專利名稱：一種治療牛種布魯氏菌病的重組牛痘病毒疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基因工程疫苗，尤其是一種治療牛種布魯氏菌病的重組牛痘病毒疫苗及其制備方法。
背景技術：
布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病，廣泛分布于世界各地。據報道， 有170多個國家和地區(qū)有布魯氏菌病的疫情。在畜牧業(yè)，有牛布魯氏菌病、羊布魯氏菌病、 豬布魯氏菌病等，其中牛的布魯氏菌病最為嚴重。在海洋哺乳動物體內也分離出該細菌。 歷史上該病在我國曾是危害極為嚴重的人畜共患病。近年來我國布魯氏菌感染率更是呈現(xiàn)上升趨勢，這為布魯氏菌病防治提出了新的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的畜用疫苗有減毒活疫苗和滅活疫苗。傳統(tǒng)的減毒活疫苗仍存在一些缺點，對人仍是致病菌；并且可引起懷孕動物的流產；成年動物接種后干擾血清學診斷，使感染與免疫難于鑒別。隨著分子生物學、分子免疫學發(fā)展與應用，基因工程疫苗已經成為人們研究的熱點，但目前尚未有關于重組牛痘病毒疫苗用于防治布魯氏菌病的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療牛種布魯氏菌病的重組牛痘病毒疫苗。本發(fā)明還提供了該重組牛痘病毒疫苗的制備方法為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案
一種治療牛種布魯氏菌病的重組牛痘病毒疫苗，其將牛種布魯氏菌主要外周漿蛋白 bp26重組于牛痘病毒，構建重組牛痘病毒。上述重組牛痘病毒疫苗的制備方法，其包括如下步驟
①以牛種布魯氏菌基因組為模板，PCR擴增牛種布魯氏菌基因；
②將目的基因克隆至牛痘病毒載體中，構建重組牛痘病毒穿梭質粒；
③利用脂質體將重組牛痘病毒穿梭質粒轉染至已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21細胞，篩選得到牛種布魯氏菌重組牛痘病毒(最終篩選純化得到的重組牛痘病毒應至少占總病毒的80%)。所述的重組即牛種布魯氏菌外周漿蛋白bp^基因整合至牛痘疫苗株病毒。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于將牛種布魯氏菌基因組中高度保守且免疫原性較好的重要外周漿蛋白的編碼基因bp^重組于牛痘病毒構建重組牛痘病毒。所用牛種布魯氏菌可以為現(xiàn)有菌株，如野生菌(包括標準株和野毒株)、疫苗株。本發(fā)明所用牛種布魯氏菌S19購自中國疾病預防控制中心。所述編碼基因bp^5，又名CP^ 或0MP28，是一種具有強免疫原性的外周漿蛋白，是一種可以由細胞內向外釋放的可溶性蛋白。有報道顯示，在牛、綿羊、山羊和人類的布魯桿菌感染中均可以檢測到原的存在。所述外周漿蛋白可以在NCBI中查到，登陸號為U45996，bp^基因全長75!3bp，其可以通過利用生物軟件設計引物，以牛種布魯氏菌基因組為模板，進行PCR擴增得到。然后將擴增得到的因定向插入牛痘病毒載體，用脂質體轉染法與牛痘弱毒株病毒共轉染 BHK-21細胞，最終篩選得到重組牛痘病毒。和現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過對布魯氏菌基因組中功能基因的篩選，將具有良好免疫原性的牛種布魯氏菌基因重組于牛痘病毒，可刺激機體產生抵抗各種血清型的布魯氏菌病的感染，從而為我國布魯氏菌病的防治提供了新的方法，對促進全球動物布魯氏菌病的根除與凈化具有十分重要的意義。實驗證明，所述的重組病毒毒力明顯低于野毒株，并且低于市面上的疫苗株，而其免疫保護效力與現(xiàn)有疫苗相當，因此，此重組病毒可用于牛種布魯氏菌疫苗的開發(fā)。該重組疫苗，活性成分上主要是上述牛種布魯氏菌。


圖1為PCR擴增產物bp^的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2為PCR擴增得到的基因片段的測序結果；
圖3為重組牛痘病毒穿梭質粒的構建流程圖； 圖4為重組牛痘病毒穿梭質粒的PCR鑒定結果； 圖5為牛種布魯氏菌重組牛痘病毒的PCR鑒定結果。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例所用LB液體培養(yǎng)基組成為1% 胰蛋白胨、1%氯化鈉和0. 5%酵母提取物；LB固體培養(yǎng)基組成為1%胰蛋白胨、1%氯化鈉、 0. 5%酵母提取物和1. 5%瓊脂。實施例1
一種重組牛痘病毒疫苗的制備方法，其包括如下步驟 (一)PCR擴增bp洸基因
以牛種布魯氏菌S19基因組為模板，以bp261和為引物，PCR擴增牛種布魯氏菌 bp^基因，引物序列如下
Bp261 (上游引物)5，-ATGAACACTCGTGCTAGC-3， Bp262 (下游引物)5，-TTACTTGATTTCAAAAACG-3，
反應體系如下表1 ；反應參數(shù)為96°C預變性^iin ；94°C變性30s，65°C退火30s，72°C 延伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，置于冰箱4°C保存。
權利要求
1.一種治療牛種布魯氏菌病的重組牛痘病毒疫苗，其特征在于，將牛種布魯氏菌外周漿蛋白bp^重組于牛痘病毒，構建重組牛痘病毒。
2.權利要求1所述重組牛痘病毒疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟①以牛種布魯氏菌基因組為模板，PCR擴增牛種布魯氏菌基因；②將目的基因克隆至牛痘病毒載體中，構建重組牛痘病毒穿梭質粒；③利用脂質體將重組牛痘病毒穿梭質粒轉染至已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21細胞，篩選得到牛種布魯氏菌重組牛痘病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療牛種布魯氏菌病的重組牛痘病毒疫苗，其將牛種布魯氏菌外周漿蛋白bp26重組于牛痘病毒，構建重組牛痘病毒。具體方法如下先以牛種布魯氏菌基因組為模板，PCR擴增牛種布魯氏菌bp26基因；然后將目的基因bp26克隆至牛痘病毒載體中，構建重組牛痘病毒穿梭質粒；最后利用脂質體將重組牛痘病毒穿梭質粒轉染至已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21細胞，篩選得到牛種布魯氏菌重組牛痘病毒。本發(fā)明將具有良好免疫原性的牛種布魯氏菌bp26基因重組于牛痘病毒，可刺激機體產生抵抗各種血清型的布魯氏菌病的感染，重組病毒的毒力明顯低于野毒株，為我國布魯氏菌病的防治提供了新方法。
文檔編號A61P31/04GK102258775SQ20111020317
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權日2011年7月20日
發(fā)明者張海濤, 張遂平, 李明魁, 李貞 , 趙全成, 辛瑞祥, 郭芳茹, 閆樹森 申請人:河南亞衛(wèi)動物藥業(yè)有限公司