一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水生病毒檢測(cè)領(lǐng)域，特別是魚(yú)類(lèi)鯉春病毒血癥病毒的快速檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 鯉春病毒血癥（Springviraemiaofcarp，SVC)是一種以出血為主要臨床癥狀 并伴有高度傳染性的急性流行病，其病原為鯉春病毒血癥病毒（Springviraemiaofcarp virus，SVCV)。鯉春病毒血癥病毒在鯉、錦鯉、草魚(yú)、鰱、鳙、鯽等鯉科魚(yú)類(lèi)中均可導(dǎo)致明顯的 癥狀，但普通鯉魚(yú)是其最主要、最敏感的宿主，并且各個(gè)年齡段的鯉魚(yú)都能被感染。該病毒 常于春季在水溫8~20°C，尤其是13~15°C時(shí)爆發(fā)流行，水溫超過(guò)22°C時(shí)不發(fā)病。 水溫越適宜、魚(yú)體健康狀況越差越容易感染，病魚(yú)全身出血及嚴(yán)重腹水、發(fā)病急、死亡率高， 死亡率可高達(dá)90%左右，嚴(yán)重危害漁業(yè)生產(chǎn)并造成毀滅性打擊，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織OIE將其 列為必須申報(bào)的重要疫病。2008年，農(nóng)業(yè)部第1125號(hào)公告更是將該病列為"中華人民共和 國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一類(lèi)傳染病"，也是唯一一個(gè)被列為一類(lèi)傳染病的魚(yú)類(lèi)疫病，因此成為魚(yú)類(lèi)口岸 檢疫的第一類(lèi)檢疫對(duì)象。
[0003] 目前，尚缺乏有效控制鯉春病毒血癥病毒的藥物和方法。國(guó)際上通行的控制該病 的有效措施是進(jìn)行鯉春病毒血癥的監(jiān)測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行隔離或撲殺。該病的診斷主要依 賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)，因此建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。目前，鯉春病毒血癥病 毒的檢測(cè)方法包括細(xì)胞學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷三大類(lèi)。
[0004] 細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)主要是利用細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒和電鏡觀察。該類(lèi)方法操作繁瑣， 檢測(cè)周期長(zhǎng)，靈敏度低。
[0005] 免疫學(xué)診斷技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)和免疫熒光方法。該類(lèi)方法 靈敏度較高，但對(duì)抗體要求也高，已有報(bào)道表明針對(duì)鯉春病毒血癥病毒歐洲株制備的抗體 不能用于檢測(cè)亞洲株。另外，該類(lèi)方法操作也相當(dāng)繁瑣，大量樣本檢測(cè)工作量巨大。
[0006] 分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)方法以及熒光PCR方 法。目前，鯉春病毒血癥病毒檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)兩輪普通的PCR組成的套式PCR方法。 然而，傳統(tǒng)的PCR方法只能定性，不能定量，靈敏度也較低。此外，鯉春病毒血癥檢疫技術(shù)規(guī) 范SN/T1152-2011也采用了熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行鯉春病毒血癥病毒的檢測(cè)。但是，這兩 種方法所采用的擴(kuò)增引物均是針對(duì)病毒G基因進(jìn)行設(shè)計(jì)的，然而由于鯉春病毒血癥病毒是 RNA病毒，G蛋白又是病毒表面糖蛋白，G基因變異很快，基因序列的變異嚴(yán)重影響了其檢測(cè) 的準(zhǔn)確度和靈敏度，容易造成假陰性結(jié)果，導(dǎo)致誤判，最終造成疫病的進(jìn)一步擴(kuò)散。例如， 2014 上海分離株SH140503(Genebank注冊(cè)號(hào)：KR012467)和SH140522(Genebank注冊(cè)號(hào)： KR012468)利用針對(duì)G的熒光定量PCR方法均不能被有效檢測(cè)到。
[0007] 基于以上原因，設(shè)計(jì)更加靈敏可靠的檢測(cè)方法尤為重要。一方面，我們對(duì)鯉春病毒 血癥病毒基因組序列分析表明，相對(duì)于G基因，核蛋白編碼基因N在進(jìn)化上更為保守。另一 方面，彈狀病毒科狂犬病毒、水皰性口炎病毒等研究表明，它們基因組轉(zhuǎn)錄水平N>P>M>G>L， 并且依次遞減約20%-30%，因而N基因的轉(zhuǎn)錄水平高于G基因。因此，我們推測(cè)同為彈狀病 毒科成員的鯉春病毒血癥病毒中N基因的轉(zhuǎn)錄水平也高于G基因。在鯉春病毒血癥病毒感 染組織中，不僅僅存在完整的病毒粒子，也存在大量的基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而病毒粒子包裝的 基因組中N基因和G基因是等量的，因此，病毒感染組織中，N基因的總拷貝數(shù)應(yīng)大于基因 的拷貝數(shù)?；谝陨侠碚摚覀冡槍?duì)N基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)并篩選出了一對(duì)熒光定量PCR 引物和對(duì)應(yīng)的熒光探針，以便更加靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種比現(xiàn)有方法更為靈敏、準(zhǔn)確、高特異性的采用針對(duì)鯉春 病毒血癥病毒N基因的特異性引物和熒光探針，通過(guò)熒光探針或SYBRGREENI熒光染料實(shí) 時(shí)定量PCR檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟： 1) 、熒光PCR引物及探針的設(shè)計(jì)： 首先根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank上所有鯉春病毒 血癥病毒N基因序列，針對(duì)N基因的序列保守區(qū)，利用PrimerExpress3.0軟件設(shè)計(jì)特異 性的引物序列和熒光探針序列，如下： 正向引物：N-TFl:ATCAGGCCGATTATCCTTCCA; 反向引物：N-TRl:AGATAAGCAITCACATGCTGTAT; 熒光探針：N-tagl:5' -FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGACATAITGCCT-TAMRA-3'; 熒光探針的5 '端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，擴(kuò)增片 段長(zhǎng)度151bp; 2) 、病毒RNA的提取： 采用經(jīng)典的Trizol法或商業(yè)化試劑盒提取待測(cè)樣品總RNA; 3) 、反轉(zhuǎn)錄及cDNA的獲得： 反轉(zhuǎn)錄體系及條件：在200yIPCR反應(yīng)管中依次加入2yg步驟2中的待測(cè)樣品總RNA、1yl隨機(jī)六聚體引物、補(bǔ)充無(wú)RNA酶水至總體積12yl;于65。C反應(yīng)5min，立 即置于冰上，然后加入 4yI5XReactionBuffer，IyIRiboLockRNaseInhibitor，2 yl10mMdNTPMix和IylRevertAidM-MuLVRT(美國(guó)Thermo公司），25°C反應(yīng) 5min，之后42°C保溫45min獲得病毒cDNA; 4) 、熒光PCR反應(yīng)體系建立： 可以采用兩種實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系： TaqMan熒光探針?lè)ǎ涸?00yl熒光PCR反應(yīng)管中依次加入10yl2XPremixEx Taq(TAKARA公司），濃度10ymol/L的正向引物、反向引物各0.4yl，0.8yl濃度 10ymol/L的焚光探針，0.4yIROXreferencedyeII和IyIcDNA模板，置于ABI 7500Fast熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C30s;之后94°C3s、60°C 30s40個(gè)循環(huán)； SYBRGreenI熒光染料法：在200yl熒光PCR反應(yīng)管中依次加入10yl2XSYBR PremixExTaq(TAKARA公司），濃度 10ymol/L正向引物、反向引物各 0.4yl，0.4yl ROXreferencedyeII和IylcDNA模板，置于7500Fast熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)條件為95°C30s;之后95°C5s、60°C30s、72°C30s40個(gè)循環(huán)，結(jié)束后， 立即由儀器進(jìn)行熔解曲線分析，最后通過(guò)ABI7500 2. 0.6軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值； 5 )、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 為了準(zhǔn)確定量樣本中病毒的拷貝數(shù)，制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線；首先設(shè)計(jì)N基因的正向引物和反向引物，擴(kuò)增鯉春病毒血癥病毒SVCV-265株基 因組得到1261bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，按照經(jīng)典的分子克隆操作方法，將其連接到pMD18-T載體 上，命名為pMD/SVCV-N，篩選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒DNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，即 為標(biāo)準(zhǔn)品；將其進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)筮M(jìn)行TaqMan熒光PCR反應(yīng)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和 Ct值，儀器軟件會(huì)自動(dòng)繪制出熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線； 6 )、檢測(cè)結(jié)果判定： 利用熒光定量PCR反應(yīng)收集熒光信號(hào)，再利用儀器軟件處理數(shù)據(jù)，得到擴(kuò)增曲線、熔解 曲線、Ct值、Tm值；以標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度對(duì)應(yīng)的Ct值作為檢測(cè)下限，以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的Tm值作 為SYBRGREENI熒光染料法判定依據(jù)。
[0010] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)GenBank中所有鯉春病毒血癥病毒基因組序列進(jìn)行進(jìn)化分析以及 各基因的突變速率計(jì)算，建立了針對(duì)鯉春病毒血癥病毒N基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法，設(shè) 計(jì)并篩選了一對(duì)引物及探針，與已有的針對(duì)G基因的熒光定量PCR方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā) 明具有更加靈敏、準(zhǔn)確、高特異性的特點(diǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：