專(zhuān)利名稱(chēng)：人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)試劑盒，具體涉及人類(lèi)偏肺病毒的 熒光定量檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合i^漣式反應(yīng))技術(shù)不僅 實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、 有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。目前在 科學(xué)研究和臨床診斷中廣泛使用。其中Taqman熒光定量技術(shù)的原理為以 Taqman熒光探針為基礎(chǔ)；Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒 光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬 滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5， -3，外切酶活性將探針酶切降解，使熒 光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每 擴(kuò)增一條DM鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物 形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)定量。
Taqman熒光定量技術(shù)的絕對(duì)定量方法，是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線直接測(cè)定未知樣本 目標(biāo)靶基因的量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作為將hMPV F基因克隆后10倍稀釋所進(jìn)行的 循環(huán)數(shù)定為 CT 點(diǎn)Maril Martell， et al. J Clin Microbiol, 1999: 37 (2): 327-332。PCR a相同時(shí)，模板量越高，CT值越低，CT值與模 板量的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，依據(jù)CT值用已知濃度的DM或制作曲線進(jìn)行檢測(cè).
5C代表Cycle, T代表threshold, CT值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到 達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲 線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未 知樣本的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得該樣本的起始拷貝數(shù)。
人類(lèi)偏肺病毒(Human Metapneumovirus, hMPV)為荷蘭學(xué)者于2001年首 次在兒童呼吸道感染標(biāo)本中分離得到的一種新的呼吸道病原體。該病毒可導(dǎo)致 人的上下呼吸道感染，其臨床特征類(lèi)似于RSV (呼吸道合胞病毒)，主要癥狀包 括咳嗽、咽痛、呼吸困難、缺氧、喘息等。自人類(lèi)偏肺病毒發(fā)現(xiàn)以來(lái)，亞洲、 北美洲、歐洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染的流行病學(xué)報(bào)告，呈現(xiàn)全球 流行趨勢(shì).在中國(guó)重慶和北京也有關(guān)于hMPV感染的報(bào)道。血清學(xué)研究表明hMPV 已經(jīng)在A^流行50年以上，大多數(shù)人在5歲時(shí)均已感染過(guò)hMPV。 4~10.8%的 呼吸道感染住院患兒同hMPV有關(guān)。hMPV還是引起老人和免疫缺陷患者嚴(yán)重呼吸 道感染疾病的常見(jiàn)病原體，并可同其他一些病原體合并感染，如RSV，SARS-CoV (嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒)。由此可見(jiàn)，hMPV是一種常見(jiàn)的呼吸道病原體， 建立準(zhǔn)確的檢測(cè)手段對(duì)于其早期診斷和治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，它能用于 感染人類(lèi)偏肺病毒的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確，而且重復(fù)性好、通用性好、 經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
本發(fā)明所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括分 別包裝的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)、陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)、熒光定量 反應(yīng)液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f )和熒光探針(g)。
6所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其還包括分別包裝的MA提 取試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑，用于待測(cè)樣本的前期處理。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性才莫板(a) 是含有插入人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核苷酸特異序列的pMD18-T載體質(zhì)粒， 濃度為lxl(T拷貝/pl，容積為125pl至500 Ml，保存條件為 20。C;
插入的人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核普酸，其序列為
atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60 gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120
acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180
actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240
ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300
tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360 ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420
ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480
gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac 540
aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600
ctaaatgttg tgcggcagtt Ucagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660
ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggaeag 720
ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780
gggg^ctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840 acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaa"atgct 900
tgcetectaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960
ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020
atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080
tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140
ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200
aaaca狄tac ctaaaggctg ctcataeata actaaccagg aegcagacac tgtaacaatt 1260
gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320 ccagtttcaa gcagtttcga tceaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tg付gcgctt 1380
gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440
ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500 cttgggtt幼ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aagg肌aecc 1560 acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所迷的陰性參控品(b)是 從未感染人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林的Vero-E6細(xì)胞抹(非洲綠猴腎細(xì)胞林)提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNAcDNA(complementary DNA)是指在體外經(jīng)反:轉(zhuǎn)錄 合成的、與RNA (通常指mRNA)互補(bǔ)的單鏈DNA，容積為100 y 1至400 n 1 ，
保存條件為-2(TC。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的陽(yáng)性參控品(c)是 人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林感染Vero-E6細(xì)胞抹后，提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA,容積為lOOja 1至400 p 1，保存條件為-20。C。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的熒光定量反應(yīng)液(d ) 是Premix Ex Taq"試劑(購(gòu)自日本TaKaRa ^>司)，容積為625 |j 1至2500 n 1， 保存條件為-20匸。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的PCR上游引物(e) 是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；上游引物的濃度為10yM、容積為25nl 至100nl;保存條件為-20TC;
PCR上游引物序列為5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的焚光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的PCR下游引物(f) 是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；下游引物的濃度為10nM、容積為25pl 至100nl;保存條件為-20lC;
PCR下游引物序列為5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3'。
所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的熒光探針(g)是根 據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；
萸光探針序列為5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
熒光探針的5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基因是FAM, 3，端標(biāo)記的熒光受體基因?yàn)?Eclipse淬滅基團(tuán)；熒光探針的容積為50 u 1至200 n 1;保存條件為-20".所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其所述的RNA提取試劑(h) 是QIAa即Viral RM Mini KitRM提取試劑(購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司)，保存條 件為室溫；所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑(i)是PrimeScript"RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試 劑(購(gòu)自日本TaKaRa公司)，保存條件為-20"C。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)定量準(zhǔn)確，可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)病毒核酸；靈敏度及 特異性高；檢測(cè)速度快，僅需1小時(shí)，加上核酸的提取和逆轉(zhuǎn)錄，共僅需3-4 小時(shí)；步驟簡(jiǎn)單；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)。本發(fā)明適用于人類(lèi)偏肺病毒 的臨床或?qū)嶒?yàn)室定量及定性檢測(cè)，人類(lèi)偏肺病毒感染的早期診斷，監(jiān)視和預(yù)測(cè) 人類(lèi)偏肺病毒流行性，以及對(duì)療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估。


圖1是CT值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一本發(fā)明所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，包括分別 包裝的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性才莫板(a)、陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)、熒光定量反 應(yīng)液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f )和熒光探針(g);
本例的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)是含有插入人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核苷酸 特異序列的pMD18-T栽體質(zhì)粒，濃度為lxlO"拷貝/jil，容積為1"jlH;將人 類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)堿基克隆到該載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后， 用堿列解法(具體實(shí)驗(yàn)?zāi)渭头椒ㄒ?jiàn)J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992, 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版)提取質(zhì)粒DNA,再用DNA純化試劑盒(購(gòu)自Clonetec 公司)純化，然后，用分光光度計(jì)Am。定量并稀幹至lxlO"拷貝/p1,,條 件為-20'C; pMD18-T載體購(gòu)自日本TaKaRa公司，由該公司經(jīng)pUC18載體改建而成，是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專(zhuān)用栽體，具有同pUC18載體完全相同的功 能，且能大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。
本例的陰性參控品(b)是從未感染人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林的Vero-E6細(xì)胞抹 (非洲綠猴腎細(xì)胞林?jǐn)∪〔《綬NA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA!cDNA (complementary DNA)是指在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA (通常指fliRM)互補(bǔ)的單鏈DM，容 積為100p 1,保存條件為-20'C。
本例的陽(yáng)性參控品(c)是人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)抹感染Vero-E6細(xì)胞林后，提 取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,容積為100Ml，保存條件為-20X:。
本例的熒光定量反應(yīng)液(d)是Premix Ex Taq"試劑(購(gòu)自日本TaKaRa公 司)，容積為625jul，保存條件為-20。C。
本例的PCR上游引物(e)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；上游引物的 濃度為10uM、容積為25pl;保存條件為-20X:;
PCR上游引物序列為5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
本例的PCR下游引物(f )是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；下游引物的 濃度為10yM、容積為25ul;保存務(wù)fr為-20TC;
PCR下游引物序列為5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，，
本例的熒光探針(g)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；
熒光探針序列為5'-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
熒光探針的5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基因是FAM, 3，端標(biāo)記的熒光受體基因?yàn)?Eclipse淬滅基團(tuán)；熒光探針的容積為50 p 1;保存條件為-20"C。
實(shí)施例二本發(fā)明所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，包括分別
10包裝的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)、陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)、熒光定量反 應(yīng)液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f)和熒光探針(g);還包括分
本例的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a )是含有插入人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核苷酸 特異序列的pMD18-T載體質(zhì)粒，濃度為1 x 10"拷貝/ja 1，容積為500jul;將人 類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)堿基克隆到該栽體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后， 用堿列解法提取質(zhì)粒DNA，再用DNA純化試劑盒(購(gòu)自Clonetec公司)純化， 然后，用分光光度計(jì)A26。定量并稀釋至lxlO"拷貝/Ml，保存條件為-20'C。
本例的陰性參控品(b )是從未感染人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林的Vero-E6細(xì)胞抹 (非洲綠猴腎細(xì)胞林)提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,容積為400jLt 1，保 存條件為-2(TC。
本例的陽(yáng)性參控品(c )是人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林感染Vero-E6細(xì)胞林后，提 取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，容積為400^1,保存條件為-20t:。
本例的熒光定量反應(yīng)液(d)是Premix Ex Taq"試劑(購(gòu)自日本TaKaRa公 司)，容積為2500ji1,保存條件為-20t:。
本例的PCR上游引物(e)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；上游引物的 濃度為10iiM、容積為100ul; *務(wù)降為-201C;
PCR上游引物序列為5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
本例的PCR下游引物(f )是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；下游引物的 濃度為10pM、容積為至100pl; M務(wù)降為-20t:;
PCR下游引物序列為5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，。
本例的熒光探針(g)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；熒光探針序列為5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
熒光探針的5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基因是FAM， 3，端標(biāo)記的熒光受體基因?yàn)?Eclipse淬滅基團(tuán)；熒光探針的容積為200 y 1;保存條件為-2(TC。
本例的RNA提取試劑盒是QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(購(gòu)自德國(guó) QIAGEN公司)，保存條件為室溫。
本例的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒是PrimeScript"RT Reagent Kit試劑盒(購(gòu)自日本 TaKaRa公司)，保存條件為-20t:。
實(shí)施例三本發(fā)明所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，包括分別 包裝的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)、陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)、焚光定量反 應(yīng)液(d)、 PCR上游引物(e)、 PCR下游引物(f )和熒光探針(g);還包括分 別包裝的用于待測(cè)樣本的前期處理的RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑。
本例的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)是含有插入人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核苦酸 特異序列的pMD18-T栽體質(zhì)粒，濃度為lxlO'。拷貝/Ml，容積為250pl;將人 類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)堿基克隆到該載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后， 用堿列解法提取質(zhì)粒DNA，再用DM純化試劑盒(購(gòu)自Clonetec公司)純化， 然后，用分光光度計(jì)AM。定量并稀釋至lxlO"拷貝/y 1,保存條件為-20"。
本例的陰性參控品(b )是從未感染人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林的Vero-E6細(xì)胞抹 (非洲綠猴腎細(xì)胞林)提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,容積為200 n 1,保 存條件為-201C。
本例的陽(yáng)性參控品(c)是人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)林感染Vero-B6細(xì)胞抹后，提 取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDM，容積為200Ml，保存條件為-2010。本例的熒光定量反應(yīng)液(d)是Premix Ex TaqT""試劑(購(gòu)自日本TaKaRa公 司)，容積為1250]ul，保存條件為-201C。
本例的PCR上游引物(e)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；上游引物的 濃度為10pM、容積為50pl;保存條件為-20匸；
PCR上游引物序列為5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3，。
本例的PCR下游引物(f )是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；下游引物的 濃度為10pM、容積為至50pl;保存條件為-20'C;
PCR下游引物序列為5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，。
本例的熒光探針(g)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；
熒光探針序列為5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，
熒光探針的5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基因是FAM， 3，端標(biāo)記的熒光受體基因?yàn)?Eclipse淬滅基團(tuán)；熒光探針的容積為100p 1;保存條件為-20"C,
本例的RNA提取試劑盒是QIAamp Viral RM Mini Kit試劑盒(購(gòu)自德國(guó) QIAGEN公司)，保存條件為室溫。
本例的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒APrimeScript RT Reagent Kit試劑盒(購(gòu)自日本 TaKaRa公司)，保存條件為-20'C。
實(shí)施例四應(yīng)用人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床呼吸道標(biāo)本 (也可用鼻咽分泌物標(biāo)本、或痰標(biāo)本)，使用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)包括以下步驟
第一步，使用RM提取試劑(h),提取待測(cè)樣本的RNA，保存于-80"備用； 待測(cè)樣本是人呼吸道標(biāo)本；
第二步，將第一步獲得的待測(cè)樣本的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑(i)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20t:保存?zhèn)溆茫?br> 第三步，用蒸餾水溶解標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版(a ),并將其系列稀釋為1 x 10'拷貝/ yl、 lxl()8拷貝/jul、 lxlO'拷貝/nl、 lxl()6拷貝/yl、 lxi()5拷貝/Ml、 1 xl(T拷貝/Ml、 lxl()3拷貝/iil、 lxl()2拷貝/pl、 lxl(^拷貝/pl，共9管 系列稀釋品，于-2(TC保存?zhèn)溆茫?br> 第四步，PCR擴(kuò)增，取熒光定量反應(yīng)液(d) 12. 1、取PCR上游引物(e) 0. 5nl、取PCR下游引物(f) 0. 5jil、取熒光探針(g) ljil、取蒸餾水8.5 pl和模板2jil，共25ji 1組成多個(gè)PCR反應(yīng)體系；
所述的模板為第二步獲得的cDNA、第三步獲得的系列稀釋品、陰性參控品 (b)、或者為陽(yáng)性##品(c);
PCR擴(kuò)增時(shí)，各反應(yīng)體系中，至少需要包含5個(gè)第三步獲得的系列稀釋品、 陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)和至少1個(gè)第二步獲得的待測(cè)樣本的cDM; 其中系列稀釋品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，陰性參控品作為PCR反應(yīng)的陰性對(duì)照，陽(yáng) 性參控品作為PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，以檢測(cè)PCR反應(yīng)系統(tǒng)是否正常；
第五步，使用熒光定量檢測(cè)儀對(duì)第四步獲得的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)檢測(cè)， 設(shè)置PCR的反應(yīng)條件為先951C變性10秒;再95C、 10秒—60匸、30秒—95 。C、 10秒—60匸、30秒…設(shè)置40個(gè)循環(huán)；目的是檢測(cè)循環(huán)的CT值(即每個(gè) 反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))；
第六步，通過(guò)比較待測(cè)樣本和系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè) 樣本的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量(見(jiàn)附圖1),該步驟由美國(guó)BIO-RAD公司的CFX-96 熒光定量PCR檢測(cè)儀自動(dòng)完成，定量結(jié)果由該檢測(cè)儀自動(dòng)計(jì)算得出；
第七步，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)正常的情況下，即PCR反應(yīng)結(jié)束后熒光定量檢測(cè)儀
14在陰性#品管中未檢測(cè)到熒光信號(hào)，而在陽(yáng)性參控品管中檢測(cè)到> 500個(gè)拷貝 的人類(lèi)偏肺病毒，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣本的人類(lèi)偏肺病毒拷貝數(shù)，拷 貝數(shù)》500的判定為人類(lèi)偏肺病毒感染，其余為陰性。
每個(gè)呼吸道樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以保證實(shí)驗(yàn)的精確性和穩(wěn)定性；
實(shí)施例五應(yīng)用人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)體外感染實(shí)驗(yàn)的 細(xì)胞(也可用上清液標(biāo)本)，使用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)包括以下步驟
第一步，使用RNA提取試劑(h),提取待測(cè)樣本的RM，保存于-80'C備用； 待測(cè)樣本是體外感染實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞；
第二步，將第一步獲得的待測(cè)樣本的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑(i)逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，于-20XM呆存?zhèn)溆茫?br> 第三步，用蒸鎦水溶解標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版(a)，并將其系列稀釋為lxlO'拷貝/ pl、 lxl()8拷貝/nl、 lxlO'拷貝/pl、 lxlO'拷貝/pl、 lxl()5拷貝/nl、 1 乂104拷貝/|111、 lxl()3拷貝/Ml、 lxl()2拷貝/pl、 lxlO'拷貝/ju1,共9管 系列稀釋品，于-20'C保存?zhèn)溆茫?br> 第四步，PCR擴(kuò)增，取熒光定量反應(yīng)液(d) 12.5y 1、取PCR上游引物(e) 0.5m1、取PCR下游引物(f ) 0.5nl、取熒光探針(g) ljil、取蒸餾水8.5 pl和模板2pl，共25nl組成多個(gè)PCR反應(yīng)體系；
所述的模板為第二步獲得的cDNA、第三步獲得的系列稀釋品、陰性參控品 (b)、或者為陽(yáng)性參控品(c);
PCR擴(kuò)增時(shí)，各反應(yīng)體系中，至少需要包含5個(gè)第三步獲得的系列稀釋品、 陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)和至少1個(gè)笫二步獲得的待測(cè)樣本的cDM;
15其中系列稀釋品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，陰性參控品作為PCR反應(yīng)妁陰性對(duì)照，陽(yáng) 性參控品作為PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，以檢測(cè)PCR反應(yīng)系統(tǒng)是否正常；
第五步，使用熒光定量檢測(cè)儀對(duì)第四步獲得的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)檢測(cè)， 設(shè)置PCR的反應(yīng)條件為先95。C變性10秒；再95°C、 10秒—60t:、 30秒—95 。C、 10秒—6(TC、 30秒…設(shè)置40個(gè)循環(huán)；目的是檢測(cè)循環(huán)的CT值(即每個(gè) 反應(yīng)管內(nèi)的焚光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))；
第六步，通過(guò)比較待測(cè)樣本和系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè) 樣本的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量(見(jiàn)附圖1)，該步驟由美國(guó)BIO-RAD公司的CFX-96 熒光定量PCR檢測(cè)儀自動(dòng)完成，定量結(jié)果由該檢測(cè)儀自動(dòng)計(jì)算得出；
第七步，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)正常的情況下，即PCR反應(yīng)結(jié)束后熒光定量檢測(cè)儀 在陰性參控品管中未檢測(cè)到熒光信號(hào)，而在陽(yáng)性參控品管中檢測(cè)到> 500個(gè)拷貝 的人類(lèi)偏肺病毒，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣本的人類(lèi)偏肺病毒拷貝數(shù)，拷 貝數(shù)> 500的判定為人類(lèi)偏肺病毒感染，其佘為陰性。序列表
SEQUENCE LISTING
<110>重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
<120>人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒
<160> 4
<210> 1
<211> 1620
<212> DNA <213>偏肺病毒屬(〃"s/ /7e〃/77oi//>7ys genus.) <220>
<221> Human Metapneumovirus <400> 1
atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60
gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120
acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180
actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240
ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300
tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360
ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420
ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480
gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taaeaagaae 540
aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600
ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660
ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgcca狄atc agcaggacag 720
ataaaactaa tgttagagaa cegtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780
ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840
acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900
tgcctcctaa gagaagatea aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960
ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020
ateaatgttg ctgagcaate aagagaatgc aacatcaaca tatetacaae caactaccca 1080
tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140
ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gt幼tcgggt tggaat肌tc 1200
aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260
gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320
ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380
gatcaagtct付gaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440
ctgaacagtg cagaaaaagg aaaeactggc付cattattg taataatttt ga付gctg付 1500
cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560
acaggggc狄ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620
<210> 2 <211> 23 <212> DNA<213>人工序列 <220>
<221>PCR上游引物 <400> 2
cctttctaac atgcccacat etc 23
<210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<221>PCR下游引物 <400> 3
gctcccgtag acccctatca g 21
<210> 4 <211>24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<221>熒光探針 <400> 4
ccctttcttc gcaccatccc acgg 2權(quán)利要求
1、人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括分別包裝的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)、陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)、熒光定量反應(yīng)液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和熒光探針(g)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于還包括分別包裝的RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a )是含有插入人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核苷酸特異序列的pMD18-T載體質(zhì)粒，濃度為lxio"拷貝/pi，容積為125pl至500 nl，保存條件為-20。C;插入的人類(lèi)偏肺病毒F基因1620個(gè)核苦酸，其序列為atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtget 420ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaa狄ctga ctagtgcaat taacaagaac 540aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataea tgccaacatc agcaggacag 720ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagc紹c cgatctttgg tgtcatagat 840acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560acaggggcac etccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陰性參控品(b)是從未感染人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)抹的Vero-E6細(xì)胞株提取病毒rna并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDM容積為100 m 1至400 y 1，保存條件為-20'C。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的焚光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性參控品(c )是人類(lèi)偏肺病毒標(biāo)準(zhǔn)抹感染Vero-E6細(xì)胞林后，提取病毒RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，容積為100p 1至400m 1，保存條件為-20x:。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的熒光定量反應(yīng)液(d)是Premix Ex TaqT'試劑，容積為625 m 1至2500jj1,保存條件為-20'c。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的PCR上游引物(e)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；上游引物的濃度為10jiM、容積為25nl至100ul;保存條件為-20匸；PCR上游引物序列為5，-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3'。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的焚光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的PCR下游引物(f)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；下游引物的濃度為10nM、容積為25pl至100jil; M務(wù)降為-20";PCR下游引物序列為5，-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3，。-
9、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于..所述的熒光探針(g)是根據(jù)人類(lèi)偏肺病毒F基因設(shè)計(jì)的；焚光探針序列為5，-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3，；熒光探針的5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基因是FAM, 3，端標(biāo)記的熒光受體基因?yàn)镋clipse淬滅基團(tuán)；熒光探針的容積為50 y 1至200 y 1;保存條件為-20'C。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的RNA提取試劑(h)是QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取試劑，保存條件為室溫；所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑(i)是PrimeScript"^RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑，保存條件為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類(lèi)偏肺病毒的熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括分別包裝的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板(a)、陰性參控品(b)、陽(yáng)性參控品(c)、熒光定量反應(yīng)液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和熒光探針(g)；還包括分別包裝的RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)定量準(zhǔn)確，可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)病毒核酸；靈敏度及特異性高；檢測(cè)速度快，僅需1小時(shí)，加上核酸的提取和逆轉(zhuǎn)錄，共僅需3-4小時(shí)；步驟簡(jiǎn)單；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)。適用于人類(lèi)偏肺病毒的臨床或?qū)嶒?yàn)室定量及定性檢測(cè)，人類(lèi)偏肺病毒感染的早期診斷，監(jiān)視和預(yù)測(cè)人類(lèi)偏肺病毒流行性，以及對(duì)療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101538618SQ200910103609
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者杜麗娜, 耀 趙, 趙曉東, 昕 陳 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院