圖2所示的M-GPE重組病毒。
以上被感染細胞培養(yǎng)三天后，收集細胞，裂解細胞，離心除細胞殘渣，超聲波處理，離心保留上清。取一定量上清，作為種毒，在96孔板中對病毒以有限稀釋法進行克隆。培養(yǎng)三天后，將培養(yǎng)液換成含X-gal的不含酚紅的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時后，顯微鏡下觀察Lac Z染色情況。挑取稀釋度高，Lac Z染色好的克隆進行下一代克隆。如此進行6次以上克隆。最后直至得到只含重組病毒M-GPE的克隆株。
該重組疫苗所編碼的抗原蛋白的氨基酸序列如下Gag氨基酸序列如SEQ ID NO2Pol氨基酸序列如SEQ ID NO3Env氨基酸序列如SEQ ID NO4
我們比較測定序列與理論序列，沒有發(fā)現(xiàn)任何突變或插入基因，表達框架正確，沒有出現(xiàn)錯位。
2、重組痘苗在哺乳動物細胞中抗原表達2.1、試驗材料和儀器抗原在哺乳動物細胞中表達6孔板、CO2培養(yǎng)箱、HEK293細胞；丙烯酰胺和N，N`-亞甲雙丙烯酰胺(購于Sigma公司)；底物顯色液(購于Sigma公司)；細胞裂解液DTT 0.617g，SDS 0.8g，1M Tris-HCl pH6.8 3.2ml，甘油4ml，bromphenol0.08g，H2O 12.8ml；(化學試劑均購于Sigma公司)Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸(電泳級)(pH8.3)，0.1％SDS；(化學試劑均購于Sigma公司)轉移緩沖液39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris堿，0.037％SDS(電泳級)，20％甲醇；(化學試劑均購于Sigma公司)5％脫脂奶粉溶液10g脫脂奶粉，200ml 1×PBST；(化學試劑均購于Sigma公司)HIV-1人陽性抗血清廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心提供；抗HIV-1 P24蛋白單克隆抗體(美國NIH試劑中心提供)；抗Env羊抗血清美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)試劑中心提供抗體稀釋液100-150μl HIV-1人陽性抗血清(或抗Env羊抗血清、抗HIV-1 P24蛋白單克隆抗體)加入到10-15ml 3％脫脂奶粉溶液中；PBS-T含0.05％ TWEEN 20的PBS(TWEEN 20購于Sigma公司)；二抗液堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗人IgG抗體、堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗鼠IgG抗體和堿性磷酸酶偶聯(lián)兔抗羊IgG抗體購于Jackson ImmunoResearch Laboratories，INC。
2.2、試驗方法和步驟2.2.1重組痘苗(M-GPE)感染HEK293細胞株①于6孔板內每孔加入1.0×106個細胞，1.5ml培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24小時。
②棄去培養(yǎng)液，加入1ml2.5％血清的培養(yǎng)基，各孔內以M-GPE感染培養(yǎng)的細胞，M-GPE用量為5-10pfu/細胞，留一孔不加M-GPE做對照。輕晃混勻，37℃培養(yǎng)1小時。
③補加1ml10％血清的培養(yǎng)基，混勻。
④置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-24小時。
2.2.2細胞裂解①棄去培養(yǎng)液，每孔以2ml PBS洗細胞。
②每孔加入1ml PBS，以細胞刮將細胞刮下轉移至具塞小離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清。
③向離心管中加入細胞裂解液100μl，搖勻，100℃煮沸10分鐘，11800轉/分鐘，離心20分鐘，取上清于另一離心管中。
2.2.3電泳①膠板的配制10％聚丙烯酰胺分離膠10ml30％丙烯酰胺溶液3.3ml，1.5mol/L Tris(pH8.8)2.5ml，10％SDS 0.1ml，10％過硫酸銨0.1ml，TEMED 0.004ml；5％濃縮膠溶液5ml30％丙烯酰胺溶液0.83ml，1.0mol/L Tris(pH6.8)0.63ml，10％SDS 0.05ml，10％過硫酸銨0.05ml，TEMED0.005ml。
迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加1cm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層異丙醇(當丙烯酰胺濃度＞10％時)。將凝膠垂直放置于室溫下。
分離膠聚合完全后(30分鐘)，傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺。盡可能排去凝膠上的液體，再用紙巾的邊緣吸凈殘留液體。
在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的Telfon梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。
濃縮膠聚合完全后(30分鐘)，小心移出Telfon梳子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用注射器上的注射針頭把濃縮膠上加樣槽之間的齒弄直。把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。
②每孔加入樣品或對照品15μl，將電泳裝置與電源相接(正極應接下槽)。凝膠上所加電壓為200V。當電泳直至溴酚藍到達分離膠底部(約需40分鐘)，然后關閉電源。
③從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔(第一槽)凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。
2.2.4免疫印跡①切6張Whatman 3MM濾紙和1張硝酸纖維素膜(Millipo HAWP或相應的濾膜)，其大小都應與凝膠大小完全吻合；以轉移緩沖液浸泡硝酸纖維素膜、濾紙。用軟鉛筆在濾膜一角作好標記。將凝膠于去離子水中略漂洗一下。
②安裝轉移裝置采用simi-dry(Biorad產品)方法把電泳膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。安裝方法由底層依次安裝底部電極(陽極)、3層濾紙、一張硝酸纖維素膜、凝膠、3層濾紙、頂部電極(陰極)。凝膠左下角置于硝酸纖維素膜標記處。排除所有氣泡。
③連接電源，15V轉移30分鐘，斷開電源。
④卸下裝置，取出硝酸纖維素膜，放入5％脫脂奶粉溶液中，室溫搖床搖1小時。
⑤棄去脫脂奶粉溶液，以1×PBST 15ml，室溫搖床洗膜15分鐘。
⑥分別加入稀釋的人HIV-1陽性血清(抗Env羊抗血清、抗HIV-1 P24蛋白單克隆抗體)10-15ml，室溫搖床振蕩1小時，棄去陽性血清，硝酸纖維素膜以雙蒸水沖洗兩次。
⑦以1×PBST 15ml，室溫洗膜三次，每次5分鐘。
⑧棄去PBST，加入二抗液10μl，1×PBST 20ml，室溫搖床振蕩45分鐘。
⑨取出膜，棄去液體；以1×PBST洗膜，棄去洗液；再以1×PBST洗膜，搖床振搖10分鐘。
顯色棄去液體，加入底物顯色液20ml。
終止反應顯色清晰后棄去顯色液，加水適量，振搖，棄去水，將硝酸纖維素膜取出，晾干。
2.3.1修飾和未修飾的gagpol基因在MVA中表達的區(qū)別修飾的和非修飾的gagpol基因被同時重組到MVA載體中。利用相同的病毒濃度感染HEK293細胞。用以比較修飾和未修飾的gagpol基因在MVA中表達的區(qū)別。結果如圖3所示修飾的gagpol基因在表達水平上遠遠高于未修飾的gagpol基因。所以在以后的研究中，我們始終采用修飾的gagpol基因。
實施例3 M-GPE的抗原性研究試驗材料和儀器、試驗方法和步驟同實施例2中2重組痘苗在哺乳動物細胞中抗原表達。
結果為檢測M-GPE的抗原性是否與中國的流行(區(qū)域性)毒株的抗原性一致，我們用M-GPE感染HEK293細胞來表達HIV-1抗原，并且采用免疫印跡的方法確認上述表達的抗原是否被中國的流行(來源于廣西壯族自治區(qū)HIV-1高發(fā)區(qū))毒株抗血清在免疫印跡試驗中所識別。同時用HIV-1中國流行株(來源于廣西壯族自治區(qū)HIV-1高發(fā)區(qū))病毒抗原作為陽性對照。試驗結果如圖4所示。
M-GPE所表達蛋白能夠被中國流行(區(qū)域性)的抗血清所識別并與對應的標準病毒抗原性一致。
實施例4 藥用組合物M-GPE與生理鹽水的滴度體積比為109pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。
實施例5 藥用組合物M-GPE與生理鹽水的滴度體積比為108pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。
序列表重組穿梭質粒pSC11-GPE全序列SEQ ID NO1TTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTTGCGATCAATAAATGGATCACAACCAGTATCTCTTAACGATGTTCTTCGCAGATGATGATTCATTTTTTAAGTATTTGGCTAGTCAAGATGATGAAATCTTCATTATCTGATATATTGCAAATCACTCAATATCTAGACTTTCTGTTATTATTATTGATCCAATCAAAAAATAAATTAGAAGCCGTGGGTCATTGTTATGAATCTCTTTCAGAGGAATACAGACAATTGACAAAATTCACAGACTTTCAAGATTTTAAAAAACTGTTTAACAAGGTCCCTATTGTTACAGATGGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGATATTTGTTCGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATTCAAAAAAGAATCCTCTCTAGCTACCACCGCAATAGATCCTGTTAGATACATAGATCCTCGTCGCAATATCGCATTTTCTAACGTGATGGATATATTAAAGTCGAATAAAGTGAACAATAATTAATTCTTTATTGTCATCATGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAA
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權利要求
1.一種含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，所述轉錄單位編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白序列，該人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白序列是具有免疫原性的人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中轉錄單位指導抗原的合成。
2.如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，采用的痘病毒是經(jīng)過修飾的痘病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankara，MVA)。
3.如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，所含有的轉錄單位編碼的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重組型的結構蛋白。
4.如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，其轉錄單位所編碼的結構蛋白包括人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、編碼酶類蛋白的Pol和外膜蛋白Env，其各氨基酸序列分別如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4所述。
5.如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒是非復制型的。
6.如權利要求5所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，可作為一種用于預防艾滋病的非復制型重組痘病毒載體疫苗，它包含了可編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白的核苷酸序列。
7.如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，包含一個β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表達報告基因LacZ，含有兩個啟動子，分別是引導Lac Z基因的啟動子P11和引導人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白基因HIV-1-GagPol和Env的P7.5，包含兩個閱讀框架，可以同時表達β-半乳糖苷酶表達報告基因Lac Z和人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白HIV-1-GagPol及Env。
8.如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒，由穿梭質粒PSC11-GPE與經(jīng)過修飾的痘病毒安卡拉株重組而成，穿梭質粒PSC11-GPE包含了編碼人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)結構蛋白的核苷酸序列，穿梭質粒PSC11-GPE的核苷酸序列如SEQID NO1所述，其中編碼GagPol的核苷酸序列來源于經(jīng)過修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的GagPol的核苷酸序列，而編碼Env蛋白的核苷酸序列則來源于未經(jīng)修飾的野生型人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env的核苷酸序列。
9.一種藥用組合物，其中含有如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組的痘病毒和一種可藥用的載體。
10.一種抗原，其由如權利要求1所述的含有轉錄單位的經(jīng)過重組痘病毒表達產生，該表達產生的是人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的蛋白Gag、Pol和Env。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預防艾滋病的重組痘病毒疫苗，屬于一種新的疫苗，尤其是，所述疫苗為含有編碼人類免疫缺陷病毒－1(HIV－1)結構蛋白的經(jīng)過人工修飾的Gag、Pol和野生的Env核苷酸序列的重組痘病毒。這些疫苗在體內施用時用作病毒蛋白抗原生物合成的轉錄單位。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)表達水平高；(2)感染多種細胞，使抗原有效地提呈到不同的組織；(3)安全性好；(4)疫苗靶抗原包括了幾乎所有的HIV－1結構蛋白，如GagPol和Env，更好的誘導人體產生對HIV有效的免疫保護。
文檔編號A61K39/12GK1631440SQ200410011249
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權日2004年11月24日
發(fā)明者孔維, 于曉方, 田春娟, 于湘輝 申請人:長春百克藥業(yè)有限責任公司