專(zhuān)利名稱(chēng)：：熒光定量pcr檢測(cè)新型甲型h1n1病毒試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種對(duì)流行的曱型H1N1流感病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)引物和特異性探針。
背景技術(shù)：
：自09年4月以來(lái)，包括墨西哥、美國(guó)和加拿大在內(nèi)的許多國(guó)家發(fā)生了人感染曱型H1N1流感病毒疫情，這是一種新的曱型流感病毒。隨著感染曱型H1N1流感的人群不斷的增加，疫情愈來(lái)愈嚴(yán)重，WHO已于6月11日將流感大流行警戒級(jí)別提升到6級(jí)，世界處在09年流感大流行的開(kāi)端。曱型H1N1流感病毒屬正黏液病毒科曱型流感病毒屬的單月殳RNA病毒。根據(jù)其外部糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA步神經(jīng)氨酸酶(nneuraminidase,NA)的不同抗原特性可將曱型流感病毒分為多個(gè)亞型。HA和NA具有高度變異性，但對(duì)于該流感病毒其它片段相比又極其保守。因此，HA、NA基因片段成為檢測(cè)流感病毒的重要考察對(duì)象。面對(duì)這突如其來(lái)的流感病毒，如何快速準(zhǔn)確的檢測(cè)已成為世界各國(guó)疾病預(yù)防控制中心最關(guān)心的問(wèn)題。實(shí)時(shí)焚光定量法顯然已經(jīng)成為各國(guó)公認(rèn)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時(shí)萸光定量RT-PCR(rRT-PCR)法檢測(cè)新型曱型H1N1的方案是用一組寡核苷酸引物和雙重標(biāo)記的TaqMan(^果針，對(duì)呼吸道樣本或體外培養(yǎng)的曱流感病毒進(jìn)行定量檢測(cè)鑒定。WHO較早公布了用實(shí)時(shí)定量RT-PCR來(lái)檢測(cè)曱流感的操作步驟。其中，InfA引物和探針組是通用于檢測(cè)A型流感病毒，swInfA引物和探針組是特異檢測(cè)所有曱流感A病毒，swHl引物和探針組是特異檢測(cè)豬H1流感病毒。但是，當(dāng)時(shí)NCBI公布的相關(guān)序列有限，WHO所公布的引物和探針對(duì)此次暴發(fā)的曱型H1N1流感病毒的檢測(cè)特異性、靈敏度有限。本發(fā)明就是針對(duì)于目前設(shè)計(jì)并公布的引物及探針存在的靈敏度檢測(cè)相對(duì)較低，檢測(cè)費(fèi)用較高進(jìn)行改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種對(duì)曱型H1N1流感病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明的方法包括利用一對(duì)新的引物和探針對(duì)病毒樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)特異性好，靈敏度高，尤其適用于此次暴發(fā)的甲型H1N1流感，與禽流感、豬流感以及普通季節(jié)性流感無(wú)交叉反應(yīng)。本發(fā)明還在于設(shè)計(jì)且提供一對(duì)新的引物和探針，由此降低檢測(cè)成本，實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確;險(xiǎn)測(cè)H1N1流感病毒。本發(fā)明提供一種獲得檢測(cè)曱型H1N1流感病毒的引物和探針的方法，該方法包括(1)篩選新型曱型H1N1流感HA全長(zhǎng)序列，進(jìn)行同源性比對(duì)，在其保守區(qū)只針對(duì)本次新型曱型流感設(shè)計(jì)引物；(2)才艮據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的核普酸序列設(shè)計(jì)特異性探針，并提交GENEBANK檢測(cè)探針的特異性；(3)對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。在本發(fā)明上述方法中，所篩選的新型曱型H1N1流感可以是NCBI公布的所有新型的甲型H1N1流感HA全長(zhǎng)序列。另外，本發(fā)明的方法中，可以利用DNASTAR軟件進(jìn)行序列的同源性比對(duì)。比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1。圖中陰影部分為HA基因序列高保守區(qū)。在本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)中，首先在比對(duì)的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原理，在保守區(qū)617bp-760bp之間設(shè)計(jì)上游和下游引物。引物和探針在合成時(shí)探針5'端連接FAM熒光基團(tuán)和3'端連接BHQ非熒光基團(tuán)。引物的特異性增強(qiáng)。序列見(jiàn)表l。表l引物和探針序列引物NEWF(5，-3，)CAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAG引物NEWR(5'-3'):TCCCCGGCTCTACTAGTGTCCAGTA引物NEWProbe(5，-3，)GGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAA表2為利用BeaconDesigner7.5軟件分析設(shè)計(jì)的引物和探針的參數(shù)。_表2引物和探針信息_SensePrimer_Anti-sensePrimer_ProbeSequenceSequenceCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGTCCCCGGCTCTACTAGTGTCCAGTAGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAARating72.179.877.3Position617759658Length2525305TmGC%GCClamp3'EnddGSelfDimerdG(Internal)HairpindG(Internal)HairpinBond(Internal)SelfDimerBond(Internal)Run/RepeatLengthCross-DimerdG(Internal)58.45965.4404843.321-4.6-2.3-3.5-4.60-0.7-1.603446322-1.1本發(fā)明提供一種檢測(cè)新型曱流感的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法包括以下步驟(1)核酸提取病毒RNA提取選用QIAampMinikit52卯6病毒RNA提取試劑盒。(2)RT-PCR擴(kuò)增選用的擴(kuò)增試劑盒為ABP^司TaqmanOne-StepRT-PCRMasterMixReagents。反應(yīng)體系組分及其體積見(jiàn)表3。表3組々體積()無(wú)核酸酶水5.53樣本RNA5.00上游引物(40^iM)0.50下游引物(40pM)0.50探針(10(iM)0.50Taqman2xUniversalPCRMasterMix12.5040xMultiScribeTM和Rnase抑制劑Mix0.63總體步25.00擴(kuò)增條件采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件'6例如48°C30分鐘95。CIO分鐘95°C15s，60。C35sj40循環(huán)本發(fā)明所述的方法中，探針與熒光基團(tuán)相連，所述熒光基團(tuán)為FAM，BHQ，其它熒光基團(tuán)也同樣適用，比如，F(xiàn)AM-TAMARA等。所述RT-PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(例如7000,7300，7500,7900等)；BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)4義(例如MX4000,MX3000,MX3005)。圖1為利用DNASTAR軟件分析HA全長(zhǎng)基因同源性區(qū)域。圖2和圖3為YHANEW引物和WHO-SWH1引物靈敏度比較的檢測(cè)結(jié)果。選用HA全長(zhǎng)基因片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品各個(gè)濃度梯度擴(kuò)增后熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)循環(huán)數(shù)變化的曲線(xiàn)。其中，圖2為SWH1引物擴(kuò)增曲線(xiàn)，圖3為YHANEW引物擴(kuò)增曲線(xiàn)，圖中橫坐標(biāo)為循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)代表相應(yīng)的校正后報(bào)告熒光強(qiáng)度(Rn)。圖4表示用本發(fā)明建立的方法對(duì)普通季節(jié)性流感H1N1、豬流感H1N1、禽流感H5N1、H9N2進(jìn)行非特異性檢測(cè)的結(jié)果。其中，X軸表示循環(huán)次數(shù)，Y軸表示相應(yīng)的校正后報(bào)告熒光強(qiáng)度。圖5表示用本發(fā)明建立的方法對(duì)可疑發(fā)熱病人的咽拭子進(jìn)行檢測(cè)。其中，X軸表示循環(huán)次數(shù)，Y軸表示相應(yīng)的校正后報(bào)告熒光強(qiáng)度。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:引物靈^:度檢測(cè)1)選擇已知樣本HA基因全長(zhǎng)做為標(biāo)準(zhǔn)品，將其病毒RNA濃度從10"依次稀釋到10—1();2)陰性對(duì)照無(wú)核酸酶水；3)反應(yīng)體系按照表3進(jìn)行配制。檢測(cè)結(jié)果如圖2、3所示。7圖2中1一6曲線(xiàn)分別為標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋度為10-4—10-1()用引物WH0-SWH1擴(kuò)增的曲線(xiàn)。圖3中1一6曲線(xiàn)依次為標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋度為1(T4—10-1()用《I物YHANEW擴(kuò)增的曲線(xiàn)。我們從圖2和圖3中可以看出，YHANEW引物擴(kuò)增出結(jié)果的曲線(xiàn)出線(xiàn)早于WHO-SWH1引物擴(kuò)增出結(jié)果的曲線(xiàn)。表4SWH1、YHANEW引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果CT值樣本稀釋度-^-SWH1YHANEWio-422.7519.00l(T525.2722.0210-629.2724.93IO-732.2129.1110-835.0032.42IO-937.8434.10io-10—一NTC———表4數(shù)據(jù)表示，本發(fā)明中YHANEW引物和探針與WHO公布的SWHl引物和探針?lè)謩e擴(kuò)增HA^因片段病毒RNA的不同濃度梯度下的擴(kuò)增CT值。CT值反應(yīng)了每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。我們從數(shù)據(jù)中可以看到，引物WHO-SWH1擴(kuò)增10力CT值為37.84,而有效CT值為15^Ct(閾值)￡36，在此我們可以判斷其CT值為"一"。從而，我們得出結(jié)論引物YHANEW相較于WHO-SWHl靈敏度要稍高些。實(shí)施例2:引物非特性檢測(cè)1)對(duì)普通季節(jié)性流感H1N1,豬流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2，進(jìn)行非特異性檢測(cè)；2)陽(yáng)性對(duì)照病毒HA片段RNA;3)陰性對(duì)照無(wú)核酸酶水；4)反應(yīng)體系按照表2進(jìn)行配制。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4及表5。圖4結(jié)果顯示，只有編號(hào)為1的陽(yáng)性對(duì)照HA出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線(xiàn)。其余樣8品曲線(xiàn)均在基線(xiàn)以下，無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。_表5人、禽、豬流感病毒檢測(cè)結(jié)果55^CT值表5數(shù)據(jù)顯示了該引物對(duì)普通季節(jié)性流感H1N1，豬流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2基因擴(kuò)增CT值為"一"。表明該引物對(duì)其病毒RNA無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)施例3:對(duì)病人咽拭子檢測(cè)1)對(duì)采集的可疑病例咽拭子進(jìn)行檢測(cè)，篩選新型曱型H1N1流感病毒；2)陽(yáng)性對(duì)照病毒HA片段RNA;3)陰性對(duì)照無(wú)核酸酶水；4)反應(yīng)體系按照表3進(jìn)行配制。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5及表6。圖5中只出現(xiàn)了一條擴(kuò)增曲線(xiàn)為陽(yáng)性對(duì)照，其余樣本均無(wú)擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)果為陰性。_表6咽拭子檢測(cè)結(jié)果_^Si^表6中的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，檢測(cè)病人咽拭子結(jié)果均為陰性。H9N2豬H1N1人H1N1H5N110-6NTC知知知知知知性性33.0027.18124610-7NTC知知知知性性-、一義二、」、「一、_二、日月結(jié)果分析擴(kuò)增反應(yīng)完成40個(gè)循環(huán)之后，引物靈敏度檢測(cè)到病毒RNA濃度稀釋度為1(T8;與普通季節(jié)性流感H1N1，豬流感H1N1,禽流感H5N1、H9N2無(wú)交叉反應(yīng)；從采集的病人咽拭子檢測(cè)到6抹均為陰性。結(jié)果判斷當(dāng)待檢測(cè)樣本的15^Ct(閾值)$36時(shí)即判為陽(yáng)性。權(quán)利要求1、一種甲型H1N1流感病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法包括使用一對(duì)引物和探針對(duì)病毒樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)，引物和探針序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="152"></tables>2.權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中，所述方法所檢測(cè)的樣本包括人血液、痰、鼻咽、口咽洗液或拭子；支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物。3權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中，所述探針連接的熒光基團(tuán)為FAM國(guó)BHQ，F(xiàn)AM-TA區(qū)RA等。4.權(quán)利要求1所述的4企測(cè)方法，其中，該方法包括步驟1)待檢測(cè)樣本核酸的提??；2)RT-PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的25pLPCR反應(yīng)體系。5.權(quán)利要求4中所述的檢測(cè)方法，其中，所述RT-PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)、BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀。6.一種檢測(cè)新型甲型H1N1病毒試劑盒，其中包括引物或者其他能與新型曱型H1N1流感HA全長(zhǎng)序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增的等同引物，其相似同源性不能超過(guò)10%，引物序列如下:_引物NEWF(5，-3，):_CAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAG_弓I物NE職(5，-3，)GGGGTCGGCTCTACTAGTGTCCAGTA7、一種檢測(cè)新型甲型H1N1病毒試劑盒，其中包括引物及能與H1N1流感HA全長(zhǎng)序列特異性探針，探針序列如下:_NEW探針(5'-3，)GGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAA能與新型甲型H1N1流感HA全長(zhǎng)序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增的等同4冢針,其位點(diǎn)區(qū)域的覆蓋率不能超過(guò)50%,其同源性不能超過(guò)70%。8、一種檢測(cè)新型甲型H1N1病毒試劑盒，其中包括引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>能與新型曱型H1N1流感HA全長(zhǎng)序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增的等同引物,其位點(diǎn)區(qū)域的覆蓋率不能超過(guò)50%,其同源性不能超過(guò)70%。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)新型甲型流感病毒熒光定量PCR試劑盒，由引物和探針、Taqman2×UniversalPCRMasterMix、40×MultiScribe^TMandRNaseInhibitorMix、無(wú)核酸酶水組成，該引物和探針檢測(cè)特異性好，靈敏度高，尤其適用于此次暴發(fā)的甲型H1N1流感，與禽流感、豬流感以及普通季節(jié)性流感無(wú)交叉反應(yīng)，而且成本也大大降低。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101665842SQ200910089668公開(kāi)日2010年3月10日申請(qǐng)日期2009年7月28日優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日發(fā)明者姚李四,孫肖紅,楊鵬飛,燕清麗,靜王,胡孔新申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院