專利名稱：鯉春病毒血癥病毒(svcv)的rt-lamp檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的檢測(cè)方法，具體涉及一種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp, SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(SVCV)感染鯉科魚后弓I起的一種急性、出血性傳染性疾病。以全身出血及腹水、發(fā)病急、死亡率高為特征。常在鯉科魚特別是在鯉魚中流行，常于春季暴發(fā)并引起幼魚和成魚死亡。該病最初在歐洲報(bào)道，后主要在歐洲的鯉魚養(yǎng)殖中廣泛傳播，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定需要向OIE申報(bào)的疾病之一。在我國(guó)也被列為《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中的二類動(dòng)物疫病。
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在水生動(dòng)物的國(guó)際貿(mào)易方面，鯉春病毒血癥病毒一直是嚴(yán)重影響我國(guó)觀賞魚出口的一種貿(mào)易壁壘。早在上個(gè)世紀(jì)，英國(guó)政府宣稱我們的一批觀賞魚中含有鯉春病毒，于是禁止我們對(duì)其出口，要求我們所有出口觀賞魚飼養(yǎng)場(chǎng)進(jìn)行SVC的檢測(cè)與凈化后才能對(duì)其出口。隨后，中國(guó)觀賞魚出口的傳統(tǒng)市場(chǎng)法國(guó)、意大利、西班牙、比利時(shí)、日本和新加坡等國(guó)相繼提出了類似要求。這對(duì)國(guó)家創(chuàng)匯帶來巨大損失。2002年美國(guó)爆發(fā)兩次鯉春病毒血癥病毒疫病，經(jīng)OIE參考實(shí)驗(yàn)室鑒定，證明該病毒株與1998年英國(guó)從中國(guó)進(jìn)口的金魚中分離到的SVC病毒株一致，它被稱之為“中國(guó)株”。此舉直接把美國(guó)SVC病毒株的來源指向中國(guó)，對(duì)中國(guó)活魚尤其是觀賞魚的出口構(gòu)成了重大威脅。鯉春病毒血癥病毒(SVCV),又名鯉彈狀病毒,屬?gòu)棤畈《究?Rhabdoriridae),水泡病毒屬(Vesiculorirus)。病毒粒子90nnTl80nm,寬60nnT90nm,有類脂囊膜，核衣殼中空，螺旋狀對(duì)稱，直徑50nm。病毒基因組為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA，長(zhǎng)約11019個(gè)核苷酸，主要包含5個(gè)基因。病毒粒子浮力密度在CsCl中為1. 195δ/πιΓ . 200g/ml，在15%飛0%的蔗糖溶液中為1. 16g/ml，在5°/Γ25%的蔗糖梯度中沉降系數(shù)為38iT40S。病毒的抵抗力不強(qiáng)，感染性受環(huán)境因子的影響較大，對(duì)酸、熱及脂溶劑敏感，PH值Γ10時(shí)穩(wěn)定，在13°C 22°C均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為17°C。與其他魚類彈狀病毒感染不一樣，SVCV主要危害越冬以后的幼鯉和一齡以上的鯉魚，死亡率較高。低水溫期，由于鯉魚免疫力降低，容易大面積流行、暴發(fā)鯉春病毒病。感染途徑是以水體為媒介，通過鰓進(jìn)入魚體，再通過糞、尿排出體外。外傷也是一個(gè)重要的傳播途徑。無癥狀的帶毒魚體能持續(xù)數(shù)周不斷地排出病毒，在低水溫時(shí)病毒能在被感染的鯉魚血液中保持11周之久，即呈現(xiàn)持續(xù)性的病毒血癥時(shí)期。鯉春病毒血癥病毒破壞魚體內(nèi)的水鹽平衡，鯉魚急性感染時(shí)，在臨床上表現(xiàn)為病魚無目的的漂游，體發(fā)黑，腹部腫大。皮膚和鰓滲血，無外部潰瘍及其他細(xì)菌病癥狀。消化道出血，可見到腹水嚴(yán)重帶血；腸炎、心、腎、鰾有時(shí)連同肌肉也出血，內(nèi)臟水腫。肝部血管有血管炎及水腫。最后導(dǎo)致血管壞死，肝實(shí)質(zhì)也多處壞死。當(dāng)病魚出現(xiàn)這種顯性感染時(shí)，其腎、脾、腮、腦中會(huì)含有大量病毒。但有文獻(xiàn)報(bào)道，在魚腦組織中最易檢測(cè)出病毒。當(dāng)面對(duì)的是無臨床癥狀的魚時(shí)，由于無法確定該魚類是否感染SVCV，是處于感染的那個(gè)階段，無法確認(rèn)那個(gè)組織最有可能含有病毒，因此，在剖取魚組織臟器時(shí)需要將腎臟、肝臟、脾臟和腦等4個(gè)組織器官都采到樣品，以保證無論魚正處于哪個(gè)感染階段都能被檢測(cè)到病毒。培養(yǎng)分離鯉春病毒血癥病毒一般需要15天以上才能得出結(jié)果，檢測(cè)周期太長(zhǎng)，不適應(yīng)口岸快速檢測(cè)和大通關(guān)的時(shí)代要求。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、高通量且對(duì)儀器要求不高的的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法成為目前急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種鯉春病毒血癥病毒的RT-LAMP檢測(cè)引物組。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種鯉春病毒血癥病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供鯉春病毒血癥病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)引物組，包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示
SVCV-F3 TGGCAACCTGTAATTCAG`C (SEQ ID N0:1)；
SVCV-B3 CACGGTCTCATCTGTGATC (SEQ ID N0:2)；
SVCV-FIP GGTCCGTACCATCTGTAATCACATCTCCATCTGTCTTCAGTACA (SEQ ID NO:3);SVCV-BIP GGCATCTGTCACAACAGTGTCAATCCAGTGTCCTCCGTAC (SEQ ID N0:4)；
SVCV-LF CATGGCAGATCCATCCAGAA (SEQ ID NO:5);
SVCV-LB CCCATTCTGTTCATTTGGAGC (SEQ ID NO:6)。一種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組。一種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分(I)權(quán)利要求I所述的引物組；(2)逆轉(zhuǎn)錄酶；(3) DNA聚合酶；(4) RT-LAMP反應(yīng)液；(5)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。上述檢測(cè)試劑盒，其引物組中外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為1 8 :4。上述檢測(cè)試劑盒,所述DNA聚合酶為DNA聚合酶；所述逆轉(zhuǎn)錄酶為逆轉(zhuǎn)錄酶。上述檢測(cè)試劑盒，所述RT-LAMP反應(yīng)液含有IOmM dNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8 :5 :2。上述檢測(cè)試劑盒，所述陽性對(duì)照為含有鯉春病毒血癥病毒(SVCV)囊膜糖蛋白基因片段的T載體克隆，陰性對(duì)照為DEPC水。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中還可以含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYBR Green
Io利用上述的試劑盒檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的方法，包括如下步驟 Cl)待檢樣品RNA的提取采用病毒RNA提取試劑盒提取樣品RNA ；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)25μ I反應(yīng)體系含有SVCV-F3 O. 2 μ M, SVCV-B3 O. 2 μ Μ,SVCV-FIP1. 6 μ M, SVCV-BIP1. 6 μ Μ, SVCV-LF O. 8 μ Μ, SVCV-LB O. 8 μ Μ, RT-LAMP 反應(yīng)液12. 5 μ 1，逆轉(zhuǎn)錄酶IU’ DNA聚合酶8U，待檢RNA I lOOng，用DEPC水補(bǔ)齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C 持續(xù) 2min ；
(3)結(jié)果判斷通過觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果。在試劑盒中含有顯色劑的情況下，往反應(yīng)管中加入10XSYBR Green I O. 5μ 1，然后將反應(yīng)管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根據(jù)儀器所實(shí)時(shí)讀取的熒光信號(hào)來判斷擴(kuò)
增結(jié)果。本發(fā)明具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等有益效果
(1)快速高效整個(gè)擴(kuò)增只用60 90min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9 101°個(gè)拷貝；
(2)操作簡(jiǎn)便不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測(cè)，條件比較溫和；
(3)高特異性
本發(fā)明根據(jù)鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的囊膜糖蛋白基因G基因，GenBank登錄號(hào)為AY527273.1)設(shè)計(jì)了六條特異性引物，應(yīng)用上述六條引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)域，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行；
(4)聞靈敏度最低檢測(cè)極限可達(dá)到2.4pg/反應(yīng)；
(5)鑒定簡(jiǎn)便可通過觀察加入SYBRGreen I顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉淀來判斷擴(kuò)增與否，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。


圖1是實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果圖(1、2 =DEPC水對(duì)照；3、4 SVCV RNA ;5、6 VHSV RNA ;7、8 IHNV RNA)；
圖2是實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果圖(1、2 :DEPC水對(duì)照；3、4 HRV RNA ;5、6 =PFRVRNA ;7、8 SVCV RNA)；
圖3是實(shí)施例5的檢測(cè)結(jié)果圖(SVCV RNA, I 10°倍稀釋；2 :101倍稀釋；3 102倍稀釋；4 :103倍稀釋；5 :104倍稀釋；6 :105倍稀釋；7 :106倍稀釋；8 :DEPC水對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒的建立
鯉春魚病毒血癥病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

(I)RT-LAMP引物設(shè)計(jì)以鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的囊膜糖蛋白基因(^斤G基因，GenBank登錄號(hào)為AY527273.1)為靶基因，利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorerversion4(http://primerexplorer. jp/e)進(jìn)行 LAMP 引物的設(shè)計(jì)。引物序列見表 I。
權(quán)利要求
1.一種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)引物組,包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示SVCV-F3 TGGCAACCTGTAATTCAGC (SEQ ID N0:1)；SVCV-B3 CACGGTCTCATCTGTGATC (SEQ ID N0:2)；SVCV-FIP GGTCCGTACCATCTGTAATCACATCTCCATCTGTCTTCAGTACA (SEQ ID NO:3);SVCV-BIP GGCATCTGTCACAACAGTGTCAATCCAGTGTCCTCCGTAC (SEQ ID N0:4)；SVCV-LF CATGGCAGATCCATCCAGAA (SEQ ID NO:5);SVCV-LB CCCATTCTGTTCATTTGGAGC (SEQ ID NO:6)。
2.—種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，檢測(cè)試劑盒包括權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下成分(I)權(quán)利要求1所述的引物組；(2)逆轉(zhuǎn)錄酶；(3) DNA聚合酶；(4)RT-LAMP反應(yīng)液；(5)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為1 8 :4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶為DNA聚合酶；所述逆轉(zhuǎn)錄酶為逆轉(zhuǎn)錄酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述RT-LAMP反應(yīng)液含有10mM dNTPUO X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，二者的體積比是8 5 :2。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于陽性對(duì)照為含有鯉春病毒血癥病毒(SVCV)囊膜糖蛋白基因片段的T載體克隆，陰性對(duì)照為DEPC水。
8.利用權(quán)利要求2 7任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的方法，包括如下步驟 (1)待檢樣品RNA的提取采用病毒RNA提取試劑盒提取樣品RNA； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng):25iil反應(yīng)體系含有SVCV-F30. 2 u M, SVCV-B3 0. 2 u M,SVCV-FIP1. 6 uM, SVCV-BIP1. 6uM, SVCV-LF 0. 8 u M, SVCV-LB 0. 8 u M, LAMP 反應(yīng)液12. 5 iil，逆轉(zhuǎn)錄酶1U，DNA聚合酶8U，待檢RNA I lOOng，用DEPC水補(bǔ)齊到25 yl ;設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù) 2min ； (3)結(jié)果判斷通過觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于還含有顯色劑SYBRGreenIo
10.利用權(quán)利要求9所述的試劑盒檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的方法，包括如下步驟 (1)待檢樣品RNA的提取采用病毒RNA提取試劑盒提取純化樣品RNA； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)25iU反應(yīng)體系含有SVCV-F30. 2 u M, SVCV-B3 0. 2 u M,SVCV-FIP1. 6 uM, SVCV-BIP1. 6uM, SVCV-LF 0. 8 u M, SVCV-LB 0. 8 u M, RT-LAMP 反應(yīng)液.12. 5 μ 1，逆轉(zhuǎn)錄酶 1U，DNA 聚合酶 8U，10 X SYBR Green I 0·5μ1，待檢 RNA I lOOng，用DEPC水補(bǔ)齊到25μ I ;設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65° C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ； (3)結(jié)果判斷將上述反應(yīng)管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根據(jù)儀器實(shí)時(shí)讀取的熒光信號(hào)來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的RT-LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。檢測(cè)引物組包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物；檢測(cè)試劑盒包括引物液、反應(yīng)液、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和對(duì)照；試劑盒還可以有顯色劑。其檢測(cè)方法是通過提取待檢病毒RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性，采用六條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63～65℃對(duì)樣品RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，可檢測(cè)到純病毒RNA的pg級(jí)，其鑒定采用加入SYBRGreenIESE-Quant-tubeScanner儀器檢測(cè)或者利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化判斷擴(kuò)增與否，確定待檢樣品是否含有鯉春病毒血癥病毒RNA。本發(fā)明具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/93GK103045759SQ201210514699
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者李紅梅, 石磊, 唐大運(yùn), 常彥磊, 袁忠, 張璜 申請(qǐng)人:廣州迪澳生物科技有限公司